\r\n\r\n

TIÊU CHUẨN\r\nQUỐC GIA

\r\n\r\n

TCVN\r\n8378:2010

\r\n\r\n

TÔM\r\nVÀ SẢN PHẨM TÔM –

\r\n\r\n

PHÁT HIỆN VIRUT GÂY\r\nBỆNH ĐẦU VÀNG (YHV) BẰNG KỸ THUẬT

\r\n\r\n

PHẢN ỨNG CHUỖI TRÙNG\r\nHỢP - PHIÊN MÃ NGƯỢC (RT-PCR)

\r\n\r\n

Shrimp and shrimp\r\nproducts –

\r\n\r\n

Detection of yellow\r\nhead virus (YHV) by reverse transcription - polymerase chain reaction (RT-PCR)

\r\n\r\n

Lời nói đầu

\r\n\r\n

TCVN 8378 : 2010 do\r\nCục Quản lý Chất lượng Nông Lâm sản và Thuỷ\r\nsản biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đề nghị, Tổng cục\r\nTiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

\r\n\r\n

 

\r\n\r\n

CẢNH BÁO – Để đảm bảo an toàn\r\ncho nhân viên, các thao tác phân tích chỉ được thực hiện trong các phòng thử\r\nnghiệm được trang bị thích hợp, dưới sự kiểm soát của cán bộ thử nghiệm có kinh\r\nnghiệm. Etidi bromua (EB) là chất có khả năng gây ung thư. Vì vậy phải mang\r\ngăng tay, đeo kính và mặc quần áo bảo hộ để tránh tiếp xúc. Nên đánh dấu rõ\r\nràng thiết bị và dụng cụ tiếp xúc với EB và không di chuyển chúng ra khỏi khu\r\nvực quy định. Để chất thải có chứa EB trong vật chứa và có phương pháp loại bỏ\r\nthích hợp.\r\n

\r\n\r\n

1. Phạm\r\nvi áp dụng

\r\n\r\n

Tiêu\r\nchuẩn này quy định phương pháp phát hiện virut gây bệnh đầu vàng (YHV) trên tôm\r\nvà các sản phẩm của tôm thuộc chi Tôm he (Penaeus)\r\nbằng kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp - phiên mã ngược (RT-PCR).

\r\n\r\n

2. Tài\r\nliệu viện dẫn

\r\n\r\n

Các tài liệu viện\r\ndẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu\r\nviện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu\r\nviện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các\r\nsửa đổi, bổ sung (nếu có).

\r\n\r\n

ISO\r\n22174 : 2005, Microbiology of food and animal feeding stuffs – Polymerase\r\nchain reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens – General\r\nrequirements and definitions (Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn\r\nchăn nuôi – Phản ứng chuỗi trùng hợp để phát hiện sinh vật gây bệnh từ thực\r\nphẩm – Yêu cầu chung và định nghĩa).

\r\n\r\n

3. Thuật\r\nngữ và định nghĩa

\r\n\r\n

Trong\r\ntiêu chuẩn này áp dụng các thuật ngữ và định nghĩa sau:

\r\n\r\n

3.1 Virut\r\ngây bệnh đầu vàng (YHV) [Yellow head virus\r\n(YHV)]

\r\n\r\n

Virut\r\nCorona, thuộc chi Okavirus, họ Ronivirida, bộ Nidovirales, vật chất di truyền là\r\nRNA, kích thước khoảng 22 kb, mã hóa cho 4 sợi polypeptide có kích thước là\r\n170, 135, 67 và 22 kDa.

\r\n\r\n

3.2 Phát\r\nhiện virut gây bệnh đầu vàng (Detection of yellow\r\nhead virus)

\r\n\r\n

Việc\r\nxác định sự có hoặc không có virut YHV (3.1) trong một khối lượng cụ thể của\r\nsản phẩm khi tiến hành thử nghiệm theo tiêu chuẩn này.

\r\n\r\n

4. Nguyên\r\ntắc

\r\n\r\n

4.1 Phương\r\npháp phân tích định tính này dựa vào việc xác định đoạn RNA có chuyển thành\r\ncDNA hay không và cDNA đích có được khuếch đại hay không. Quá trình xác định\r\nđược thực hiện bằng cách điện di sản phẩm sau khuếch đại trên bảng thạch, nhuộm\r\nmàu DNA và quan sát dưới ánh sáng UV có bước sóng là 302 nm.

