TIÊU CHUẨN VIỆT NAM
TCVN 6189-1:1996
CHẤT LƯỢNG NƯỚC - PHÁT HIỆN VÀ ĐẾM LIÊN CẦU PHÂN - PHẦN 1: PHƯƠNG PHÁP TĂNG SINH TRONG MÔI TRƯỜNG CẤY LỎNG
Water quality – Detection and enumeration of faecal streptococci - Part 1: Method by enrichment in a liquid medium
1. Phạm vi áp dụng
Tiêu chuẩn này qui định phương pháp chuẩn để phát hiện và đếm liên cầu phân trong nước bằng cách tăng sinh trong môi trường cấy lỏng.
2. Lĩnh vực áp dụng
Phương pháp này có thể áp dụng được đối với mọi loại nước, kể cả nước đục.
3. Tiêu chuẩn trích dẫn
ISO 5667 Chất lượng nước - Lấy mẫu - Phần 1: Hướng dẫn các phương án lấy mẫu.
TCVN 5992 : 1995 (ISO 5662 – 2) Chất lượng nước - Lấy mẫu - Hướng dẫn các kỹ thuật lấy mẫu.
TCVN 5993 : 1995 (ISO 5662 – 3) Chất lượng nước - Lấy mẫu - Hướng dẫn vận chuyển và xử lý mẫu.
4. Định nghĩa
Liên cầu phân: Là các vi khuẩn cho phản ứng dương tính với các môi trường (6.2.1 và 6.2.2) được qui định trong tiêu chuẩn và cho phản ứng âm tính trong phép thử, catalaza.
5. Nguyên tắc và các phản ứng
Việc xác định liên cầu phân trong một thể tích xác định của một mẫu thử cần qua hai bước sau:
5.1. Nuôi cấy tăng sinh
Nuôi cấy mẫu thử trong môi trường lỏng chọn lọc canh thang glucoza - nitrua trong 44 h ± 4 h ở 35oC hoặc 37oC. Liên cầu phân sinh trưởng trong môi trường này và làm lên men glucoza kèm theo việc hình thành axit là nguyên nhân làm biến đổi màu của chỉ thị pH từ tía sang vàng.
5.2. Khẳng định.
Tất cả các ống tăng sinh cho phản ứng dương tính sau 24 h hoặc 48 h sẽ được nuôi cấy tiếp trên môi trường khẳng định để loại trừ các phản ứng dương tính giả như phản ứng của các loại trực khuẩn và cầu khuẩn Gram dương khác. Môi trường khẳng định, thạch mật - aesculin - nitrua, sau đó được nuôi cấy ở 44oC trong 48 h. Liên cầu phân sinh trưởng trong môi trường này và thủy phân aesculin; sản phẩm cuối; 6,7-hidroxycoumarin kết hợp với ion Fe(III) để tạo thành một hợp chất màu nâu vàng tới đen khuyếch tán vào môi trường. Ngoài ra, tiến hành phép thử catalaza đối với các khuẩn lạc nghi ngờ trong môi trường khẳng định. Các khuẩn lạc cho phản ứng aesculin dương tính và catalaza âm tính có thể được xem là liên cầu phân.
6. Môi trường nuôi cấy và thuốc thử
Cảnh báo – Tất cả các môi trường chọn lọc được mô tả trong phần này của tiêu chuẩn đều chứa natri nitrua. Vì chất này cực độc và có tính gây đột biến, phải thận trọng để tránh tiếp xúc với nó, đặc biệt tránh hút phải các bụi nhỏ trong khi pha chế các môi trường hoàn chỉnh khô dạng thương phẩm. Các môi trường có chứa nitrua không được trộn lẫn với các axit vô cơ mạnh, vì có thể tạo ra chất hydro-nitrua (HN3). Các dung dịch có chứa nitrua cũng có thể hình thành các chất gây nổ khi tiếp xúc với các ống dẫn bằng kim loại, ví dụ: các ống dẫn bằng kim loại trong các bồn rửa.
6.1. Các nguyên vật liệu cơ bản
Để cho các kết quả được đồng nhất, khi pha chế các môi trường cần sử dụng các thành phần cùng mức chất lượng và các hóa chất thuộc loại dùng cho phân tích, hoặc một môi trường hoàn chỉnh khô. Natri nitrua sẽ phân hủy theo thời gian, vì vậy các môi trường khô chỉ có một thời hạn sử dụng nhất định.
Chỉ sử dụng nước cất hoặc nước có độ tinh khiết tương đương.
6.2. Các môi trường nuôi cấy
6.2.1. Canh thang glucoza (nồng độ đơn)
cao thịt bò | 4,5 g |
tripton | 15,0 g |
glucoza | 7,5 g |
natri clorua (NaCl) | 7,5 g |
natri nitrua (NaN3) | 0,2 g |
Bromocresol tía (dung dịch 15g/l trong cồn etanol) | 1 ml |
nước vừa đủ | 1000 ml |
Đun sôi để hòa tan các thành phần trong nước.
Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng sẽ là 7,2 ± 0,1 ở 25oC.
Phân phối vào các ống nghiệm, mỗi ống 10 ml môi trường.
Khử trùng môi trường này trong 15 phút ở 121oC ± 1oC.
