Lời nói đầu
\r\n\r\nTCVN 8545:2010 hoàn toàn tương đương với ISO\r\n14183:2005;
\r\n\r\nTCVN 8545:2010 do Cục Chăn nuôi biên soạn, Bộ\r\nNông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất\r\nlượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.
\r\n\r\n\r\n\r\n
Tiêu chuẩn này quy định phương pháp sắc kí\r\nlỏng hiệu năng cao (HPLC) để xác định hàm lượng monensin, narasin và\r\nsalinomycin trong thức ăn chăn nuôi, nguyên liệu bổ sung (dạng khô và lỏng) và\r\ncác premix khoáng. Phương pháp này không áp dụng đối với các premix thuốc (dược\r\nphẩm). Phương pháp này không áp dụng để xác định lasalocid và semduramicin.
\r\n\r\nGiới hạn định lượng đối với monensin, narasin\r\nvà salinomycin tương ứng khoảng 1mg/kg, 2mg/kg và 2 mg/kg. Giới hạn định lượng\r\nthấp hơn cũng có thể đạt được nhưng phải được thẩm định bởi người sử dụng.
\r\n\r\n\r\n\r\nCác tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho\r\nviệc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì\r\náp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố\r\nthì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).
\r\n\r\nTCVN 6952:2001 (ISO 6498:1998) Thức ăn\r\nchăn nuôi – Chuẩn bị mẫu thử.
\r\n\r\n\r\n\r\nCác thể mang ion (ionophore) monensin,\r\nnarasin và salinomycin được chiết với hỗn hợp metanol/nước (90 + 10) bằng máy\r\nlắc trong 1 h, sau đó dịch chiết được lọc. Các thể mang ion được xác định bằng\r\nsắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) pha đảo sử dụng dẫn xuất sau cột với vanilin\r\nvà phát hiện ở bước sóng 520 mm. Các mẫu dương tính nghi ngờ ở mức vết và các\r\nmẫu thức ăn chăn nuôi bổ sung thuốc thú y có chứa các thể mang ion không dự\r\nkiến được khẳng định bằng cách chiết với hexan hoặc tạo dẫn xuất sau cột với\r\ndimetylaminobenzaldehyt (DMAB).
\r\n\r\n\r\n\r\nChỉ sử dụng các thuốc thử tinh khiết phân\r\ntích, trừ khi có quy định khác.
\r\n\r\n4.1. Nước, loại dùng cho HPLC hoặc tương\r\nđương (ví dụ nước siêu sạch Milli-Q).
\r\n\r\n4.2. Metanol
4.3. Axit sulfuric
4.4. Axit axetic
4.5. Natri hydrocacbonat
4.6. Vanilin
4.7. Dimetylaminobenzaldehyt
4.8. Hexan [CH3(CH2)4CH3],\r\nđược cất bằng dụng cụ thủy tinh.
\r\n\r\n4.9. Dung môi chiết,
Trộn 1 800 ml metanol (4.2) và 200 ml nước\r\n(4.1) trong bình 2 lít, trộn đều.
\r\n\r\n4.10. Pha động
\r\n\r\n4.10.1. Hệ thống phản ứng sau cột
\r\n\r\nVừa khuấy và thêm từ từ bằng pipet 20 ml axit\r\nsulfuric (4.3) vào 950 ml metanol (4.2). Để nguội, vừa khuấy vừa thêm 30 g\r\nvanilin (4.6). Bảo quản tránh ánh sáng. Chuẩn bị mới trong ngày sử dụng.
\r\n\r\n4.10.2. Cột HPLC
\r\n\r\nHỗn hợp metanol (4.2)/nước (4.1)/axit axetic\r\n(4.4) (940 : 60 : 1). Lọc bằng chân không với hệ thống nêu trong 5.7.
\r\n\r\n4.11. Metanol trung tính
\r\n\r\nThêm 1,0 g natri hydrocacbonat (4.5) vào 4\r\nlít metanol (4.2). Trộn đều và lọc qua giấy lọc 11
4.12. Chất chuẩn
\r\n\r\nThành phần hoặc nồng độ của từng lô chất\r\nchuẩn cần được biết.
\r\n\r\n4.12.1. Natri monensin
4.12.2. Narasin
4.12.3. Natri salinomycin
CẢNH BÁO: Tránh bị hít vào hoặc tiếp xúc với\r\ncác chất chuẩn và dung dịch chuẩn có độc tính. Luôn làm việc trong tủ hút khói\r\nkhi xử lí các loại dung môi và dung dịch thuốc thử. Mang kính an toàn và quần\r\náo bảo hộ.
\r\n\r\n4.13. Các dung dịch chuẩn gốc ionophore,
Cân 25 mg mỗi loại chất chuẩn (từ 4.12.1 đến\r\n4.12.3), chính xác đến 0,1 mg, vào các bình định mức 50 ml. Hòa tan bằng\r\nmetanol trung tính (4.11) và định mức đến vạch. Chuẩn bị mới dung dịch chuẩn\r\ngốc hàng tháng. Bảo quản trong tủ lạnh.
\r\n\r\nBảo quản các dung dịch chuẩn tránh sáng hoặc\r\nchuẩn bị trong các bình thủy tinh sẫm màu.
\r\n\r\nCHÚ THÍCH: Việc sử dụng metanol trung tính\r\nchưa được xác nhận đối với salinomycin. Nếu chỉ phân tích riêng monensin thì\r\nkhông yêu cầu, nhưng là bắt buộc nếu phân tích narasin.
\r\n\r\n4.13.1. Dung dịch chuẩn gốc monensin
\r\n\r\nChuẩn bị dung dịch chuẩn gốc monensin theo\r\n4.13. Tính nồng độ dung dịch chuẩn gốc dựa vào thành phần chính monensin A.\r\nThành phần phụ monensin B trong mẫu thử, được rửa giải ngay trước khi rửa giải\r\nmonensin A [4], được xác định dựa vào monensin A. Sử dụng thành phần\r\nđã nhận biết của chuẩn dựa theo chứng chỉ kèm theo và tính theo công thức:
\r\n\r\npM =
Trong đó:
\r\n\r\n0,5 là nồng độ của dung dịch chuẩn gốc\r\n(4.13), tính bằng miligam trên mililít (mg/ml), được xác định đến ba chữ số có\r\nnghĩa;
\r\n\r\n![](\"00903126_files/image003.gif\"){kind=small}
VÍ DỤ Lô chất chuẩn RS0234 chứa 93,71 %\r\nmonensin A, tính theo khối lượng.
\r\n\r\n4.13.2. Dung dịch chuẩn gốc salinomycin
\r\n\r\nChuẩn bị dung dịch chuẩn gốc theo 4.13. Tính\r\nnồng độ chuẩn gốc dựa vào nồng độ của chuẩn đối chứng của nhà cung cấp đưa ra [2]:
\r\n\r\nTrong đó:
\r\n\r\nw là hàm lượng của chất chuẩn salinomycin do\r\nnhà cung cấp đưa ra, tính bằng microgam trên miligam (![](\"00903126_files/image007.gif\"){kind=small}
).
VÍ DỤ Đối với lô WS-19B, hàm lượng chất chuẩn\r\nlà 986 m
4.13.3. Dung dịch chuẩn gốc narasin
\r\n\r\nChuẩn bị dung dịch chuẩn gốc theo 4.13. Tính\r\nnồng độ chuẩn gốc dựa vào thành phần chính là narasin A. Những thành phần phụ\r\n(narasin D và l), được rửa giải sau narasin A [5], được xác định dựa\r\nvào chuẩn narasin A. Sử dụng thành phần của chuẩn đã biết dựa vào chứng chỉ kèm\r\ntheo và tính theo công thức.