\r\n\r\n

4.2 Quy\r\ntrình phát hiện YHV bằng kỹ thuật RT-PCR cần qua năm giai đoạn kế tiếp nhau: tách\r\nchiết RNA; phiên mã ngược RNA thành cDNA; khuếch đại cDNA; điện di để phát hiện\r\ncDNA và đọc kết quả (xem thêm Phụ lục A).

\r\n\r\n

5. Thuốc\r\nthử và vật liệu thử

\r\n\r\n

Trong mọi\r\ntrường hợp, chỉ sử dụng các thuốc thử tinh khiết phân tích thích hợp cho các ứng\r\ndụng sinh học phân tử. Việc pha chế, bảo quản và sử dụng thuốc thử phải tuân\r\nthủ theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Nhìn chung, nên lấy lượng cần thiết vừa đủ\r\ncác dung dịch phản ứng cho phép thử PCR và bảo quản chúng trong điều kiện thích\r\nhợp.

\r\n\r\n

5.1 Mồi

\r\n\r\n

Mồi\r\nđặc hiệu của virut YHV sử dụng trong kỹ thuật RT-PCR một bước gồm có mồi xuôi\r\n(10F) và mồi ngược (144R) hoặc cặp mồi 273F/R. Trình tự mồi cụ thể như sau:

\r\n\r\n\r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n

\r\n Mồi \r\n	\r\n Trình tự \r\n	\r\n Sản phẩm \r\n
\r\n 10F \r\n	\r\n 5’-CCG-CTA-ATT-TCA-AAA-ACT-ACG-3’ \r\n	\r\n 135 bp \r\n
\r\n 144R \r\n	\r\n 5’-AAG-GTG-TTA-TGT-CGA-GGA-AGT-3’ \r\n

\r\n\r\n

Hoặc

\r\n\r\n\r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n

\r\n Mồi \r\n	\r\n Trình tự \r\n	\r\n Sản phẩm \r\n
\r\n  273F \r\n	\r\n 5’-CAA-GAT-CTC-ACG-GCA-ACT-CA-3’ \r\n	\r\n 273 bp \r\n
\r\n  273R \r\n	\r\n 5’-CCG-ACG-AGA-GTG-TTA-GGA-GG-3’ \r\n

\r\n\r\n

Nồng\r\nđộ của mồi sử dụng trong phân tích được pha loãng thành 25 mM trong dung dịch\r\nđệm TE. Ðệm TE có thành phần như sau: Tris-HCl 10 mM (pH 8,0) và EDTA 1 mM.

\r\n\r\n

Khi\r\nsử dụng cặp mồi 273F/R, thành phần hóa chất cho phản ứng PCR cũng như điều kiện\r\nkhuếch đại PCR xem Phụ lục B.

\r\n\r\n

5.2 Thuốc\r\nthử tách chiết RNA

\r\n\r\n

5.2.1 Dung dịch đệm\r\nly giải/đệm liên kết mô

\r\n\r\n

Dung dịch chứa\r\nguanidin-HCl 4,5 M, natri phosphat 100 mM, có pH 6,6. Bảo quản ở 25 ⁰C.

\r\n\r\n

5.2.2 DNaza I

\r\n\r\n

Chuẩn bị dung dịch\r\nDNaza I gồm enzym DNaza 5 U/µl và dung dịch đệm rửa giải (5.2.6). Trộn kỹ, bảo\r\nquản ở –15 ^oC đến –25 ^oC.

\r\n\r\n

5.2.3 Dung dịch đệm ủ\r\nDNaza

\r\n\r\n

Dung dịch chứa\r\nNaCl 1 M, Tris-HCl 20 mM, MnCl₂ 10 mM, có pH 7,0. Bảo quản ở 25 ^oC.

\r\n\r\n

5.2.4 Dung dịch đệm\r\nrửa I

\r\n\r\n

Chuẩn bị dung dịch\r\nchứa guanidin-HCl 5 M và Tris-HCl 20 mM, có pH 6,6. Thêm vào 20 ml\r\netanol tinh khiết. Bảo quản ở 25 ^oC.

\r\n\r\n

5.2.5 Dung dịch đệm\r\nrửa II

\r\n\r\n

Chuẩn bị dung dịch\r\nchứa NaCl 20 mM, Tris-HCl 2 mM, có pH 7,5. Thêm vào 40 ml etanol\r\ntinh khiết Bảo quản ở 25 ^oC.

