1.1. Tiêu chuẩn này qui định hai phương pháp xác\r\nđịnh aflatoxin B1 trong thức ăn chăn nuôi. Các phương pháp này chỉ\r\ncó thể dùng để xác định bán định lượng.
\r\n\r\n1.2. Phương pháp A
- Các hạt có dầu và khô dầu của chúng, cụ thể\r\nlà hạt lạc, cùi dừa khô, hạt lanh, hạt đậu tương, hạt cọ babassu;
\r\n\r\n- Bột sắn;
\r\n\r\n- Mầm ngô;
\r\n\r\n- Ngũ cốc và các sản phẩm ngũ cốc;
\r\n\r\n- Bột đậu;
\r\n\r\n- Bã khoai tây và bột khoai tây.
\r\n\r\nKhi có mặt chất gây cản trở phép xác định\r\ntheo phương pháp A, thì nên tiến hành xác định theo phương pháp B.
\r\n\r\n1.3. Phương pháp B
Phương pháp này không áp dụng cho thức ăn\r\nchứa bã ép của cam, chanh.
\r\n\r\n\r\n\r\nCác tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết\r\ncho việc áp dụng tiêu chuẩn. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm ban hành thì\r\náp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm ban\r\nhành thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi.
\r\n\r\nTCVN 6952:2001 (ISO 6498:1998), Thức ăn chăn\r\nnuôi – Chuẩn bị mẫu thử.
\r\n\r\n\r\n\r\nPhần mẫu thử được chiết bằng cloroform sau đó\r\nlọc. Phần dịch lọc được làm sạch trên cột silica gel.
\r\n\r\nDịch rửa giải được làm bay hơi và cặn được\r\nhòa tan trong một thể tích qui định của cloroform hoặc hỗn hợp benzen và\r\naxetonitril.
\r\n\r\nCho chạy sắc ký lớp mỏng một chiều đối với\r\nphương pháp A và sắc ký hai chiều đối với phương pháp B trên một phần dung dịch\r\nnày.
\r\n\r\nXác định hàm lượng aflatoxin B1\r\nbằng mắt hoặc bằng đo huỳnh quang, bằng cách kiểm tra sắc ký đồ dưới ánh sáng\r\ntử ngoại và so sánh với aflatoxin B1 chuẩn đã biết trước nồng độ\r\nđược chấm trên cùng một tấm với dịch chiết của phần mẫu thử.
\r\n\r\nViệc hình thành dẫn xuất hemiaxetal khẳng\r\nđịnh sự có mặt của aflatoxin B1.
\r\n\r\n\r\n\r\nChỉ sử dụng các thuốc thử tinh khiết phân\r\ntích, và nước cất hoặc nước đã khử ion hoặc nước ít nhất có độ tinh khiết tương\r\nđương.
\r\n\r\n4.1. Cloroform,
4.2. n-Hexan.
\r\n\r\n4.3. Ete dietyl,
4.4. Benzen/axetonitril,
Trộn 98 thể tích benzen với 2 thể tích\r\naxetonitril.
\r\n\r\n4.5. Cloroform/metanol,
Trộn 97 thể tích cloroform với 3 thể tích metanol.
\r\n\r\n4.6. Dung môi khai triển (developing\r\nsolvents).
\r\n\r\nCác dung môi phải được đựng trongbình có nắp\r\nđậy. Khi qui định dùng bình bão hòa, thì những bình này được lót bằng giấy hút\r\nẩm và để cho phần trong bình bão hòa hơi dung môi.
\r\n\r\n4.6.1. Cloroform/axeton,
Trộn 90 thể tích cloroform với 10 thể tích\r\naxeton trong bình chưa bão hòa.
\r\n\r\n4.6.2. Ete dietyl/metanol/nước,
Trộn 96 thể tích ete dietyl với 3 thể tích\r\nmetanol và 1 thể tích nước trong bình chưa bão hòa.
\r\n\r\n4.6.3. Ete dietyl/metanol/nước,
Trộn 94 thể tích ete dietyl với 4,5 thể tích\r\nmetanol và 1,5 thể tích nước trong bình đã bão hòa.
\r\n\r\n4.6.4. Cloroform/metanol,
Trộn 94 thể tích cloroform với 6 thể tích\r\nmetanol trong bình đã bão hòa.