\r\n\r\nTrong đó:
\r\n\r\nPN là nồng độ của narasin A trong\r\ndung dịch chuẩn gốc, tính bằng miligam trên mililít (mg/ml);
\r\n\r\nSN là tỉ lệ của narasin A trong\r\nchất chuẩn đối chứng nêu trong chứng chỉ kèm theo, tính bằng phần trăm (%).
\r\n\r\nVÍ DỤ Đối với lô chất chuẩn RS0234, tỷ lệ phần trăm\r\nmỗi thành phần tính theo khối lượng là:
\r\n\r\nNarasin A = 85,4 %
\r\n\r\nNarasin D = 1,9 %
\r\n\r\nNarasin l = 0,7 %
\r\n\r\n4.14. Dung dịch hỗn hợp chuẩn trung gian,\r\nchứa monensin, salinomycin và narasin tương ứng ![](\"00903126_files/image009.gif\"){kind=small}
và\r\n40 .
Dùng pipet lấy 10,0 ml, 20,0 ml và 20,0 ml\r\ncác dung dịch chuẩn gốc monensin, salinomycin và narasin (4.13) tương ứng cho\r\nvào bình định mức 250 ml. Pha loãng đến vạch bằng dung môi chiết (4.9). Trộn\r\nđều. Chuẩn bị dung dịch để sử dụng trong tháng.
\r\n\r\n4.15. Dung dịch hỗn hợp chuẩn cho HPLC
\r\n\r\nChuẩn bị một dãy gồm 5 dung dịch hỗn hợp\r\nchuẩn HPLC bằng cách dùng pipet lấy các thể tích hỗn hợp chuẩn trung gian\r\n(4.14) vào bình định mức sẫm màu dung tích 100 ml và pha loãng đến vạch bằng\r\ndung môi chiết (4.9), như quy định trong Bảng 1. Trộn đều. Chuẩn bị dung dịch\r\nđể sử dụng trong tháng.
\r\n\r\n| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n
| \r\n ||
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n ||
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
4.16. Các chuẩn riêng rẽ dùng cho HPLC
\r\n\r\n4.16.1. Monensin,.
Dùng pipet lấy chính xác 1,0 ml dung dịch\r\nchuẩn gốc monensin (4.13.1) vào bình định mức 100ml sẫm màu. Pha loãng đến vạch\r\nbằng dung môi chiết (4.9). Trộn đều. Chuẩn bị dung dịch để sử dụng trong tháng.\r\nBảo quản trong tủ lạnh.
\r\n\r\n4.16.2. Salinomycin,.
Dùng pipet lấy chính xác 2,0 ml dung dịch\r\nchuẩn gốc salinomycin (4.13.2) vào bình định mức 100ml sẫm màu. Pha loãng đến\r\nvạch bằng dung môi chiết (4.9). Trộn đều. Chuẩn bị dung dịch để sử dụng trong\r\ntháng. Bảo quản trong tủ lạnh.
\r\n\r\n4.16.3. Narasin,
Dùng pipet lấy chính xác 2,0 ml dung dịch\r\nchuẩn gốc narasin (4.13.3) vào bình định mức 100 ml sẫm màu. Pha loãng đến vạch\r\nbằng dung môi chiết (4.9). Trộn đều. Chuẩn bị dung dịch để sử dụng trong tháng.\r\nBảo quản trong tủ lạnh.
\r\n\r\n\r\n\r\nSử dụng các thiết bị, dụng cụ phòng thử\r\nnghiệm thông thường và các thiết bị, dụng cụ cụ thể sau:
\r\n\r\n5.1. Hệ thống HPLC,
5.1.1. Bơm, đã khử xung, tốc độ dòng từ\r\n0,1ml/min đến 2,0 ml/min.
\r\n\r\n5.1.2. Bộ phận bơm mẫu, ![](\"00903126_files/image010.gif\")
mẫu.
5.1.3. Detector UV/VIS,
5.1.4. Bộ tích phân,
5.1.5. Bộ phận phản ứng sau cột,
Cuộn dây phản ứng có thể mua sẵn hoặc làm\r\nbằng ống loại 316 SS, đường kính trong 0,5 mm, chiều dài từ 7,5 m đến 10 m,\r\ncuộn lại cho vừa với buồng gia nhiệt. Ví dụ, có thể cuộn ống phản ứng trong\r\ngiấy nhôm để vừa khít vào bộ phận gia nhiệt và truyền nhiệt tốt. Loại cuộn dây\r\nchế tạo sẵn thường được ưa dùng. Để đảm bảo các loại thuốc thử trộn lẫn tốt với\r\nnhau, sử dụng máy lắc trộn hoặc đầu nối trộn tĩnh (không phải dạng nối trộn\r\nthông thường) phía trước cuộn dây phản ứng.
\r\n\r\n5.1.6. Bơm thuốc thử sau cột,
5.1.7. Cột phân tích.
\r\n\r\nCHÚ THÍCH: Các loại cột C18 5
5.1.8. Cột bảo vệ, C18.
\r\n\r\n5.2. Thiết bị thổi khí bằng nitơ,
5.3. Máy lắc,
5.4. Cân: Cân phân tích có thể cân 10 g hoặc lớn\r\nhơn với độ chính xác 0,1 mg và cân có thể cân 100 g hoặc lớn hơn với độ chính\r\nxác 0,01 g.
\r\n\r\n5.5. Bình nón
5.6. Giấy lọc,
5.7. Bộ lọc dung môi,
5.8. Bộ lọc mẫu,
5.9. Rây, cỡ lỗ lỗ 1 mm.
\r\n\r\n\r\n\r\nMẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải đúng là mẫu\r\nđại diện. Mẫu không bị hư hỏng hoặc thay đổi trong suốt quá trình vận chuyển\r\nhoặc bảo quản.
\r\n\r\nViệc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn\r\nnày. Nên lấy mẫu theo TCVN 4325 (ISO 6497).
\r\n\r\n\r\n\r\nChuẩn bị mẫu thử theo TCVN 6952 (ISO 6498).
\r\n\r\nNghiền mẫu phòng thử nghiệm (> 200 g) để\r\nlọt qua rây có cỡ lỗ 1 mm. Đối với các mẫu có lượng vết thì nghiền toàn bộ mẫu\r\nthử. Trộn kĩ.
\r\n\r\n\r\n\r\n8.1. Chuẩn bị mẫu kiểm soát chất lượng
\r\n\r\nNên sử dụng các mẫu kiểm soát chất lượng và\r\ncác biểu đồ kiểm soát chất lượng.
\r\n\r\nVới mỗi dãy, thêm một mẫu bổ sung chuẩn có\r\nhàm lượng monensin, salinomycin và narasin tương ứng khoảng 100 mg/kg, 50 mg/kg\r\nvà 50 mg/kg (đối với mẫu bổ sung thuốc thú y) hoặc với 4 mg/kg, 6 mg/kg và 6\r\nmg/kg (đối với mẫu có dạng vết).
\r\n\r\nVÍ DỤ 1 Thêm 4,0 ml chuẩn gốc monensin vào 20\r\ng mẫu để có mẫu bổ sung chuẩn 100 mg/kg và thêm 2,0 ml mỗi dung dịch chuẩn gốc\r\nsalinomycin và narasin vào 20 g mẫu bổ sung chuẩn 50mg/kg mỗi loại. Tất cả dung\r\ndịch gốc có nồng độ xấp xỉ như nhau (0,50 mg/ml, xem 4.13).