\r\n\r\n

5.2.6 Dung\r\ndịch đệm rửa giải: nước cất hai lần.

\r\n\r\n

CHÚ\r\nTHÍCH Có nhiều quy trình khác nhau để tách chiết RNA từ mô động vật. Tuy nhiên\r\nđể đạt được kết quả mong muốn có thể sử dụng một số bộ chế phẩm tách chiết RNA\r\nthương mại có bán sẵn.

\r\n\r\n

Nên\r\nsử dụng thuốc thử và các sản phẩm dùng cho phản ứng khuếch đại PCR được tổng\r\nhợp thành bộ chế phẩm đang được lưu hành trên thị trường có thành phần phù hợp\r\nnhư trên.

\r\n\r\n

5.3 Pha chế\r\ndung dịch đệm TE (dùng để pha loãng cặn RNA)

\r\n\r\n

Hòa tan Tris\r\n10 mM với EDTA 1 mM, chỉnh pH về giá trị 7,6 bằng dung dịch HCl.

\r\n\r\n

5.4 Hỗn hợp\r\nphản ứng khuếch đại PCR (Master mix)

\r\n\r\n

Có thể sử\r\ndụng hỗn hợp phản ứng PCR được cung cấp sẵn trên thị trường.

\r\n\r\n

5.5 Thang DNA

\r\n\r\n

Sử\r\ndụng thang đo phù hợp có thể ước lượng được đoạn khuếch đại 135 bp hoặc 273 bp.\r\nCó thể sử dụng sản phẩm khuếch đại có kích thước 135 bp hoặc 273 bp đã biết\r\ntrước.

\r\n\r\n

5.6 Pha chế\r\nmột số hoá chất điện di

\r\n\r\n

5.6.1\r\nDung dịch đệm TBE đậm đặc 10 lần (Tris - axit boric - EDTA đậm đặc 10\r\nlần)\r\n

\r\n\r\n

Hòa\r\ntan 108 g Tris và 55 g axit boric trong 600 ml nước. Sau đó, thêm 40 ml EDTA\r\n0,5 M và thêm nước cho đủ 1 l. Hấp vô trùng ở 121 ^oC trong 15 min.\r\nBảo quản ở nhiệt độ phòng. Khi sử dụng mới pha loãng với nước cất vô trùng\r\nthành dung dịch đậm đặc 0,5 lần.

\r\n\r\n

5.6.2\r\nEDTA (etylen\r\ndiamin tetra axetic) 0,5 M

\r\n\r\n

Hòa tan 93,05 g EDTA trong 350 ml nước rồi chỉnh cho dung\r\ndịch có pH 8,0 bằng dung dịch NaOH nồng độ 4 M. Sau đó, thêm nước cất cho đủ\r\n500 ml. Tiến hành hấp vô trùng và bảo quản ở nhiệt độ phòng.

\r\n\r\n

5.6.3\r\nDung dịch đệm tải mẫu DNA đậm đặc 6 lần

\r\n\r\n

Hoà\r\ntan các thành phần: Tris-HCl 10 mM (pH 7,6); bromophenol blue 0,03 %; xylen\r\nxyanol FF 0,03 %; glycerol 60 % và EDTA 60 mM.

\r\n\r\n

5.6.4 Dung\r\ndịch diethypyrocarbonat (DEPC)

\r\n\r\n

Trộn 0,1 %\r\n(phần thể tích) dietypyrocarbonat vào nước, lắc khoảng 10 min. Sau đó để qua\r\nđêm trong bình kín, nới lỏng nắp và hấp khử trùng ở 121 ⁰C trong 15\r\nmin.

\r\n\r\n

5.6.5 Tạo\r\nbảng thạch 1,5 % (Gel agaroza 1,5 %)

\r\n\r\n

5.6.5.1 Tạo\r\nbảng thạch 1,5 %

\r\n\r\n

Đun tan hoàn\r\ntoàn 1,5 g agaroza trong 100 ml dung dịch đệm TBE đậm đặc 0,5 lần. Để nguội ở\r\nnhiệt độ phòng khoảng 10 min (đạt 55 °C đến 60 °C).