\r\n\r\n4.6.5. Cloroform/metanol,
Trộn 97 thể tích cloroform với 3 thể tích\r\nmetanol trong bình đã bão hòa.
\r\n\r\n4.7. Silica gel,
4.8. Silica gel,
4.9. Diatomit
4.10. Natri sunfat,
4.11. Axit trifluoroaxetic.
\r\n\r\n4.12. Khí trơ,
4.13. Axit sulfuric,
4.14. Aflatoxin B1,
CẢNH BÁO – Aflatoxin là chất gây ung thư do\r\nvậy phải được bảo quản hết sức cẩn thận.
\r\n\r\nChuẩn bị và kiểm tra dung dịch như sau:
\r\n\r\n4.14.1. Chuẩn bị dung dịch gốc và xác định\r\nnồng độ
\r\n\r\nChuẩn bị dung dịch aflatoxin B1\r\ntrong cloroform (4.1) hoặc trong hỗn hợp benzen/axetonitril (4.4) sao cho có\r\nnồng độ khoảng từ 8 m
Đo độ hấp thụ (A) tại bước sóng 363 nm\r\nđối với dung dịch cloroform hoặc tại bước sóng 348 nm đối với dung dịch hỗn hợp\r\nbenzen/axetonitril.
\r\n\r\nTính nồng độ aflatoxin B1 của dung\r\ndịch, tính bằng microgam trên lít dung dịch, theo công thức sau đây:
\r\n\r\na) Đối với dung dịch cloroform
\r\n\r\nb) Đối với dung dịch hỗn hợp benzen/axetonitril
\r\n\r\n4.14.2. Pha loãng
\r\n\r\nPha loãng dung dịch gốc (4.14.1) thích hợp,\r\ntránh ánh sáng mặt trời, để thu được dung dịch chuẩn có nồng độ aflatoxin B1\r\nkhoảng 0,1 m
Dung dịch có thể giữ trong 2 tuần nếu bảo\r\nquản trong tủ lạnh ở 4 oC.
\r\n\r\n4.14.3. Kiểm tra độ tinh khiết sắc ký của\r\ndung dịch
\r\n\r\nTrên tấm sắc ký (5.7) chấm một điểm 5
4.15. Aflatoxin B1 và B2\r\n(xem\r\ncảnh báo trong 4.14) các dung dịch dùng để kiểm tra định tính chứa khoảng 0,1
Các nồng độ này chỉ dùng để tham khảo. Chúng\r\nphải được chỉnh sao cho thu được cường độ huỳnh quang giống nhau đối với cả hai\r\nloại aflatoxin (xem 7.5.1).
\r\n\r\n\r\n\r\nSử dụng các thiết bị của phòng thử nghiệm\r\nthông thường và cụ thể như sau:
\r\n\r\n5.1. Máy nghiền/trộn.
\r\n\r\n5.2. Sàng, có cỡ lỗ 1,0 mm.
\r\n\r\nVề chi tiết, xem ISO 565 1).
\r\n\r\n5.3. Máy lắc
5.4. Cột sắc ký,
5.5. Thiết bị cất quay chân không,
5.6. Thiết bị sắc ký lớp mỏng (TLC),
5.7. Các tấm TLC bằng thủy tinh,
Cho 30 g silica gel (4.8) vào bình nón, thêm\r\n60 ml nước, đậy nắp và lắc trong 1 phút. Phun đều huyền phù này lên các tấm\r\nkính sao cho thu được lớp dày đều 0,25 mm. Để khô trong không khí sau đó bảo\r\nquản trong bình hút ẩm có chứa silica gel. Khi sử dụng, hoạt hóa các tấm này\r\nbằng cách đặt trong tủ sấy ở 110 oC trong 1 giờ.
\r\n\r\nCó thể sử dụng các tấm silica gel phù hợp có\r\nsẵn, nếu chúng cho kết quả tương đương với kết quả của những tấm được chuẩn bị\r\nnhư đã nêu ở trên.
\r\n\r\n5.8. Đèn tử ngoại bước sóng dài
Cường độ phát ra sẽ giúp dễ dàng nhận ra điểm\r\n1,0 ng aflatoxin B1 trên tấm TLC ở cách đèn một khoảng 10 cm.
\r\n\r\nCẢNH BÁO – Ánh sáng tử ngoại rất nguy hiểm\r\nđối với mắt. Phải đeo kính bảo vệ.