\r\n\r\nVÍ DỤ 2: Thêm 3,0 ml dung dịch hỗn hợp chuẩn\r\ntrung gian (4.14) vào 20 g mẫu để có mẫu bổ sung chuẩn 3 mg/kg đối với monensin\r\nvà 6 mg/kg đối với salinomycin và narasin.
\r\n\r\nĐộ thu hồi đối với mẫu bổ sung thuốc thú y\r\n(> 10 mg/kg) phải nằm trong khoảng từ 95 % đến 108%. Độ thu hồi đối với mẫu\r\ndạng vết (< 10 mg/kg) phải nằm trong khoảng từ 90 % đến 110 %.
\r\n\r\n8.2. Chiết mẫu
\r\n\r\n8.2.1. Mẫu thức ăn chăn nuôi khô và các\r\npremix chứa < 5000 mg/kg
\r\n\r\nCân chính xác 20 g mẫu thử vào bình nón 250\r\nml. Đối với các premix khoáng, thêm 5 g natri hydrocacbonat. Thêm 100 ml dung\r\nmôi chiết (4.9). Đậy nắp và lắc mạnh trong 1 h bằng máy lắc (5.3).
\r\n\r\n8.2.2. Mẫu thức ăn chăn nuôi khô và các\r\npremix chứa > 5000 mg/kg
\r\n\r\nCân chính xác 5 g mẫu vào bình nón 500 ml.\r\nĐối với mẫu premix khoáng, thêm 2 g natri hydrocacbonat. Thêm 200 ml dung môi\r\nchiết (4.9). Đậy nắp và lắc mạnh trong 1 h bằng máy lắc (5.3).
\r\n\r\n8.2.3. Mẫu dạng lỏng
\r\n\r\nĐồng hóa mẫu bằng cách khuấy mẫu trên máy\r\nkhuấy từ hoặc máy khuấy trộn. Lấy 20 ml mẫu dạng lỏng cho vào một ống đong chia\r\nđộ 25 ml đã biết khối lượng. Cân và chuyển mẫu vào bình nón 500 ml. Thêm 180 ml\r\nmetanol (4.2) (dùng một ít để tráng ống đong). Đậy nắp bình nón và lắc mạnh\r\ntrong 1 h bằng máy lắc (5.3).
\r\n\r\n8.2.4. Lọc dịch chiết
\r\n\r\nLọc dịch chiết qua giấy lọc Whatman No.41\r\n(5.6) vào một bình nón 125 ml.
\r\n\r\nĐối với dịch chiết có nồng độ kháng sinh\r\nionophore cao, pha loãng đến nồng độ tương đương với chuẩn D cho HPLC (4.15).\r\nHệ số pha loãng D có thể được tính theo công thức sau:
\r\n\r\nTrong đó:
\r\n\r\nWs là nồng độ kháng sinh trong mẫu,\r\ntính bằng kilogam trên mililít (mg/kg);
\r\n\r\nPstd là nồng độ của chuẩn dùng cho\r\nHPLC, tính bằng microgam trên mililít (![](\"00903126_files/image013.gif\"){kind=small}
);
mt là khối lượng phần mẫu thử,\r\ntính bằng gam (g);
\r\n\r\nVe là thể tích dịch chiết, tính\r\nbằng mililít (ml).
\r\n\r\nLọc dịch chiết nói trên hoặc rửa giải qua\r\nmàng lọc 0,45 m
8.3. Phân tích HPLC
\r\n\r\n8.3.1. Điều kiện sắc kí
\r\n\r\na) Các thông số phân tách bằng HPLC
\r\n\r\n| \r\n - cột sắc kí: \r\n | \r\n \r\n theo 5.1.7 \r\n | \r\n
| \r\n - pha động: \r\n | \r\n \r\n theo 4.10.2 \r\n | \r\n
| \r\n - tốc độ dòng: \r\n | \r\n \r\n 0,7 ml/min \r\n | \r\n
| \r\n - bước sóng detector: \r\n | \r\n \r\n 520 nm \r\n | \r\n
| \r\n - tốc độ ghi: \r\n | \r\n \r\n 0,5 cm/min \r\n | \r\n
| \r\n - thể tích bơm: \r\n | \r\n \r\n 100 | \r\n
| \r\n - cột bảo vệ: \r\n | \r\n \r\n theo 5.1.8 (chú ý thường xuyên thay mới cột\r\n bảo vệ, nhất là đối với mẫu dạng vết) \r\n | \r\n
| \r\n - độ nhạy máy ghi: \r\n | \r\n \r\n được điều chỉnh để có được độ chệch từ 50 %\r\n đến 60 % trên toàn thang đo đối với chuẩn B cho HPLC (4.15) đối với mẫu có\r\n chứa mức thấp và chuẩn D cho HPLC đối với mẫu bổ sung thuốc thú y. \r\n | \r\n
b) Điều kiện phản ứng sau cột:
\r\n\r\n| \r\n - bộ phận phản ứng sau cột: \r\n | \r\n \r\n Theo 5.1.5 \r\n | \r\n
| \r\n - pha động : \r\n | \r\n \r\n Theo 4.10.1 \r\n | \r\n
| \r\n - tốc độ dòng: \r\n | \r\n \r\n 0,9 ml/min \r\n | \r\n
| \r\n - nhiệt độ buồng phản ứng: \r\n | \r\n \r\n 98 oC \r\n | \r\n
Cần đáp ứng các tiêu chí về sự phù hợp của hệ\r\nthống theo 8.3.2. Cả ba chất chuẩn ionophore và các thành phần phụ phải được\r\nphân giải tốt trong điều kiện sắc kí, tuy nhiên, thành phần phụ của salinomycin\r\ncó thể xuất hiện như một pic biên đứng phía trước pic narasin. Sử dụng cột\r\nNucleosil (5.1.7) với các điều kiện như trên, thời gian lưu tương ứng đối với\r\nmonensin B, monensin A, salinomycin, narasin A và narasin (D + l) phải xấp xỉ\r\n8,7 min, 9,8 min, 11,2 min, 12,8min và 14,6 min.
\r\n\r\nTốc độ dòng và pha động đối với cột phân tích\r\ncó thể dao động nhẹ, tuy nhiên tổng tốc độ dòng phải nằm trong khoảng từ 1,5\r\nml/min đến 1,6 ml/min để cho phép thời gian phản ứng ít nhất là 1min. Độ nhạy\r\nđược xác định bởi các điều kiện phản ứng và tín hiệu detecor/nhiễu.
\r\n\r\nMaduramicin là một chất cản trở chính khi mẫu\r\nphân tích có dạng vết đối với salinomycin; maduramicin được rửa giải khoảng 0,3\r\nmin trước salinomycin. Semduramicin là chất cản trở chính khi phân tích\r\nmonensin; nó được rửa giải khoảng 0,4 min trước monensin B. Cả maduramicin và\r\nsemduramicin cho thấy độ nhạy thấp và có thể xử lí hiệu quả bằng quy trình\r\nkhẳng định trong Điều 9.
\r\n\r\n8.3.2. Đánh giá sự phù hợp của hệ thống
\r\n\r\n8.3.2.1. Độ phân giải
\r\n\r\nBơm hỗn hợp chuẩn D dùng cho HPLC (4.15).