\r\n\r\n

5.6.5.2 Dung dịch etidi bromua nồng độ 10 mg/ml

\r\n\r\n

5.6.5.3 Nhuộm\r\ntrong

\r\n\r\n

Chuyển agaroza vừa đun vào một chai chuyên\r\ndùng để pha etidi bromua, sau đó cho vào 4ml etidi bromua 10 mg/ml\r\n(cho 4 ml etidi bromua 10 mg/ml\r\nvào 100 ml dung dịch agaroza), trộn đều (tránh tạo bọt khí). Chuẩn bị khuôn, cân bằng mặt khuôn bằng giọt\r\nnước, gắn lược vào khuôn, sau đó đổ agaroza vào khuôn đạt độ dày khoảng 3 mm đến 5 mm. Để đông tự nhiên ở nhiệt độ\r\nphòng. Gỡ lược, đặt bảng thạch vào\r\ntrong máng điện di, các giếng của bảng thạch phải ở phía gần điện cực âm. Đổ\r\ndung dịch TBE đậm đặc 0,5 lần cho đến khi ngập bảng thạch trước khi cho mẫu vào\r\nđể điện di.

\r\n\r\n

5.6.5.4 Nhuộm\r\nngoài

\r\n\r\n

Sau\r\nkhi điện di, ngâm bảng thạch vào dung dịch\r\netidi bromua 10 mg/ml (5 µl hoà tan trong 100ml nước cất). Dung dịch này phải bao phủ toàn bộ bảng\r\nthạch. Lắc nhẹ trong khoảng 20 min. Sau đó, vớt bảng thạch ra khỏi dung dịch\r\nnhuộm, rửa với nước cất trong 10 min để loại bỏ dung dịch nhuộm còn dư trên bề\r\nmặt bảng thạch.

\r\n\r\n

6.\r\nThiết bị và dụng cụ

\r\n\r\n

Sử dụng các\r\nthiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm vi sinh thông thường và cụ thể như\r\nsau:

\r\n\r\n

6.1\r\nBộ nghiền mẫu vô trùng.

\r\n\r\n

6.2 Máy ly\r\ntâm, có\r\nthể hoạt động với tốc độ tối đa trên 12 000 r/min.

\r\n\r\n

6.3 Máy luân nhiệt.

\r\n\r\n

6.4 Bộ điện\r\ndi, gồm\r\nnguồn và buồng điện di.

\r\n\r\n

6.5 Bàn đọc\r\nkết quả, với\r\ntia UV bước sóng 302 nm, hoặc bộ phận chụp ảnh để lưu kết quả.

\r\n\r\n

6.6 Micropipet,\r\ndung\r\ntích 10 µl; 20 µl; 100 µl; 1000 µl.

\r\n\r\n

6.7 Ống\r\nnghiệm đáy côn (ống Eppendorf), dung tích 1,5 ml và 0,2 ml.

\r\n\r\n

6.8 Ðầu típ\r\ncác loại,\r\ncó đầu lọc với thể tích không lớn hơn 10 µl.

\r\n\r\n

6.9 Khuôn,\r\nkhay, lược\r\ndùng để tạo bảng thạch.

\r\n\r\n

6.10 Ống lọc\r\ntinh, có 2 lớp màng lọc, có thể chứa 700 µl dịch mẫu.

\r\n\r\n

6.11 Ống góp,\r\ndùng bọc ngoài ống lọc tinh.

\r\n\r\n

7. Cách tiến hành

\r\n\r\n

7.1\r\nChuẩn bị mẫu

\r\n\r\n

7.1.1 Đối với\r\nmẫu tôm hậu ấu trùng

\r\n\r\n

Lượng mẫu\r\ndùng cho mỗi phản ứng từ 10 cá thể đến 30 cá thể. Đối với tôm hậu ấu trùng 11\r\nngày tuổi trở lên loại bỏ đầu.

\r\n\r\n

7.1.2 Đối với\r\nmẫu tôm bố mẹ\r\n

\r\n\r\n

Lượng mẫu\r\ndùng cho mỗi phản ứng từ 100 mg đến 200 mg cuống mắt hoặc một phần chân bơi.

\r\n\r\n

7.1.3 Đối với\r\nmẫu tôm thương phẩm

\r\n\r\n

Lượng mẫu\r\ndùng cho mỗi phản ứng từ 100 mg đến 200 mg phiến mang tôm, chân bơi, chân bò,\r\ncơ hoặc khoảng 100 µl dịch bạch huyết của tôm.