\r\n\r\n5.9. Quang phổ kế,
5.10. Máy đo cường độ huỳnh quang
5.11. Giấy lọc gấp nếp.
\r\n\r\n5.12. Ống chia độ,
5.13. Bình nón,
5.14. Pipet,
5.15. Cân phân tích.
\r\n\r\n\r\n\r\nLấy mẫu phòng thử nghiệm từ vật liệu cần lấy\r\nmẫu theo tiêu chuẩn đối với từng loại vật liệu liên quan, trừ khi việc lấy mẫu\r\nđể xác định aflatoxin không nằm trong phạm vi áp dụng của tiêu chuẩn đó. Nếu\r\nkhông có tiêu chuẩn nào thích hợp, thì các bên liên quan phải thỏa thuận với\r\nnhau dựa theo các đặc tính của vật liệu cần lấy mẫu.
\r\n\r\n\r\n\r\n7.1. Chuẩn bị mẫu thử
\r\n\r\n7.1.1. Nếu mẫu chứa trên 5 % chất béo thì\r\nphải khử chất béo bằng xăng nhẹ trước khi nghiền.
\r\n\r\nTrong trường hợp này, các kết quả phân tích\r\nsẽ được biểu thị dưới dạng khối lượng của mẫu không khử chất béo.
\r\n\r\n7.1.2. Nghiền mẫu phòng thử nghiệm sao cho\r\nlọt hết qua sàng (5.2). Trộn kỹ. Xem TCVN 6952:2001 (ISO 6498:1998).
\r\n\r\n7.2. Phần mẫu thử
\r\n\r\nCân 50 g mẫu thử đã chuẩn bị, chính xác đến\r\n0,01 g, cho vào bình nón (5.13).
\r\n\r\n7.3. Chiết
\r\n\r\nCho 25 g diatomit (4.9), 25 ml nước và 250 ml\r\ncloroform (4.1) được đong chính xác bằng ống đong vào phần mẫu thử (7.2). Đậy\r\nnắp và lắc hoặc khuấy trong 30 phút bằng máy lắc hoặc máy khuấy từ (5.3). Lọc\r\nqua giấy lọc gấp nếp (5.11), chú ý loại bỏ 10 ml dịch lọc đầu tiên và thu lấy\r\nít nhất 50 ml dịch lọc tiếp theo.
\r\n\r\n7.4. Làm sạch cột
\r\n\r\n7.4.1. Chuẩn bị cột
\r\n\r\nĐổ cloroform (4.1) đến hai phần ba ống sắc ký\r\n(5.4) và thêm 5 g natri sunfat (4.10). Đảm bảo sao cho bề mặt natri sunfat được\r\nphẳng, sau đó từ từ thêm 10 g silica gel (4.7). Khuấy cẩn thận sau mỗi lần thêm\r\nsilica gel để loại bỏ bọt khí. Để yên trong 15 phút, sau đó cẩn thận cho 10 g\r\nnatri sunfat (4.10). Mở khóa và để cho dịch lỏng chảy xuống cho đến khi vừa\r\nngập bề mặt lớp natri sunfat. Vặn khóa lại.
\r\n\r\n7.4.2. Làm sạch
\r\n\r\nDùng pipet (5.14) chuyển 50 ml dịch lọc thu\r\nđược ở 7.3 vào bình nón 250 ml và thêm 100 ml n-hexan (4.2). Trộn đều và\r\nchuyển lượng hỗn hợp này vào cột, tráng hình bằng n-hexan. Mở khóa và\r\ncho dung dịch chảy với tốc độ dòng khoảng 8 ml/phút đến 12 ml/phút sao cho dung\r\ndịch ngập ngang bằng bề mặt trên lớp natri sunfat. Khóa vòi lại. Loại bỏ dịch\r\nlỏng thu được và rót 100 ml ete dietyl (4.3) lên cột. Mở khóa lại và để cho\r\ndịch lỏng chảy xuống đến khi ngập ngang bằng bề mặt lớp natri sunfat. Trong quá\r\ntrình này phải bảo đảm không để cột bị khô.