\r\n\r\nTính hệ số phân giải FR đối\r\nvới các cặp pic cạnh nhau như sau:
\r\n\r\nTrong đó:
\r\n\r\ndn là khoảng cách trên đường nền\r\ngiữa điểm bắt đầu của sắc đồ và cực đại của pic, tính bằng centimet (cm);
\r\n\r\nwn là độ rộng pic trên đường nền,\r\ntính bằng centimet (cm);
\r\n\r\nn là số của pic (n=1 hoặc 2).
\r\n\r\nVÍ DỤ Dữ liệu để tính độ phân giải giữa\r\nmonensin B (1) và monensin A (2):
\r\n\r\nd1 = 10,38 cm, w1 =\r\n0,46 cm;
\r\n\r\nd2 = 11,98 cm, w2 =\r\n0,52 cm;
\r\n\r\nFR =2
Giá trị FR phải lớn hơn 1,4\r\nđối với tất cả các cặp pic cạnh nhau. Nếu tiêu chí này không được đáp ứng, điều\r\nchỉnh các điều kiện HPLC để cải thiện độ phân giải, sau đó lặp lại việc bơm\r\nchuẩn và tính.
\r\n\r\n8.3.2.2. Hệ số đuôi pic
\r\n\r\nTính hệ số đuôi pic FT theo\r\ncông thức sau:
\r\n\r\nTrong đó:
\r\n\r\nt là thời gian lưu của pic (thời gian cực đại\r\ncủa đường cong Gauss), tính bằng phút (min);
\r\n\r\nta
tb
Hệ số đuôi pic FT đối với\r\nmonensin A, salinomycin và narasin phải nhỏ hơn 1,4.
\r\n\r\n8.4. Xác định
\r\n\r\n8.4.1. Bơm lặp lại 100 ![](\"00903126_files/image014.gif\"){kind=small}
mỗi\r\ndung dịch chuẩn gốc nếu cần để định tính tất cả các pic. Kiểm tra độ tuyến tính\r\nbằng cách bơm 100 mỗi dung dịch chuẩn HPLC\r\nhỗn hợp A, B, C, D và E (4.15). Đường chuẩn hồi quy tuyến tính (hệ số tương quan\r\nkhông nhỏ hơn 0,999) và điểm cắt trục tung cách giao điểm zero không đáng kể.
Việc định lượng có thể thực hiện bằng cách sử\r\ndụng một điểm chuẩn hoặc một đường chuẩn. Cách sử dụng đường chuẩn thường được\r\nsử dụng nhiều hơn.
\r\n\r\nĐối với việc định lượng bằng một điểm chuẩn,\r\nkhi phân tích mẫu bổ sung thuốc thú y cần sử dụng chuẩn đơn thích hợp (4.16)\r\n(chỉ dùng hỗn hợp chuẩn khi phân tích nhiều loại ionophore). Đối với mẫu thử\r\ndạng vết, dùng hỗn hợp chuẩn B dùng cho HPLC (4.15) để định lượng. Bơm lại dung\r\ndịch chuẩn sau 8 đến 10 lần bơm dung dịch mẫu thử.
\r\n\r\nĐối với việc định lượng bằng đường chuẩn, bơm\r\ndãy chuẩn HPLC (4.15) lúc ban đầu và kết thúc phân tích mẫu. Dựng đường chuẩn\r\nhồi quy tuyến tính.
\r\n\r\nBơm 100 dung\r\ndịch mẫu thử. Xác định diện tích pic. Nếu diện tích pic lớn hơn pic chuẩn đơn\r\nhoặc nằm ngoài dãy chuẩn thì pha loãng dung dịch mẫu thử bằng dung môi chiết\r\n(4.9). Không giảm thể tích mẫu bơm vào.
CHÚ THÍCH: Do dung dịch mẫu thử không được\r\nlàm sạch nên thời gian lưu có thể dài hơn đến 0,5 min so với thời gian lưu của\r\npic chuẩn. Điều này chủ yếu xảy ra đối với monensin. Tuy nhiên, sự có mặt có\r\npic monensin B thường khẳng định sự có mặt của monensin. Nếu có nghi ngờ, có\r\nthể định tính pic bằng cách thêm chuẩn vào dung dịch mẫu thử hoặc khẳng định\r\nbằng thuốc thử DMAB (9.2) hoặc chiết bằng hexan (9.3).
\r\n\r\n8.4.2. Trình tự tắt hệ thống như sau
9.1. Yêu cầu chung
\r\n\r\nCác mẫu thử dương tính ở mức vết và các mẫu\r\nbổ sung thuốc thú y có chứa các ionophore không dự kiến cần được khẳng định để\r\nxác nhận việc nhận biết chính xác các pic. Có thể áp dụng một trong hai quy\r\ntrình sau đây, tuy nhiên quy trình dùng thuốc thử DMAB là tốt nhất. Việc chiết\r\nbằng hexan không thể áp dụng đối với các mẫu premix khoáng hoặc mẫu dạng lỏng\r\nvà các kết quả khi sử dụng hexan ít có giá trị định lượng (chỉ khoảng 90 %),\r\nnhưng với mẫu phức tạp thì sắc đồ được cải thiện đáng kể (ít các pic nhiễu).\r\nXem 10.5 về cách diễn giải các kết quả.
\r\n\r\n9.2. Dẫn xuất sau cột bằng DMAB
\r\n\r\nQuy trình này có thể áp dụng cho tất cả các\r\nloại mẫu thức ăn chăn nuôi [6].
\r\n\r\nTiến hành các bước từ 8.1 đến 8.4 và các điều\r\nkiện HPLC (8.3.1), nhưng sử dụng các thông số phản ứng sau cột như sau:
\r\n\r\na) Thông số phản ứng sau cột:
\r\n\r\n| \r\n - tốc độ thuốc thử: \r\n | \r\n \r\n 0,8 ml/min \r\n | \r\n
| \r\n - nhiệt độ buồng phản ứng: \r\n | \r\n \r\n 95 oC \r\n | \r\n
| \r\n - bước sóng: \r\n | \r\n \r\n 592 nm. \r\n | \r\n
b) Thuốc thử sau cột (pha động):
\r\n\r\n- vừa khuấy nhẹ vừa thêm 20 ml axit sulfuric\r\n(4.3) vào 950 ml metanol (4.2)
\r\n\r\n- để nguội, vừa khuấy vừa thêm 30 g DMAB\r\n(4.7)
\r\n\r\n- tránh ánh sáng, chuẩn bị mới trong ngày sử\r\ndụng.
\r\n\r\n9.3. Chiết bằng hexan
\r\n\r\nQuy trình này không áp dụng đối với mẫu chứa\r\nkhoáng hoặc mẫu dạng lỏng.
\r\n\r\nCân chính xác 20 g mẫu vào bình nón 250 ml.\r\nThêm 100 ml hexan (4.8). Đậy nắp và lắc qua đêm bằng máy lắc (5.3). Lọc dung\r\ndịch mẫu qua giấy lọc Whatman No. 42 (5.6) vào bình nón 125 ml. Dùng pipet lấy\r\n10 ml dịch chiết vào ống nghiệm và cho bay hơi đến khô sử dụng thiết bị thổi\r\nkhí bằng nitơ (5.2). Hòa tan phần còn lại trong 10 ml dung môi chiết (4.9). Lọc\r\ndịch chiết trước khi tiến hành phân tích bằng HPLC (8.3).