Chú thích - Để kiểm tra các mẫu nước với lượng nhiều hơn 1 ml, cần chuẩn bị môi trường canh thang nồng độ kép có các thể tích bằng thể tích của mẫu thử.
6.2.2. Môi trường thạch mật- aesculin-nitrua
tripton | 17,0 g |
pepton | 3,0 g |
cao men | 5,0 g |
mật bò khô | 10,0 g |
natri clorua (NaCl) | 5,0 g |
aesculin | 1,0 g |
amoni sắt (III) xitrat | 0,5 g |
natri nitrua (NaN3) | 0,15 g |
thạch | từ 12 g đến 20 g (theo chỉ dẫn của nhà sản xuất) |
nước vừa đủ | 1000 ml |
Hòa tan các thành phần trên trong nước bằng cách đun sôi.
Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng, pH sẽ là 7,2 ± 0,1 ở 25 °C.
Phân phối vào các bình chứa cho phù hợp.
Khử trùng trong 15 phút ở 121 °C ± 1 °C.
Làm nguội đến 50 °C tới 60 °C và rót vào các hộp Petri để có được dộ dày môi trường ít nhất là 3mm và để yên trên một mặt phẳng ngang, chỗ mát.
6.3. Dung dịch hydro peroxit (oxi già) 30 g/l.
7. Thiết bị
Các thiết bị thông thường của phòng thí nghiệm vi sinh vật, và:
7.1. Tủ ấm, có thể duy trì nhiệt độ ở 35oC ± 1oC hoặc 37oC ± 1oC
7.2. Tủ ấm, có thể duy trì nhiệt độ ở 44oC ± 0,5oC
7.3. Nồi hấp áp lực, có thể duy trì nhiệt độ ở 121oC ± 1oC
8. Lấy mẫu
Xem ISO 5667-1, TCVN 5992:1995 (ISO 5662 – 2) và TCVN 5993 : 1995 (ISO 5662 – 3 ).
9. Cách tiến hành
9.1. Xử lý mẫu
Các qui trình chung, như xử lý mẫu và chuẩn bị các dung dịch pha loãng sẽ được xây dựng thành tiêu chuẩn trong thời gian tới.
9.2. Tăng sinh
Cho 1 ml mẫu (hoặc mẫu pha loãng) vào 10ml canh thang glucoza-nitrua (6.2.1) và trộn kỹ.
Các lượng mẫu lớn hơn 1 ml cần cho vào canh thang nồng độ kép với cùng thể tích
Nuôi ấm ở 35oC ± 1oC hoặc 37oC ± 1oC trong 22h ± 2 h.
Coi tất cả các ống nghiệm có xuất hiện màu vàng (ở toàn bộ ống hay chỉ ở thành phần dưới ống) là cho phản ứng dương tính, nuôi ấm lại các ống nghiệm âm tính trong một khoảng thời gian 22h ± 2 h nữa.
Sau giai đoạn nuôi ấm này, thậm chí sự chuyển màu yếu thành màu đỏ nhạt cũng được coi là dấu hiệu của sự tạo thành axit. Để rõ ràng cần so sánh với màu của ống môi trường không cấy mẫu thử.
Để có kết quả định lượng, cần sử dụng phương pháp “số có xác xuất cao nhất” (MNP).
9.3. Khẳng định
Khẳng định mỗi ống cấy tăng sinh có biểu hiện sinh axit như sau:
Lấy một vòng que cấy từ ống canh thang tăng sinh nghi ngờ, cấy ria lên một đĩa thạch mật-aesculin-nitrua (6.2.2).
Nuôi trong tủ ấm ở 44oC ± 0,5oC trong 44 h ± 4 h.
Tất cả các đĩa cho thấy các khuẩn lạc có màu từ nâu tới đen và/hoặc có màu nâu hay đen ở phần môi trường xung quanh được coi là phản ứng dương tính.
9.4. Phép thử catalaza
Nhỏ một giọt dung dịch oxi già (hydro peroxit) (6.3) lên khuẩn lạc trên môi trường thạch mật-aesculin-nitrua.
Việc xuất hiện bọt nhỏ oxi chứng tỏ là các sinh vật cho phản ứng catalaza dương tính. Chỉ có các khuẩn lạc catalaza âm tính mới được coi là liên cầu phân.
Chú thích - Để loại trừ các sai lầm do các phản ứng catalaza âm tính giả có thể xảy ra trên môi trường thạch mật-aesculin-nitrua, phép thử này có thể làm lại trên một mẫu cấy truyền lên một môi trường không chọn lọc khác.
10. Biểu thị kết quả
Sự mô tả chung về cách trình bày kết quả và cách tính toán số có xác suất lớn nhất sẽ được xây dựng thành tiêu chuẩn trong thời gian tới.
11. Báo cáo kết quả
Báo cáo kết quả sẽ bao gồm các thông tin sau:
a) tham khảo tiêu chuẩn này;
b) mọi chi tiết cần thiết đối với sự nhận biết đầy đủ về mẫu thử;
c) phương pháp khẳng định được dùng;
d) các kết quả như đã nêu ở mục 10 tính theo số có xác xuất lớn nhất của liên cầu phân trong thể tích mẫu thử.