\r\n\r\nRửa giải bằng 150 ml hỗn hợp\r\ncloroform/metanol (4.5) và thu lấy toàn bộ dịch rửa giải vào bình 500 ml của\r\nmáy cất quay (5.5). Làm bay hơi đến khô trên máy cất quay, tốt nhất là dùng\r\ndòng khí trơ (4.12) ở nhiệt độ không quá 50 oC dưới áp suất thấp.
\r\n\r\nNếu không sẵn có máy cất quay thì thêm chất\r\ntrợ sôi và cho bay hơi hoàn toàn đến khô trong nồi cách thủy.
\r\n\r\nDùng cloroform (4.1) hoặc hỗn hợp\r\nbenzen/axetonitril (4.4) để chuyển lượng cặn vào ống chia độ 10 ml (5.12). Cho\r\ndung dịch bay hơi một lần nữa, ví dụ trên nồi cách thủy, tốt nhất là dùng dòng\r\nkhí trơ (4.12) và chỉnh thể tích đến 2,0 ml bằng cloroform (4.1) hoặc hỗn hợp\r\nbenzen/axetonitril (4.4).
\r\n\r\n7.5. Sắc ký lớp mỏng
\r\n\r\n7.5.1. Phương pháp A – Sắc ký lớp mỏng một\r\nchiều
\r\n\r\n7.5.1.1. Chọn dung môi
\r\n\r\nViệc chọn dung môi (4.6.1, 4.6.2, 4.6.3,\r\n4.6.4, hoặc 4.6.5) phải thực hiện trước để đảm bảo rằng các aflatoxin B1\r\nvà B2 được tách ra hoàn toàn khi chạy tấm sắc ký, điều này phụ thuộc\r\nvào các tấm được sử dụng.
\r\n\r\nChấm 25 ml\r\ndung dịch định tính (4.15) lên các tấm đã chuẩn bị sẵn (5.7) (mỗi tấm dùng cho\r\nmột dung môi cần kiểm tra).
\r\n\r\nTiến hành theo 7.5.1.2 để chạy sắc ký, cho\r\nbay hơi và chiếu ánh sáng bằng đèn tử ngoại.
\r\n\r\nVới dung môi thích hợp, thì sẽ tạo ra hai\r\nđiểm phân tách.
\r\n\r\n7.5.1.2. Cách tiến hành
\r\n\r\nDùng pipet mao quản hoặc microxyranh chấm các\r\nthể tích dung dịch chuẩn aflatoxin B1 lên tấm TLC (5.7) với các điểm\r\ncách mép 20 mm, cách nhau 20 mm và chấm dịch chiết dưới đây:
\r\n\r\n- 10 ml,\r\n15 m
- 10 ml\r\ndịch chiết thu được trong 7.4.2 và chấm chồng lên điểm 20
- 10 ml\r\nvà 20 m
Chạy sắc ký ở nơi tối với dung môi đã chọn\r\n(xem 7.5.1.1).
\r\n\r\nLấy tấm sắc ký ra khỏi bình, để dung môi bay\r\nhơi ở nơi tối, sau đó đem kiểm tra dưới ánh sáng tử ngoại, đặt tấm sắc ký cách\r\nđèn (5.8) 10 cm. Các vết aflatoxin B1 sẽ cho huỳnh quang màu xanh da\r\ntrời.
\r\n\r\n7.5.2. Phương pháp B – Sắc ký lớp mỏng hai\r\nchiều
\r\n\r\n7.5.2.1. Chấm các dung dịch
Kẻ hai đường thẳng trên tấm sắc ký (5.7) và\r\nsong song với hai cạnh tấm (một đường cách cạnh 50 mm, đường kia cách cạnh 60\r\nmm) để thiết lập giới hạn sự di chuyển của dung môi. Dùng pipet mao quản hoặc\r\nmicroxyranh chấm các dung dịch sau đây lên tấm sắc ký:
\r\n\r\n- Tại điểm A: 20
- Tại điểm B: 20
- Tại điểm C: 10
- Tại điểm D: 20
- Tại điểm E: 40
Làm khô dưới luồng không khí hoặc khí trơ\r\n(4.12). Các vết thu được phải có đường kính khoảng 5 mm.
\r\n\r\n7.5.2.2. Chạy sắc ký
Chạy sắc ký theo chiều I ở nơi tối, sử dụng\r\ndung môi khai triển (4.6.3) (lớp dung môi dày 1 cm trong bình đã bão hòa) cho\r\nđến khi dung môi chạm tới đường giới hạn. Lấy tấm sắc ký ra khỏi bình, để khô ở\r\nnơi tối nhiệt độ phòng ít nhất là 15 phút.