\r\n\r\n\r\n\r\n10.1. Yêu cầu chung
\r\n\r\nTính hàm lượng ionophore trong mẫu bằng cách\r\nso sánh diện tích pic của mỗi mẫu với diện tích pic trung bình của dung dịch\r\nchất chuẩn trước và sau khi bơm mẫu (phương pháp một điểm chuẩn). Đối với\r\nmonensin và narasin thì các kết quả được tính theo hoạt tính kháng khuẩn bằng\r\ncách dùng các hệ số hiệu quả sinh học. Kết quả đối với salinomycin được biểu\r\nthị theo tỉ lệ khối lượng.
\r\n\r\n10.2. Monensin
\r\n\r\nHàm lượng monensin (mg/kg) tương đương với\r\ngiá trị sinh học của monensin A + B.
\r\n\r\nGiá trị sinh học, B, của mỗi thành\r\nphần, tính bằng miligam trên kilogam (mg/kg), được tính theo công thức sau:
\r\n\r\nTrong đó:
\r\n\r\nAM
AAS là diện tích pic của monensin A trong dung\r\ndịch chuẩn (trung bình);
\r\n\r\npAS);
m là khối lượng phần mẫu thử, tính bằng gam\r\n(g);
\r\n\r\nV là thể tích dịch chiết hoặc tổng thể tích\r\nmẫu (đối với mẫu dạng lỏng), tính bằng mililit (ml);
\r\n\r\nD là hệ số pha loãng (xem 8.2.4 và 8.4.1);
\r\n\r\nFM
FA = 1,00
\r\n\r\nFB = 0,28
\r\n\r\nHoạt tính tổng số của monensin bằng BA+\r\nBB, tính bằng miligam trên kilogam (mg/kg).
\r\n\r\nĐể tính độ thu hồi của monensin trong mẫu bổ\r\nsung chuẩn, không sử dụng hệ số FM trong công thức.
\r\n\r\nĐối với mẫu dạng vết, có thể không xác định\r\nđược monensin B.
\r\n\r\nNồng độ của monensin B trong dung dịch thử\r\nđược tính theo chuẩn monensin A. Xem ví dụ cụ thể và cách tính.
\r\n\r\nVÍ DỤ:
\r\n\r\n| \r\n Khối lượng phần mẫu thử (m) \r\n | \r\n \r\n = 20,00 g \r\n | \r\n
| \r\n Thể tích chiết (V) \r\n | \r\n \r\n = 100 ml \r\n | \r\n
| \r\n Hệ số pha loãng (D) \r\n | \r\n \r\n = 4 \r\n | \r\n
| \r\n Nồng độ monensin A trong dung dịch chuẩn\r\n HPLC (pAS) \r\n | \r\n \r\n =5,05 mg/ml \r\n | \r\n
| \r\n Diện tích pic trung bình của monensin A\r\n trong dung dịch chuẩn HPLC (AAS) \r\n | \r\n \r\n = 1 479 566 \r\n | \r\n
| \r\n Diện tích pic monensin A trong dung dịch\r\n mẫu thử (AA) \r\n | \r\n \r\n = 1 450 878 \r\n | \r\n
| \r\n Diện tích pic monensin B trong dung dịch\r\n mẫu thử (AB) \r\n | \r\n \r\n = 67 091 \r\n | \r\n
BAmg/kg
BB = ![](\"00903126_files/image020.gif\"){kind=small}
Tổng hàm lượng monensin = 99,0 + 1,3 = 100,3\r\nmg/kg
\r\n\r\n10.3. Salinomycin
\r\n\r\nHàm lượng salinomycin trong mẫu, ws,\r\ntính bằng miligam trên kilogam (mg/kg), được tính theo công thức sau:
\r\n\r\nhoặc:
\r\n\r\nTrong đó:
\r\n\r\nA là diện tích pic của salinomycin trong dung\r\ndịch mẫu thử.
\r\n\r\nAs
Ps
mt
V là thể tích chiết, tính bằng mililit (ml);
\r\n\r\nD là hệ số pha loãng (xem 8.2.4 và 8.4.1);
\r\n\r\npt
VÍ DỤ:
\r\n\r\n| \r\n Khối lượng phần mẫu thử (m) \r\n | \r\n \r\n = 20,00 g \r\n | \r\n
| \r\n Thể tích chiết (V) \r\n | \r\n \r\n = 100 ml \r\n | \r\n
| \r\n Hệ số pha loãng (D) \r\n | \r\n \r\n = 1 \r\n | \r\n
| \r\n Nồng độ salinomycin trong dung dịch chuẩn\r\n HPLC (pS) \r\n | \r\n \r\n =10,55 mg/ml \r\n | \r\n
| \r\n Diện tích pic salinomycin trong dung dịch chuẩn\r\n (As) \r\n | \r\n \r\n = 1 575 475 \r\n | \r\n
| \r\n Diện tích pic salinomycin trong dung dịch\r\n chuẩn (A) \r\n | \r\n \r\n = 1 568 882 \r\n | \r\n
ws ![](\"00903126_files/image023.gif\"){kind=small}
10.4. Narasin
\r\n\r\nHàm lượng narasin (mg/kg) tương đương với giá\r\ntrị sinh học của narasin [A + (D + l)].
\r\n\r\nGiá trị sinh học của mỗi thành phần, B,\r\ntính bằng miligam trên kilogam (mg/kg), được tính theo công thức sau:
\r\n\r\nhoặc:
\r\n\r\nTrong đó:
\r\n\r\nAN
AAS
pAS
mt
V là thể tích dung môi, tính bằng mililit\r\n(ml);
\r\n\r\nD là hệ số pha loãng (xem 8.2.4 và 8.4.1);
\r\n\r\nFN
pN
FA
FD+l được tính theo công thức sau:
\r\n\r\nTrong đó:
\r\n\r\ncDs là hàm lượng narasin D trong\r\nchuẩn narasin, tính bằng phần trăm (%);
\r\n\r\ncis là hàm lượng narasin l trong\r\nchuẩn narasin, tính bằng phần trăm (%);
\r\n\r\nvà hệ số hiệu quả sinh học đối với từng đồng\r\nphân là:
\r\n\r\nFD
Fl
Xem phần Hồ sơ chất chuẩn đối chứng về phần\r\ntrăm của các đồng phân A, D và l trong chuẩn đối chứng sử dụng.
\r\n\r\nNồng độ của các đồng phân (D + l) trong dịch\r\nchiết mẫu được tính theo đồng phân A trong dung dịch chuẩn. Xem ví dụ về cách\r\ntính.
\r\n\r\nVÍ DỤ 1:\r\nĐối với\r\nlô chuẩn đối chứng RS0302, cDs = 1,9 % và cis = 0,7 %
\r\n\r\nĐể tính tỷ lệ phần trăm thu hồi của narasin trong\r\nmẫu bổ sung chuẩn, không sử dụng hệ số Fn trong\r\ncông thức tính. Đối với mẫu dạng vết, có thể không xác định được narasin (D +\r\nl).