\r\n\r\n

7.1.4 Yêu cầu\r\nđối với mẫu để phân tích

\r\n\r\n

Mẫu tôm còn\r\nsống và bảo quản trong cồn 95 % ngay sau khi lấy. Thể tích cồn sử dụng để bảo\r\nquản không nên nhỏ hơn 3 lần thể tích mẫu cần phân tích. Sau khi cố định, mẫu\r\nđược lưu giữ ở nhiệt độ từ 25 ⁰C đến 30 ⁰C trong 1 tuần.\r\nKhi cần bảo quản mẫu lâu hơn nữa phải thay cồn mới.

\r\n\r\n

7.2\r\nTách chiết RNA

\r\n\r\n

7.2.1 Cho khoảng\r\n100 mg đến 200 mg mẫu tôm (7.1) vào ống nghiệm có đáy côn có thể tích 1,5 ml\r\n(Eppendorf), thêm 400 µl dung dịch tách chiết RNA (5.2.1).

\r\n\r\n

7.2.2 Nghiền mẫu\r\nbằng chày nghiền vô trùng, ly tâm lạnh với tốc độ 13 000\r\nr/min trong 2 min, sử dụng phần dịch nổi phía trên.

\r\n\r\n

7.2.3 Bổ sung\r\n200 µl etanol tinh khiết vào dịch nổi thu được, trộn đều.

\r\n\r\n

7.2.4 Chuyển\r\ntoàn bộ phần dịch nổi thu được (thể tích tối đa 700 µl) sang các ống lọc tinh\r\ncó gắn ống góp.

\r\n\r\n

7.2.5 Ly tâm lạnh\r\nvới tốc độ 13 000 r/min trong 30 s.

\r\n\r\n

7.2.6 Bỏ ống góp\r\nchứa phần dung dịch thu được và thay thế bằng ống góp mới.

\r\n\r\n

7.2.7 Thêm 90 µl dung dịch đệm\r\nủ DNaza (5.2.3) và 10 µl DNaza I (5.2.2) vào các ống lọc tinh, ủ 15 min\r\nở nhiệt độ phòng.

\r\n\r\n

7.2.8 Thêm 500 µl dung dịch\r\nđệm rửa I (5.2.4) vào các ống lọc tinh, ly tâm các ống với tốc độ 8 000 r/min trong 15 s,\r\nbỏ ống góp chứa phần dung dịch thu được và thay thế bằng ống góp mới.

\r\n\r\n

7.2.9 Bổ sung 500 µl dung dịch\r\nđệm rửa II (5.2.5) vào các ống lọc tinh, ly tâm các ống với tốc độ 8 000 r/min trong 15 s,\r\nbỏ ống góp chứa phần dung dịch thu được và thay thế bằng ống góp mới.

\r\n\r\n

7.2.10 Thêm 300 µl dung dịch đệm rửa II\r\n(5.2.5) vào các ống lọc tinh, ly tâm các ống với tốc độ 13 000 r/min trong 2 min,\r\nbỏ ống góp chứa phần dung dịch thu được và thay thế bằng ống góp mới.

\r\n\r\n

7.2.11 Gắn\r\ncác ống lọc tinh vào một ống nghiệm có đáy côn 1,5 ml khác.

\r\n\r\n

7.2.12 Bổ sung 100 µl dung dịch đệm rửa\r\n(5.2.6) vào các ống lọc tinh, ly tâm các ống với tốc độ 8 000 r/min trong\r\n1 min. Loại bỏ các ống lọc tinh, sản phẩm RNA được chứa trong các ống nghiệm có\r\nđáy côn 1,5 ml.

\r\n\r\n

Sử dụng\r\nphần dịch RNA thu được để chạy RT-PCR hoặc giữ lạnh ở –20 ^oC chờ\r\nthực hiện bước kế tiếp.

\r\n\r\n

7.3\r\nKhuếch đại RNA bằng kỹ thuật RT-PCR

\r\n\r\n

Để đảm bảo\r\nkết quả phân tích có độ tin cậy cao nên quá trình khuếch đại RNA cần chuẩn bị\r\nđầy đủ các yếu tố sau:

\r\n\r\n

a) RNA của\r\nmẫu đã biết trước không có virut YHV;

\r\n\r\n

b) RNA của\r\nmẫu đã biết trước dương tính YHV (bao gồm mẫu mô, máu hoặc plasmid); RNA mẫu\r\ntrắng (nước cất hai lần).

\r\n\r\n

Phản ứng\r\nPCR gồm phiên mã ngược một đoạn RNA thành cDNA, sau đó khuếch đại đoạn cDNA của\r\nYHV dựa trên các cặp mồi đặc hiệu (5.1).