\r\n\r\n![](\"00903094_files/image003.gif\")
Sau đó chạy sắc ký theo chiều II ở nơi tối,\r\nsử dụng dung môi khai triển (4.6.1) (lớp dung môi dày 1 cm trong bình chưa bão\r\nhòa) đến khi dung môi chạm tới đường giới hạn. Lấy tấm sắc ký ra khỏi bình và\r\nđể khô ở nơi tối ở nhiệt độ môi trường.
\r\n\r\n7.5.2.3. Diễn giải về sắc phổ
Kiểm tra sắc phổ dưới ánh sáng tử ngoại, bằng\r\ncách đặt tấm sắc ký cách đèn (5.8) 10 cm. Xác định vị trí của các điểm huỳnh\r\nquang màu xanh da trời B, C, D và E của aflatoxin B1 từ dung dịch\r\nchuẩn và kẻ hai đường thẳng mờ đi qua các điểm này tạo thành các góc vuông với\r\nhướng chạy sắc ký. Giao điểm P của hai đường này điểm nghi ngờ của aflatoxin B1\r\ncó trong dịch chiết tại điểm chấm A (xem Hình 1). Tuy nhiên, vị trí thực của\r\nđiểm aflatoxin B1 có thể nằm tại điểm Q là giao điểm của hai đường\r\nkẻ ở trên tạo với nhau một góc khoảng 100o theo thứ tự đi qua điểm B\r\nvà điểm C.
\r\n\r\n![](\"00903094_files/image004.jpg\")
7.5.2.4. Sắc ký bổ sung
\r\n\r\nKẻ hai đường thẳng trên tấm sắc ký mới (5.7)\r\ngiao nhau và song song với hai cạnh của tấm sắc ký như Hình 1 và tại điểm A\r\nchấm 20 m
- Các vết aflatoxin B1 của dịch\r\nchiết và của dung dịch chuẩn phải trùng nhau, và
\r\n\r\n- Huỳnh quang tại điểm này phải mạnh hơn\r\nhuỳnh quang tại điểm aflatoxin B1 đã tiến hành ở điểm Q trên tấm thứ\r\nnhất.
\r\n\r\n7.6. Xác định
\r\n\r\n7.6.1. Xác định bằng mắt
\r\n\r\n7.6.1.1. Phương pháp A
\r\n\r\nXác định lượng aflatoxin B1 trong\r\ndịch chiết bằng cách so sánh cường độ huỳnh quang tại các điểm của dịch chiết\r\nvới cường độ huỳnh quang tại các điểm của dung dịch chuẩn. Dùng phép nội suy,\r\nnếu cần.
\r\n\r\nHuỳnh quang thu được của điểm dịch chiết chấm\r\nchồng lên dung dịch chuẩn phải mạnh hơn huỳnh quang của điểm 10
7.6.1.2. Phương pháp B
\r\n\r\nXác định lượng aflatoxin B1 trong\r\ndịch chiết bằng cách so sánh cường độ huỳnh quang của điểm dịch chiết với cường\r\nđộ huỳnh quang của các điểm dung dịch chuẩn C, D và E. Dùng phép nội suy, nếu\r\ncần.
\r\n\r\nNếu cường độ huỳnh quang của điểm 20
7.6.2. Đo cường độ huỳnh quang
\r\n\r\nĐo cường độ huỳnh quang của điểm aflatoxin B1\r\nbằng máy đo cường độ huỳnh quang (5.10) tại bước sóng kích thích là 365 nm và\r\nbước sóng phát xạ là 443 nm.
\r\n\r\nĐối với phương pháp A, xác định lượng\r\naflatoxin B1 trong các điểm dịch chiết bằng cách so sánh cường độ\r\nhuỳnh quang của các điểm dịch chiết với cường độ huỳnh quang của các điểm dung dịch\r\nchuẩn, và đối với phương pháp B, thì xác định hàm lượng aflatoxin B1\r\ncủa điểm dịch chiết bằng cách so sánh cường độ huỳnh quang của điểm dịch chiết\r\nvới cường độ huỳnh quang của các điểm dung dịch chuẩn C, D và E.