\r\n\r\nVÍ DỤ 2
\r\n\r\n| \r\n Khối lượng phần mẫu thử (m) \r\n | \r\n \r\n = 20,00 g \r\n | \r\n
| \r\n Thể tích dung môi (V) \r\n | \r\n \r\n = 100 ml \r\n | \r\n
| \r\n Hệ số pha loãng (D) \r\n | \r\n \r\n = 1,0 \r\n | \r\n
| \r\n Nồng độ narasin trong dung dịch chuẩn HPLC\r\n (pAs) \r\n | \r\n \r\n = 10,60 mg/ml \r\n | \r\n
| \r\n Diện tích pic trung bình narasin A trong\r\n chuẩn HPLC (AAS) \r\n | \r\n \r\n = 1 559 626 \r\n | \r\n
| \r\n Diện tích pic narasin A trong dung dịch mẫu\r\n (AA) \r\n | \r\n \r\n = 1 539 393 \r\n | \r\n
| \r\n Diện tích pic narasin (D + l) trong dung\r\n dịch mẫu (AD+l) \r\n | \r\n \r\n = 77 376 \r\n | \r\n
BNmg/kg
BNmg/kg
Hàm lượng narasin tổng số = 56,3 + 2,9 = 59,2\r\nmg/kg
\r\n\r\nBáo cáo các kết quả cuối cùng đến hai chữ số\r\ncó nghĩa nếu < 10 mg/kg và đến ba chữ số có nghĩa nếu > 10 mg/kg. Các mẫu\r\nthử dương tính ở mức vết và các mẫu bổ sung thuốc thú y nghi ngờ có chứa các\r\nionophore không dự kiến cần được khẳng định. Xem Điều 9.
\r\n\r\n10.5. Diễn giải kết quả khẳng định mẫu dương\r\ntính
\r\n\r\nKhi khẳng định bằng cách dùng DMAB làm thuốc\r\nthử sau cột, các kết quả đối với các ionophore phải phù hợp với những kết quả\r\nthu được khi dùng vanilin. Tuy nhiên, kích cỡ pic của từng ionophore khi dùng\r\nDMAB phải lớn hơn 1,3 lần đến 1,5 lần so với kết quả thu được khi dùng vanilin.\r\nTỷ lệ cỡ pic đối với DMAB/vanilin đối với mẫu thử phải phù hợp với chất chuẩn.
\r\n\r\nNếu nghi ngờ có maduramicin ở thời gian lưu\r\ngiống với salinomycin thì kết quả thu được sử dụng DMAB phải thấp hơn đáng kể\r\nvì maduramicin kém nhạy hơn salinomycin khoảng 6 lần. Một mẫu chứa maduramicin\r\nvới hàm lượng 5 mg/kg sẽ cho một pic có tín hiệu tương đương với mẫu chứa\r\nsalinomycin với hàm lượng 1 mg/kg; nghĩa là thấp hơn giới hạn định lượng\r\nsalinomycin.
\r\n\r\nNếu có mặt semduramicin thì phải có một pic\r\nngay trước monensin B. Khi dùng vanilin để khẳng định thì semduramicin kém nhạy\r\nhơn khoảng 13 lần so với cả monensin A và B. Khi dùng DMAB thì semduramicin kém\r\nnhạy hơn monensin khoảng 28 lần.
\r\n\r\nKhi khẳng định bằng cách chiết với hexan, các\r\nkết quả đối với ba loại ionophore chỉ được sai lệch trong vòng 10 % so với kết\r\nquả khi chiết bằng metanol 90 %. Nếu có mặt maduramicin hoặc semduramicin,\r\nphương pháp chiết bằng hexan cho kết quả từ 40 % đến 50 % so với kết quả thu\r\nđược khi chiết bằng metanol.
\r\n\r\nCác thông tin nói trên cần được thẩm định lại\r\nđối với mỗi hệ thống HPLC cụ thể.
\r\n\r\nViệc định tính pic được khẳng định bằng quy\r\ntrình ở Điều 8 nếu thời gian lưu của chuẩn và mẫu khác nhau không quá 0,2 min\r\nvà kết quả định lượng nằm trong khoảng ± 5 % (vanilin so với DMAB) và ± 10 %\r\n(chiết bằng 90 % metanol so với chiết bằng hexan).
\r\n\r\n\r\n\r\n11.1. Phép thử liên phòng thử nghiệm
\r\n\r\nChi tiết về phép thử liên phòng nghiệm của\r\nphương pháp được nêu trong Phụ lục A. Các giá trị thu được từ phép thử liên\r\nphòng nghiệm này có thể không áp dụng được cho các dải nồng độ và chất nền\r\nkhác.
\r\n\r\n11.2. Độ lặp lại
\r\n\r\nChêch lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử\r\nnghiệm độc lập, riêng rẽ, biểu thị theo phần trăm giá trị trung bình, thu được\r\nkhi sử dụng cùng phương pháp, tiến hành trên vật liệu thử giống hệt nhau, trong\r\nmột phòng thử nghiệm, do một người thực hiện, sử dụng cùng thiết bị, trong một\r\nkhoảng thời gian ngắn, trong không quá 5% các trường hợp lớn hơn giới hạn độ\r\nlặp lại (r) thu được bằng công thức sau (9);
\r\n\r\ntrong đó RSD(r) là độ lệch chuẩn tương đối\r\nlặp lại.
\r\n\r\nCác giá trị độ lặp lại giống nhau đối với cả 3\r\nchất phân tích, xem ở Bảng 2.
\r\n\r\n11.3. Độ tái lập
\r\n\r\nChêch lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử\r\nnghiệm riêng rẽ, biểu thị theo phần trăm giá trị trung bình, thu được khi sử\r\ndụng cùng phương pháp, tiến hành thử trên vật liệu giống thử hệt nhau, trong các\r\nphòng thử nghiệm khác nhau, do những người khác nhau thực hiện, sử dụng các\r\nthiết bị khác nhau, trong không quá 5% các trường hợp lớn hơn giới hạn độ tái lập\r\n(R) thu được bằng công thức sau [9];
\r\n\r\nTrong đó RSD(R) là độ lệch chuẩn tương\r\nđối tái lập.
\r\n\r\nCác giá trị độ lặp lại và độ tái lập đối với\r\nmẫu bổ sung thuốc thú y (> 10 mg/kg), chế phẩm bổ sung và các premix khoáng\r\nchất theo các bảng A.1, A.2 và A.3, được nêu trong Bảng 2.
\r\n\r\n| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n a Các giá trị trung bình được xác định bằng\r\n phân tích biến sai. Số liệu nghiên cứu cho thấy sự dao động của phép phân\r\n tích không phụ thuộc vào nồng độ của chất phân tích và loại mẫu thử. \r\n | \r\n |||
Các giá trị độ lặp lại và độ tái lập tương tự\r\ncũng thu được ở mẫu thức ăn chăn nuôi dạng vết, trừ các mẫu chứa hàm lượng\r\nmonensin 3 mg/kg (có thể do mẫu kém đồng nhất).
\r\n\r\n11.4. Giới hạn định lượng
\r\n\r\nGiới hạn định lượng thực nghiệm là 1 mg/kg\r\nđối với monensin và 2 mg/kg đối với narasin và salinomycin. Có thể đạt được\r\ngiới hạn định lượng thấp hơn tùy thuộc hệ thống HPLC được sử dụng và phải được\r\nngười sử dụng phương pháp đánh giá hiệu lực.
\r\n\r\n\r\n\r\nBáo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:
\r\n\r\n- mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ\r\nvề mẫu thử;
\r\n\r\n- phương pháp lấy mẫu đã dùng, nếu biết;
\r\n\r\n- phương pháp thử đã dùng, cũng như viện dẫn\r\ntiêu chuẩn này;
\r\n\r\n- tất cả các chi tiết thao tác không quy định\r\ntrong tiêu chuẩn này, hoặc tùy ý lựa chọn cùng với các chi tiết bất thường nào\r\nkhác có thể ảnh hưởng tới kết quả;
\r\n\r\n- kết quả thử nghiệm thu được;
\r\n\r\n- kết quả cuối cùng thu được nếu kiểm tra độ\r\nlặp lại.