\r\n\r\n

7.3.1 Phiên mã ngược RNA thành cDNA

\r\n\r\n

Cho 2 µl\r\nRNA ly trích từ mẫu vào 20 µl dung dịch đệm PCR (Tris/HCl 10 mM, có pH 8,3, KCl\r\n50 mM) chứa 2,5 U enzym phiên mã ngược M-MLV (Moloney murine leukaemia virus),\r\n1,0 U chất ức chế ribonucleaza, mồi ngược 0,75 μM (144R),\r\ndATP 1 mM, dTTP 1 mM, dCTP 1 mM, dGTP 1 mM và MgCl_2\r\n5 mM. Sau đó đem ủ ở 42 ⁰C trong 15 min để tổng hợp thành\r\ncDNA. Tiếp tục ủ hỗn hợp ở 100 ⁰C trong 5 min để làm bất hoạt\r\nenzym phiên mã ngược. Sau đó có thể làm lạnh về 5 ⁰C để chờ phân\r\ntích các bước tiếp theo.

\r\n\r\n

7.3.1.1 Mẫu\r\nthử

\r\n\r\n

2 µl dịch\r\nchiết RNA cho vào một ống chứa hỗn hợp phản ứng RT-PCR (5.4).

\r\n\r\n

7.3.1.2 Mẫu\r\nkiểm chứng dương tính

\r\n\r\n

2 µl mẫu\r\nkiểm chứng dương tính cho vào một ống chứa hỗn hợp phản ứng RT-PCR (5.4).

\r\n\r\n

7.3.1.3 Mẫu\r\nkiểm chứng âm tính

\r\n\r\n

2 µl mẫu\r\nkiểm chứng âm tính cho vào một ống chứa hỗn hợp phản ứng RT-PCR (5.4).

\r\n\r\n

7.3.2 Khuếch\r\nđại cDNA

\r\n\r\n

Thêm vào\r\nhỗn hợp đã phiên mã ngược RNA thành cDNA 78 ml dung dịch đệm PCR\r\n(Tris-HCl 10 mM, có pH 8,3, KCl 50 mM) chứa 2,5 U Taq DNA polymeraza,\r\nMgCl₂ 2 mM và mồi xuôi 0,75 μM (10F).

\r\n\r\n

7.3.3 Khuếch\r\nđại phản ứng PCR

\r\n\r\n

Sau\r\nkhi cho dịch tách chiết mẫu, mẫu kiểm chứng dương tính, mẫu kiểm chứng âm tính\r\nvào ống chứa hỗn hợp phản ứng PCR đã được đánh dấu, đậy nắp ống thật chặt, ly\r\ntâm nhẹ để dung dịch tụ hết xuống đáy ống không còn dính trên thành ống. Đặt\r\ncác ống phản ứng PCR vào máy luân nhiệt thực hiện phản ứng theo chương trình\r\nsau:

\r\n\r\n\r\n\r\n

Giữ ở 4 ^oC\r\ncho đến khi phân tích.

\r\n\r\n

7.4 Điện di

\r\n\r\n

7.4.1\r\nCho từ 5 µl đến 7 µl dung dịch đệm tải mẫu (5.6.3) vào các ống sản phẩm khuếch\r\nđại (7.3.3), trộn đều.

\r\n\r\n

7.4.2 Hút khoảng 5 ml đến 7 ml từ các ống (7.4.1): mẫu kiểm chứng âm tính, mẫu kiểm\r\nchứng dương tính, thang DNA chuẩn, các mẫu vào mỗi giếng trên bảng thạch. Trình\r\ntự hút mẫu cho vào giếng: mẫu kiểm chứng âm tính, mẫu thử, mẫu kiểm chứng dương\r\ntính, thang DNA chuẩn.

\r\n\r\n

7.4.3 Điện di ở hiệu điện\r\nthế 100 V đến 120 V. Sau khi nối điện, quan sát bong bóng khí từ hai phía của\r\nđiện cực.

\r\n\r\n

CHÚ THÍCH Dung dịch\r\nđệm tải mẫu gồm hai thành phần màu: màu xanh đậm là chỉ thị bromphenol blue;\r\nmàu xanh nhạt là chỉ thị xylene cyanol. Khi quan sát thấy màu xanh đậm của\r\nthuốc nhuộm cách giếng khoảng 2/3 chiều dài bảng gel agaroza, dừng quá trình\r\nđiện di.