\r\n\r\n7.7. Khẳng định sự có mặt của aflatoxin B1
\r\n\r\n7.7.1. Yêu cầu chung
\r\n\r\nKhẳng định sự nhận dạng của aflatoxin B1\r\ntrong dịch chiết bằng phép thử giả định với axit sulfuric (xem 7.7.2) và nếu\r\nkết quả của phép thử này là dương tính thì tiến hành phép thử khẳng định (7.7.3).\r\nNếu kết quả phép thử giả định với axit sulfuric là âm tính thì không cần thiết\r\nphải tiến hành phép thử khẳng định vì trong trường hợp này không có mặt\r\naflatoxin B1.
\r\n\r\n7.7.2. Phép thử giả định bằng axit sulfuric
\r\n\r\nPhun dung dịch axit sulfuric (4.13) lên tấm\r\nsắc ký thu được trong 7.5.1 hoặc ở 7.5.2. Huỳnh quang của các điểm aflatoxin B1\r\nsẽ chuyển từ màu xanh da trời sang màu vàng dưới ánh sáng tử ngoại.
\r\n\r\n7.7.3. Phép thử khẳng định
\r\n\r\n7.7.3.1. Hình thành aflatoxin B1-hemiaxetal\r\n(aflatoxin B2a)
\r\n\r\nTrong trường hợp thức ăn chăn nuôi đơn chất\r\nvà có màu nhạt thì dùng phương pháp sắc ký lớp mỏng một chiều được mô tả trong\r\n7.7.3.2. Trường hợp những thức ăn đơn sắc, những thức ăn đã được trộn trước\r\nhoặc nghi ngờ thì dùng phương pháp sắc lý lớp mỏng hai chiều được mô tả trong\r\n7.7.3.3.
\r\n\r\n7.7.3.2. Sắc ký lớp mỏng một chiều
\r\n\r\nKẻ một đường thẳng trên tấm sắc ký (5.7) chia\r\nthành hai phần bằng nhau Trên mỗi phần chấm, cách mép dưới 20 mm và khoảng cách\r\ngiữa các chấm là 15 mm các thể tích dung dịch aflatoxin B1 chuẩn và\r\ndịch chiết dưới đây:
\r\n\r\n- 25 ml\r\ndung dịch aflatoxin B1 chuẩn (4.14);
\r\n\r\n- Một thể tích dịch chiết thu được trong\r\n7.4.2 chứa khoảng 2,5 aflatoxin B1;
\r\n\r\n- 25 ml\r\ndung dịch aflatoxin B1 chuẩn (4.14) và chấm chồng lên nó một thể\r\ntích dịch chiết thu được trong 7.4.2 chứa khoảng 2,5 ng aflatoxin B1.
\r\n\r\nChọn một trong hai phần, chấm chồng lên những\r\nđiểm trước 1 m
Chạy sắc ký ở nơi tối, dùng một trong các\r\ndung môi khai triển (4.6). Chọn dung môi trước khi chạy sắc ký. Hệ dung môi\r\nphải đảm bảo sao cho aflatoxin B1-hemiaxetal (aflatoxin B2a)\r\nđược tách hoàn toàn ra khỏi các chất cản trở. Dung môi chạy khoảng 120 mm.
\r\n\r\nĐể dung môi bay hơi ở nơi tối, sau đó phun\r\naxit sulfuric (4.13) lên phần tấm chưa được xử lý bằng axit trifluoroaxetic.\r\nKiểm tra tấm sắc ký dưới ánh sáng tử ngoại.
\r\n\r\nCó thể aflatoxin B1 được khẳng\r\nđịnh nếu:
\r\n\r\na) Giá trị Rf của dẫn xuất\r\naflatoxin B1 từ mẫu chiết tương ứng với giá trị của dung dịch chuẩn;
\r\n\r\nb) Cường độ huỳnh quang của aflatoxin B1\r\ncủa dung dịch chuẩn chấm chồng lên dịch chiết mạnh hơn cường độ huỳnh quang của\r\naflatoxin B1 của dịch chiết.
\r\n\r\nVì các điểm huỳnh quang của dịch chiết có\r\ncùng giá trị Rf với điểm huỳnh quang của aflatoxin B1-hemiaxetal\r\ncó thể dẫn đến sự nhầm lẫn qua việc đọc sắc phổ, chính vì vậy phải kiểm tra sự\r\ncó mặt của chúng trên phần được xử lý bằng axit sulfuric.