\r\n\r\nA.1. Cách tiến hành
\r\n\r\nMột phép thử liên phòng thử nghiệm được tổ\r\nchức và thực hiện theo Hướng dẫn thử liên phòng thử nghiệm của AOAC quốc tế [9.10]\r\nnăm 2002. Các mẫu thử được chuẩn bị bằng cách nghiền một lượng thích hợp từ\r\nnguyên liệu thử dạng khô bằng thiết bị Retsch ZM1 (lỗ sàng 0,75 mm) hoặc Retsch\r\nSR3 (lỗ sàng 1,0 mm). Nguyên liệu sau khi nghiền được trộn đều bằng tay sau đó\r\nchia làm nhiều phần trên thiết bị chia mẫu Retsch rotary PTZ, mỗi phần khoảng\r\n50 g. Độ đồng nhất của mẫu con được đánh giá bằng cách phân tích 6 mẫu chọn\r\nngẫu nhiên: nguyên liệu thử được coi là đồng nhất nếu độ lệch chuẩn tương đối\r\nlặp lại nhỏ hơn 2 %.
\r\n\r\nCác phòng thử nghiệm tham gia được lựa chọn\r\ndựa trên các kết quả từ nghiên cứu thành thạo phương pháp bao gồm cả tính phù\r\nhợp của hệ thống và phân tích 2 mẫu trong đó 1 mẫu có chứa monensin và 1 mẫu\r\nchứa salinomycin. Phạm vi nghiên cứu của phương pháp là trên mẫu thử dạng vết\r\n(1 mg/kg) đến premix bổ sung thuốc thú y (200 g/kg). Hai mươi lăm mẫu bổ sung\r\nthuốc thú y, chín mẫu dạng vết và các mẫu chuẩn đối chứng của ba loại kháng\r\nsinh được gửi đến các phòng thử nghiệm tham gia. 10 phòng thử nghiệm đã gửi lại\r\nsố liệu được chấp nhận trong khoảng thời gian phù hợp. Số liệu từ một phòng thử\r\nnghiệm bị loại do không đảm bảo một số yêu cầu của phép thử nghiệm đặt ra.
\r\n\r\nCác mẫu được thử như sau:
\r\n\r\na) Các mẫu bổ sung thuốc thú y
| \r\n Monensin \r\n | \r\n \r\n Narasin \r\n | \r\n \r\n salinomycin \r\n | \r\n
| \r\n 2 mẫu thức ăn hoàn chỉnh, lặp lại \r\n | \r\n \r\n 2 mẫu thức ăn hoàn chỉnh, lặp lại \r\n | \r\n \r\n 3 mẫu thức ăn hoàn chỉnh, lặp lại \r\n | \r\n
| \r\n 1 mẫu thức ăn bổ sung, lặp lại \r\n | \r\n \r\n 1 mẫu hỗn hợp có bổ sung thuốc, mẫu đơn. \r\n | \r\n \r\n 1 mẫu thức ăn bổ sung, mẫu đơn \r\n | \r\n
| \r\n 1 mẫu bổ sung dạng lỏng, lặp lại \r\n | \r\n \r\n 1 mẫu premix khoáng, lặp lại \r\n | \r\n \r\n \r\n | \r\n
| \r\n 1 mẫu premix khoáng, mẫu đơn \r\n | \r\n \r\n 1 mẫu hỗn hợp có bổ sung thuốc, mẫu đơn \r\n | \r\n \r\n \r\n | \r\n
| \r\n 1 mẫu hỗn hợp có bổ sung thuốc, mẫu đơn \r\n | \r\n \r\n \r\n | \r\n \r\n \r\n | \r\n
b) Mẫu dạng vết
1 mẫu thức ăn hoàn chỉnh chứa monensin và\r\nnarasin, lặp lại
\r\n\r\n1 mẫu thức ăn hoàn chỉnh chứa salinomycin,\r\nlàm lặp lại
\r\n\r\n1 mẫu thức ăn bổ sung dạng lỏng có chứa\r\nmonensin, mẫu đơn
\r\n\r\n4 mẫu trắng thức ăn hoàn chỉnh.
\r\n\r\nKỹ thuật khẳng định mẫu dương tính (dùng\r\nthuốc thử sau cột để thay thế) đã được cung cấp trong thử nghiệm này. Các phòng\r\nthử nghiệm tham gia được yêu cầu áp dụng kỹ thuật đó để khẳng định lại đối với\r\ntất cả các mẫu dương tính dạng vết.
\r\n\r\nA.2. Phân tích thống kê các kết quả
\r\n\r\nCác kết quả thử nghiệm đã được kiểm tra xem\r\ncó dấu hiệu mắc sai lỗi hệ thống nào không bằng cách sử dụng các phép thử Cochran\r\nvà Grubbs theo các quy trình được mô tả trong Hướng dẫn nghiên cứu liên phòng\r\nthử nghiệm [9.10]. Việc tính các giới hạn độ lặp lại (r) và\r\ngiới hạn độ tái lập (R) theo hướng dẫn [9.10] được thực hiện\r\nsau khi đã loại trừ ngoại lệ. Các giá trị Horrat, tỉ số giữa độ lệch chuẩn\r\ntương đối tái lập thu được với độ lệch chuẩn tương đối tái lập dự kiến đã được\r\ntính. Các giá trị Horrat dao động trong khoảng từ 0,5 đến 1,5 là chấp nhận được\r\n[10] . Các dữ liệu về phương pháp tính (độ lặp lại, độ tái lập và\r\ngiá trị Horrat) được nêu trong các Bảng từ A.1 đến A.3.