\r\n\r\n

Để\r\nđảm bảo kết quả phân tích có độ tin cậy cao, cần tiến hành điện di mẫu kiểm\r\nchứng âm tính, mẫu kiểm chứng dương tính, thang DNA chuẩn, mẫu phân tích.

\r\n\r\n

7.4.4 Nhuộm etidi\r\nbromua bảng thạch (chỉ\r\náp dụng cho nhuộm ngoài)

\r\n\r\n

Xem 5.6.5.4.

\r\n\r\n

7.5 Đọc kết quả

\r\n\r\n

7.5.1 Đọc kết quả

\r\n\r\n

7.5.1.1 Đọc kết quả\r\nbằng mắt thường

\r\n\r\n

Đặt bảng gel vào máy\r\nđọc UV đã được lắp kính chắn. Bật đèn UV. Dưới ánh sáng của tia UV, các đoạn\r\nDNA có etidi bromua chèn giữa 2 mạch sẽ phát quang tạo thành vạch sáng.

\r\n\r\n

7.5.1.2 Đọc kết quả bằng\r\nthiết bị chuyên dùng (Gel-Doc)

\r\n\r\n

Để bảng thạch vào\r\nbuồng đọc và\r\nđọc theo chương trình được cài sẵn trong máy tính.

\r\n\r\n

7.5.2 Đối chiếu các vạch\r\nsáng của mẫu với các vạch sáng từ chuẩn đối mẫu kiểm chứng dương tính, mẫu kiểm\r\nchứng âm tính và thang DNA để đưa ra kết luận.

\r\n\r\n

7.5.3 Cách đọc kết\r\nquả

\r\n\r\n

Đọc\r\nkết quả điện di theo trình tự như sau:

\r\n\r\n\r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n

\r\n Kết quả điện di \r\n
\r\n Giếng \r\n	\r\n Vạch 135 bp \r\n	\r\n Kết quả \r\n
\r\n Thang DNA \r\n	\r\n Phân vạch rõ ràng,\r\n sáng, theo kích thước của thang \r\n	\r\n Điện di tốt \r\n
\r\n Mẫu kiểm chứng dương tính [+] \r\n	\r\n Có \r\n	\r\n Hỗn hợp phản ứng\r\n PCR tốt \r\n
	\r\n Không \r\n	\r\n Mẫu kiểm chứng\r\n dương tính hỏng, enzym hỏng \r\n
\r\n Mẫu kiểm chứng âm tính [-] \r\n	\r\n Không \r\n	\r\n Không ngoại nhiễm \r\n
	\r\n Có \r\n	\r\n Bị ngoại nhiễm \r\n
\r\n Mẫu thử \r\n	\r\n Có \r\n	\r\n Có YHV \r\n
	\r\n Không \r\n	\r\n Không có YHV \r\n

\r\n\r\n

8. Diễn giải kết quả

\r\n\r\n

Theo\r\nphần diễn giải các kết quả, ghi lại phát hiện hoặc không phát hiện virut YHV\r\ntrong phần mẫu thử.

\r\n\r\n

8.1\r\nKết\r\nquả âm\r\ntính

\r\n\r\n

Kết\r\nquả được coi là âm tính khi:

\r\n\r\n

–\r\nphát hiện vạch sáng của mẫu kiểm chứng dương tính;

\r\n\r\n

–\r\nkhông phát hiện vạch sáng của mẫu kiểm chứng âm tính;

\r\n\r\n

–\r\nthang DNA phân vạch rõ ràng theo kích thước sử dụng.

\r\n\r\n

–\r\nmẫu phân tích không có vạch DNA đích.

\r\n\r\n

8.2\r\nKết\r\nquả dương\r\ntính

\r\n\r\n

Kết\r\nquả được coi là dương tính:

\r\n\r\n

–\r\nphát hiện vạch sáng của mẫu kiểm chứng dương tính;

\r\n\r\n

–\r\nkhông phát hiện vạch sáng của mẫu kiểm chứng âm tính;

\r\n\r\n

–\r\nthang DNA phân vạch rõ ràng theo kích thước sử dụng.

\r\n\r\n

–\r\nmẫu phân tích xuất hiện vạch DNA đích.

\r\n\r\n

8.3\r\nKết\r\nquả nghi\r\nngờ

\r\n\r\n

Khi\r\nthử nghiệm cho kết quả nghi ngờ (không phát hiện vạch sáng ở mẫu kiểm chứng\r\ndương tính, phát hiện vạch sáng của mẫu kiểm chứng âm tính hoặc thang DNA không\r\nphân vạch rõ ràng...), thì phải tiến hành phân tích lại.