\r\n\r\nTrong trường hợp nghi ngờ, phải sử dụng\r\nphương pháp sắc ký lớp mỏng hai chiều (7.7.3.3) để khẳng định.
\r\n\r\n7.7.3.3. Sắc ký lớp mỏng hai chiều
7.7.3.3.1. Chấm các dung dịch
\r\n\r\nKẻ hai đường thẳng trên tấm sắc ký (5.7) song\r\nsong với hai cạnh của tấm (cách mỗi cạnh 60mm) để thiết lập giới hạn sự di\r\nchuyển của dung môi. Dùng pipet mao quản hoặc microxyranh chấm các dung dịch\r\nsau đây lên tấm sắc ký:
\r\n\r\n- Tại điểm A: một thể tích dịch chiết lấy từ\r\nmẫu được làm sạch ở 7.4.2 chứa khoảng 2,5 ng aflatoxin B1 và một\r\ngiọt (1 m
- Tại điểm B và điểm C: 25
Làm khô trong không khí ở nhiệt độ môi\r\ntrường.
\r\n\r\n7.7.3.3.2. Chạy sắc ký
\r\n\r\nChạy sắc ký theo chiều II (xem Hình 3) ở nơi\r\ntối, sử dụng dung môi khai triển (4.6.2) (lớp dung môi khoảng 1 cm trong bình\r\nchưa bão hòa) cho đến khi dung môi chạm tới đường giới hạn. Lấy tấm sắc ký ra\r\nkhỏi bình và để khô nơi tối ở nhiệt độ môi trường trong 5 phút.
\r\n\r\nSau đó chạy sắc ký theo chiều II, ở nơi tối,\r\nsử dụng dung môi khai triển (4.6.1) (lớp dung môi khoảng 1 cm trong bình chưa\r\nbão hòa) cho đến khi dung môi chạm tới đường giới hạn. Lấy tấm sắc ký ra khỏi\r\nbình, để khô ở nhiệt độ môi trường.
\r\n\r\n7.7.3.3.3. Diễn giải về sắc phổ
\r\n\r\nKiểm tra sắc phổ dưới ánh sáng cực tím của\r\nđèn (5.8) và kiểm tra các đặc tính sau đây:
\r\n\r\na) Sự xuất hiện điểm huỳnh quang màu xanh da\r\ntrời của aflatoxin B1-hemiaxetal và đôi khi điểm huỳnh quang màu\r\nxanh da trời nhạt của aflatoxin B1 không phản ứng với axit\r\ntrifluoroaxtic, các điểm này là của dung dịch chuẩn chấm ở điểm C (di chuyển\r\ntheo hướng I) và của điểm B (di chuyển theo hướng II);
\r\n\r\nb) Sự xuất hiện các điểm tương tự như các điểm\r\nmô tả ở a) là của dịch chiết chấm tại điểm A. Vị trí của các điểm này được xác\r\nđịnh nhờ các điểm của dung dịch chuẩn chấm ở điểm B và C. Cường độ huỳnh quang\r\ncủa các điểm aflatoxin B1-hemiaxetal của dịch chiết với dung dịch\r\nchuẩn chấm tại điểm B và C phải so sánh được.
\r\n\r\n![](\"00903094_files/image005.jpg\")
7.8. Số lần xác định
\r\n\r\nTiến hành hai lần xác định trên cùng mẫu thử\r\nnghiệm.
\r\n\r\n8.1. Xác định bằng mắt
\r\n\r\nHàm lượng aflatoxin B1, được biểu\r\nthị theo microgam trên kilogam mẫu, tính bằng công thức sau đây:
\r\n\r\nTrong đó:
\r\n\r\nC là nồng độ của aflatoxin B1 trên\r\nmililít dung dịch chuẩn (4.14) (khoảng 0,1 mg/ml),\r\ntính bằng microgam;
\r\n\r\nm là khối lượng của phần mẫu thử tương ứng với\r\nthể tích dịch chiết được đưa lên cột để làm sạch (10,0 g), tính bằng gam;
\r\n\r\nV1 là thể tích cuối cùng của dịch chiết kể cả\r\nnhững lần pha loãng nếu có, tính bằng microlít;
\r\n\r\nV2 và V3 là thể tích tương\r\nứng của dịch chiết và dung dịch aflatoxin B1 chuẩn (4.14) chấm lên\r\ntấm có cường độ huỳnh quang giống nhau, tính bằng microlít.