\r\n\r\n| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Số phòng thử nghiệm còn lại sau khi đã loại\r\n trừ ngoại tệ \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Hàm lượng monensin trung bình, mg/kg \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Độ lệch chuẩn lặp lại (sr),\r\n mg/kg \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, % \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Giới hạn lặp lại (r), % của hàm lượng trung\r\n bình \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Giới hạn lặp lại (r), mg/kg \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Độ lệch chuẩn tái lập (sR),\r\n mg/kg \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, % \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Giới hạn tái lập (R), % của hàm lượng trung\r\n bình được xác định \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Giá trị Horrat \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Thử nghiệm mẫu bổ sung thuốc thú y: \r\n | \r\n \r\n Thử nghiệm mẫu dạng vết: \r\n | \r\n |||||||||
| \r\n Mẫu 1: thức ăn cho gà tây \r\n | \r\n \r\n Mẫu 7: thức ăn bổ sung dạng lỏng/vanilin \r\n | \r\n |||||||||
| \r\n Mẫu 2: thức ăn cho bò sữa \r\n | \r\n \r\n Mẫu 8: thức ăn bổ sung dạng lỏng/DMAB \r\n | \r\n |||||||||
| \r\n Mẫu 3: thức ăn bò thịt \r\n | \r\n \r\n Mẫu 9: thức ăn cho bò thịt/vanilin \r\n | \r\n |||||||||
| \r\n Mẫu 4: thức ăn bổ sung dạng lỏng \r\n | \r\n \r\n Mẫu 10: thức ăn cho bò thịt/DMAB \r\n | \r\n |||||||||
| \r\n Mẫu 5: premix cho bê tơ cái (premix khoáng) \r\n | \r\n ||||||||||
| \r\n Mẫu 6: thức ăn có rumensin (premix thuốc) \r\n | \r\n ||||||||||
| \r\n a Số liệu độ lệch chuẩn và các thông số liên\r\n quan được báo cáo lại vì thiếu số liệu lặp lại hai lần trong mỗi phòng thử\r\n nghiệm (các kết quả thử nghiệm được cung cấp dưới dạng mẫu đơn). \r\n | \r\n ||||||||||
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Số phòng thử nghiệm còn lại sau khi đã loại\r\n trừ ngoại tệ \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Hàm lượng narasin trung bình, mg/kg \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Độ lệch chuẩn lặp lại (sr),\r\n mg/kg \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, % \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Giới hạn lặp lại (r), % của hàm lượng trung\r\n bình \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Độ lệch chuẩn tái lập (sR),\r\n mg/kg \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, % \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Giới hạn tái lập (R), % của hàm lượng trung\r\n bình \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Giá trị Horrat \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Thử nghiệm mẫu bổ sung thuốc thú y: \r\n | \r\n \r\n Thử nghiệm mẫu dạng vết: \r\n | \r\n ||||
| \r\n Mẫu 1: thức ăn cho gà giò \r\n | \r\n \r\n Mẫu 4: thức ăn cho bò/vanilin \r\n | \r\n ||||
| \r\n Mẫu 2: thức ăn cho lợn có nicarbazin \r\n | \r\n \r\n Mẫu 5: thức ăn cho bò/DMAB \r\n | \r\n ||||
| \r\n Mẫu 3: Maxiban (mẫu đậm đặc có thuốc) \r\n | \r\n \r\n | \r\n ||||
| \r\n a Số liệu độ lệch chuẩn và các thông số liên\r\n quan được báo cáo lại vì thiếu số liệu lặp lại hai lần trong mỗi phòng thử\r\n nghiệm (các kết quả thử nghiệm được cung cấp dưới dạng mẫu đơn). \r\n | \r\n |||||
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Số phòng thử nghiệm còn lại sau khi đã loại\r\n trừ ngoại tệ \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Hàm lượng salinomycin trung bình, mg/kg \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Độ lệch chuẩn lặp lại (sr),\r\n mg/kg \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, % \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Giới hạn lặp lại (r), % của hàm lượng trung\r\n bình \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Độ lệch chuẩn tái lập (sR),\r\n mg/kg \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, % \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Giới hạn tái lập (R), % của hàm lượng trung\r\n bình \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Giá trị Horrat \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Thử nghiệm mẫu bổ sung thuốc thú y: \r\n | \r\n \r\n Thử nghiệm mẫu dạng vết: \r\n | \r\n |||||||
| \r\n Mẫu 1: thức ăn cho gà giò giai đoạn đầu \r\n | \r\n \r\n Mẫu 7: thức ăn cho bò sữa /valinin \r\n | \r\n |||||||
| \r\n Mẫu 2: thức ăn cho lợn thịt giai đoạn sau\r\n cai sữa \r\n | \r\n \r\n Mẫu 8: thức ăn cho bò sữa /DMAB \r\n | \r\n |||||||
| \r\n Mẫu 3: thức ăn cho bò thịt giai đoạn vỗ béo \r\n | \r\n \r\n \r\n | \r\n |||||||
| \r\n Mẫu 4: thức ăn bổ sung cho bò (premix\r\n khoáng) \r\n | \r\n \r\n \r\n | \r\n |||||||
| \r\n Mẫu 5: thức ăn bổ sung cho gà thịt (premix\r\n khoáng) \r\n | \r\n \r\n \r\n | \r\n |||||||
| \r\n Mẫu 6: Bio-Cox (premix thuốc) \r\n | \r\n \r\n \r\n | \r\n |||||||
| \r\n a Số liệu độ lệch chuẩn và các thông số liên\r\n quan được báo cáo lại vì thiếu số liệu lặp lại hai lần trong mỗi phòng thử\r\n nghiệm (các kết quả thử nghiệm được cung cấp dưới dạng mẫu đơn). \r\n | \r\n ||||||||
A.3. Ví dụ sắc kí
\r\n\r\nVí dụ về sắc kí đối với hỗn hợp chuẩn D của\r\nHPLC được mô tả ở Hình A.1.
\r\n\r\n![](\"00903126_files/image030.jpg\")
CHÚ DẪN
\r\n\r\nX: Thời gian lưu, min
\r\n\r\nY: Chiều cao của pic, mV hoặc mAU
\r\n\r\nNồng độ:
\r\n\r\n| \r\n monesin: \r\n | \r\n \r\n 4,85 | \r\n
| \r\n salinomycin: \r\n | \r\n \r\n 10,65 | \r\n
| \r\n narasin: \r\n | \r\n \r\n 8,98 | \r\n
\r\n\r\n
[1] LAPOINTE, M.R. and COHEN, H. J. AOAC,\r\n71, 1988, pp. 480-484
\r\n\r\n[2] GORAS, J.T and LACOURSE, W.R. J. AOAC,\r\n67, 1984, pp. 701-706
\r\n\r\n[3] BLANCHFOWER, W.J. et al. Analyst, 110,\r\n1985, pp. 1283-1287
\r\n\r\n[4] RODEWALD, J.M., MORAN, J.W., DONOHO,\r\nA.L., COLEMAN, M.R.J. AOAC, 75, 1992, pp. 272-279
\r\n\r\n[5] RODEWALD, J.M., MORAN, J.W., DONOHO,\r\nA.L., COLEMAN, M.R.J. AOAC, 77, 1994, pp. 821-828
\r\n\r\n[6] AKHTAR, M.H and CROTEAU, L.G. Analyst,\r\n121, 1996, pp. 803-806.
\r\n\r\n[7] COLEMAN, M.R., MACY, T.D., MORAN, J.W.,\r\nRODEWALD, J.M. J.AOAC, 77, 1994, pp. 1065-1072
\r\n\r\n[7] COLEMAN, M.R., MORAN, J.W., MOWREY, D.H. J.\r\nAOAC Int, 80, 1997, pp. 693-702.
\r\n\r\n[9] Collaborative Study Guidelines, J.\r\nAOAC Int, 78, 1995, pp. 143A-160A.
\r\n\r\n[10] Appendix D: Guidelines for Collaborative\r\nStudy procedures to validate characteristics of a method of analysis, Official\r\nMethods of Analysis of AOAC International, 17th edn, 2000
\r\n\r\n[11] TCVN 4325:2007 (ISO 6497:2002),Thức\r\năn chăn nuôi – Lấy mẫu
\r\n\r\n\r\n\r\n
\r\n\r\n
File gốc của Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8545:2010 (ISO 14183:2005) về thức ăn chăn nuôi – Xác định hàm lượng monensin, narasin và salinomycin – Phương pháp sắc kí lỏng với dẫn xuất sau cột đang được cập nhật.
Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8545:2010 (ISO 14183:2005) về thức ăn chăn nuôi – Xác định hàm lượng monensin, narasin và salinomycin – Phương pháp sắc kí lỏng với dẫn xuất sau cột
Tóm tắt
| Cơ quan ban hành | Đã xác định |
| Số hiệu | TCVN8545:2010 |
| Loại văn bản | Tiêu chuẩn Việt Nam |
| Người ký | Đã xác định |
| Ngày ban hành | 2010-01-01 |
| Ngày hiệu lực | |
| Lĩnh vực | Nông nghiệp |
| Tình trạng | Còn hiệu lực |