\r\n\r\n

9. Báo cáo thử nghiệm

\r\n\r\n

Báo cáo thử nghiệm\r\nphải ghi rõ:

\r\n\r\n

– thông tin cần thiết\r\nđể nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

\r\n\r\n

– phương pháp lấy mẫu\r\nđã sử dụng (nếu có);

\r\n\r\n

– phương pháp thử sử\r\ndụng;

\r\n\r\n

– chi tiết thao tác\r\nkhông quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc tùy ý lựa chọn, cùng với các chi tiết\r\nbất thường khác có thể ảnh hưởng tới kết quả (nếu có);

\r\n\r\n

– kết quả thử nghiệm\r\nthu được;

\r\n\r\n

–\r\nbáo cáo kết quả cũng phải nêu rõ nếu các phép thử tiếp theo được thực hiện bởi\r\nphòng thử nghiệm chuẩn, hoặc nếu đã thực hiện thì nêu kết quả thu được.

\r\n\r\n

\r\n\r\n

 

\r\n\r\n

Phụ\r\nlục B

\r\n\r\n

(Tham\r\nkhảo)

\r\n\r\n

Thành\r\nphần cho phản ứng RT-PCR và điều kiện khuếch đại PCR khi sử dụng cặp mồi 273F/R

\r\n\r\n

B.1 Thành phần\r\ncho phản ứng PCR

\r\n\r\n

B.1.1 Thành phần

\r\n\r\n\r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n \r\n

\r\n Thuốc thử \r\n	\r\n 25 ml /phản ứng \r\n	\r\n Nồng độ cuối cùng \r\n
\r\n Nước cất hai lần \r\n	\r\n 6,5 ml \r\n	\r\n   \r\n
\r\n Dung dịch đệm EZ\r\n đậm đặc 5 lần \r\n	\r\n 5,0 ml \r\n	\r\n Đậm đặc 1 lần \r\n
\r\n Hỗn hợp dNTP (10 mM\r\n cho mỗi loại) \r\n	\r\n 3,0 ml \r\n	\r\n 300 mM cho mỗi loại \r\n
\r\n Mồi 273F \r\n	\r\n 1,0 ml \r\n	\r\n 0,62 mM \r\n
\r\n Mồi 273R \r\n	\r\n 1,0 ml \r\n	\r\n 0,62 mM \r\n
\r\n Mn(OA)2 \r\n	\r\n 2,5 ml \r\n	\r\n 2,5 mM \r\n
\r\n Enzyme rTth \r\n	\r\n 1,0 ml \r\n	\r\n 2,5 U \r\n
\r\n Mẫu thử \r\n	\r\n 5,0 ml \r\n	\r\n nhỏ hơn 50 ng \r\n

\r\n\r\n

B.1.2 Mẫu

\r\n\r\n

5 µl dịch chiết RNA\r\ncho vào một ống chứa hỗn hợp phản ứng RT-PCR (B.1.1).

\r\n\r\n

B.1.3 Mẫu kiểm chứng\r\ndương tính

\r\n\r\n

5 µl mẫu kiểm chứng\r\ndương tính cho vào một ống chứa hỗn hợp phản ứng RT-PCR (B.1.1).

\r\n\r\n

B.1.4 Mẫu kiểm chứng\r\nâm tính

\r\n\r\n

5 µl mẫu kiểm chứng\r\nâm tính cho vào một ống chứa hỗn hợp phản ứng RT-PCR (B.1.1).

\r\n\r\n

B.2 Khuếch đại PCR

\r\n\r\n

Sau khi cho\r\ndịch tách chiết mẫu, mẫu kiểm chứng dương tính, mẫu kiểm chứng âm tính vào ống\r\nchứa hỗn hợp phản ứng PCR đã được đánh dấu, đậy nắp ống thật chặt, ly tâm nhẹ\r\nđể dung dịch tụ hết xuống đáy ống không còn dính trên thành ống. Đặt các ống phản ứng PCR\r\nvào máy luân nhiệt thực hiện phản ứng theo chương trình sau:

\r\n\r\n\r\n\r\n

Giữ ở 4 ^oC cho đến khi phân\r\ntích.

\r\n\r\n

\r\n\r\n

 

\r\n\r\n