\r\n\r\n8.2. Đo bằng máy đo cường độ huỳnh quang
\r\n\r\nHàm lượng aflatoxin B1, được biểu\r\nthị bằng microgam trên kilogam mẫu, tính theo công thức sau đây:
\r\n\r\nTrong đó
\r\n\r\nm là khối lượng của phần mẫu thử tương ứng với\r\nthể tích của dịch chiết được đưa lên cột để làm sạch (10,0 g), tính bằng gam;
\r\n\r\nm1 là khối lượng aflatoxin B1 trong\r\nđiểm chấm dịch chiết (kể cả thể tích V2) được suy ra từ các\r\nphép đo, tính bằng nanogam;
\r\n\r\nV1 là thể tích cuối cùng của dịch chiết kể cả\r\nnhững phần pha loãng nếu có, tính bằng microlit;
\r\n\r\nV2 là thể tích của dịch chiết chấm lên tấm sắc\r\nký (10 m
Các chi tiết của các phép thử liên phòng thử\r\nnghiệm về độ chụm của phương pháp được đưa ra trong phụ lục A. Các giá trị thu\r\nđược từ phép thử liên phòng thử nghiệm này có thể không áp dụng cho các dải\r\nnồng độ và các chất nền (matrix) khác với các giá trị đã nêu.
\r\n\r\n\r\n\r\nBáo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:
\r\n\r\n- Mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ\r\nvề mẫu;
\r\n\r\n- Phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;
\r\n\r\n- Phương pháp thử nghiệm đã dùng (A hoặc B),\r\nviện dẫn tiêu chuẩn này;
\r\n\r\n- Phương pháp xác định (bằng mắt hoặc bằng\r\nmáy đo cường độ huỳnh quang);
\r\n\r\n- Mọi chi tiết thao tác không được quy định\r\ntrong tiêu chuẩn này hoặc những điều được coi là tùy ý cũng như các sự cố bất\r\nkỳ mà có thể ảnh hưởng đến kết quả thử;
\r\n\r\n- Kết quả thử nghiệm thu được.
\r\n\r\nBa phép thử liên phòng thử nghiệm, hai trong\r\nsố đó được tiến hành ở cấp quốc tế (Nos.1 và 2) trên thức ăn chăn nuôi đã được\r\ntrộn trước (phương pháp B) cho kết quả nêu trong bảng A.1.
\r\n\r\nMười một phòng thử nghiệm tham gia trong phép\r\nthử lần hai đã phân tích theo phương pháp A trên mẫu thích hợp bằng mắt hoặc\r\nbằng máy đo cường độ huỳnh quang đều thu được các kết quả tương tự với kết quả\r\ntiến hành theo phương pháp B.
\r\n\r\n| \r\n | \r\n \r\n | \r\n ||
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n |
| \r\n Số lượng các phòng thử nghiệm \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Giá trị trung bình, | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Độ lệch chuẩn lặp lại (Sr),\r\n m | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Hệ số biến thiên lặp lại, % \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Giới hạn lặp lại (2,83 Sr)\r\n m | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Độ lệch tái lập (SR), | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Hệ số biến thiên tái lập, % \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Giới hạn tái lập (2,83 SR)\r\n m | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
\r\n\r\n
\r\n\r\n
\r\n\r\n
File gốc của Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 6599:2007 (ISO 6651: 2001) về thức ăn chăn nuôi – xác định bán định lượng Aflatoxin B1 – phương pháp sắc ký lớp mỏng đang được cập nhật.
Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 6599:2007 (ISO 6651: 2001) về thức ăn chăn nuôi – xác định bán định lượng Aflatoxin B1 – phương pháp sắc ký lớp mỏng
Tóm tắt
| Cơ quan ban hành | Đã xác định |
| Số hiệu | TCVN6599:2007 |
| Loại văn bản | Tiêu chuẩn Việt Nam |
| Người ký | Đã xác định |
| Ngày ban hành | 2007-01-01 |
| Ngày hiệu lực | |
| Lĩnh vực | Nông nghiệp |
| Tình trạng | Còn hiệu lực |