Tiêu chuẩn này mô tả phương pháp xác định hàm\r\nlượng tryptophan tự do và tổng số trong thức ăn chăn nuôi (ví dụ: thức ăn hoàn\r\nchỉnh và thức ăn bổ sung, nguyên liệu thô, nguyên liệu trong hỗn hợp, sản phẩm\r\npremix, thức ăn đậm đặc…). Không phân biệt giữa dạng D- và L-.
\r\n\r\n\r\n\r\nĐể xác định tryptophan tổng số, thủy phân mẫu\r\ntrong môi trường kiềm bằng dung dịch bari hydroxit bão hòa và đun nóng đến 110 oC\r\ntrong 20 giờ. Sau khi thủy phân, bổ sung chất nội chuẩn.
\r\n\r\nĐể xác định tryptophan tự do, chiết mẫu trong\r\nmôi trường axit nhẹ với sự có mặt của chất nội chuẩn.
\r\n\r\nTryptophan và chất nội chuẩn trong dịch thủy\r\nphân hoặc dịch chiết được xác định bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) pha\r\nđảo cột C18 có phát hiện huỳnh quang.
\r\n\r\nChỉ sử dụng thuốc thử tinh khiết phân tích,\r\ntrừ khi có các qui định khác.
\r\n\r\n3.1. Nước cất hai lần,
3.2. Chất chuẩn: trytophan
3.3. Chất nội chuẩn:
3.4. Bari hydroxit octahydrat
\r\n\r\nCẩn thận không để Ba(OH)2.8H2O\r\ntiếp xúc lâu trong không khí để tránh hình thành BaCO3, mà có thể\r\ngây cản trở phép xác định (xem B.3).
\r\n\r\n3.5. Natri hydroxit
\r\n\r\n3.6. Axit orthophosphoric,
3.7. Axit clohydric đậm đặc,
3.8. Metanol,
3.9. Xăng nhẹ,
3.10. Dung dịch natri hydroxit,
Hòa tan 40,0 g NaOH (3.5) trong nước (3.1) và\r\nthêm nước (3.1) cho đến 1 lít.
\r\n\r\n3.11. Axit clohydric,
Lấy 492 ml HCl (3.7) và thêm nước (3.1) cho\r\nđến 1 lít.
\r\n\r\n3.12. Axit clohydric,
Lấy 82 ml HCl (3.7) và thêm nước (3.1) cho\r\nđến 1 lít.
\r\n\r\n3.13. Axit clohydric,
Lấy 8,2 ml HCl (3.7) và thêm nước (3.1) cho\r\nđến 1 lít.
\r\n\r\n3.14. Axit orthophosphoric,
Lấy 34 ml axit orthophosphoric (3.7) và thêm\r\nnước (3.1) cho đến 1 lít.
\r\n\r\n3.15. Dung dịch tryptophan đậm đặc
Hòa tan 0,25 g tryptophan (3.2) (đã cân chính\r\nxác đến 0,1 mg) trong axit clohydric (3.13) vào bình định mức 500 ml và thêm\r\naxit clohydric (3.13) cho đến vạch. Bảo quản dung dịch này ở nhiệt độ -18 oC\r\ntối đa là bốn tuần.
\r\n\r\n3.16. Dung dịch nội chuẩn đậm đặc,
Hòa tan 0,27 ![](\"00903047_files/image001.gif\"){kind=small}
(3.3)\r\n(đã cân chính xác đến 0,1 mg) trong axit clohydric (3.13) vào bình định mức 500\r\nml và thêm axit clohydric (3.13) cho đến vạch. Bảo quản ở nhiệt độ -18oC\r\ntối đa là bốn tuần.
3.17. Dung dịch chuẩn hiệu chuẩn của\r\ntryptophan và chất nội chuẩn
\r\n\r\nLấy 2,00 ml dung dịch tryptophan đậm đặc\r\n(3.15) và 2,00 ml dung dịch nội chuẩn đậm đặc (![](\"00903047_files/image002.gif\"){kind=small}
)\r\n(3.16). Pha loãng bằng nước (3.1) và metanol (3.8) đến cùng một thể tích và\r\ncùng một nồng độ của metanol (10 % đến 30 %) khi kết thúc thủy phân.
Chuẩn bị dung dịch này ngay trước khi sử\r\ndụng.
\r\n\r\nTrong quá trình chuẩn bị, bảo vệ tránh ánh\r\nnắng trực tiếp của mặt trời.
\r\n\r\n3.18. Etanolamin
3.19. Dung dịch\r\n1,1,1-tricloro-2-metyl-2-propanol.
\r\n\r\nCho 1 g dung dịch\r\n1,1,1-tricloro-2-metyl-2-propanol vào 100 ml metanol (3.8).
\r\n\r\n3.20. Pha động dùng cho HPLC.
\r\n\r\nHòa tan 3,00 g axit axetic vào trong 900 ml\r\nnước (3.1) và thêm 50,0 ml dung dịch 1,1,1-tricloro-2-metyl-2-propanol (3.19).\r\nSử dụng etanolamin (3.18) để chỉnh pH đến 5,00. Thêm nước (3.1) cho đến 1 000\r\nml.
\r\n\r\n\r\n\r\nSử dụng các thiết bị của phòng thử nghiệm\r\nthông thường và cụ thể như sau:
\r\n\r\n4.1. Thiết bị HPLC có detector đo phổ huỳnh\r\nquang.
\r\n\r\n4.2. Cột sắc ký lỏng,
4.3. Máy đo pH.
\r\n\r\n4.4. Bình polypropylen,
4.5. Bộ lọc màng,.
4.6. Nồi hấp áp lực,
Đĩa có nắp đậy kín áp suất có thể để trong tủ\r\nsấy có khả năng điều chỉnh đến (110 ± 2)oC có thể được sử dụng.
\r\n\r\n4.7. Máy khuấy từ
4.8. Máy trộn Vortex.
\r\n\r\n\r\n\r\n5.1. Chuẩn bị mẫu
\r\n\r\nNghiền mẫu sao cho lọt hết qua sàng 0,5 mm.\r\nCác mẫu có độ ẩm cao phải được làm khô trong không khí ở nhiệt độ không quá 50 oC\r\nhoặc được làm đông khô trước khi nghiền. Các mẫu có hàm lượng chất béo cao phải\r\nđược chiết bằng xăng nhẹ (3.9) trước khi nghiền.
\r\n\r\n5.2. Xác định tryptophan tự do
Cân một lượng thích hợp (1 g đến 5 g) mẫu đã\r\nchuẩn bị (5.1) chính xác đến 1 mg cho vào bình nón. Thêm 100,0 ml axit\r\nclohydric (3.13) và 5,00 ml dung dịch nội chuẩn đậm đặc (3.16). Sử dụng máy\r\nkhuấy từ hoặc máy lắc cơ học (4.7) để lắc hoặc trộn trong 60 phút. Để lắng và\r\ndùng pipet lấy 10,0 ml dung dịch nổi phía trên cho vào cốc có mỏ. Thêm 5 ml\r\naxit orthophosphoric (3.14). Dùng natri hydroxit (3.10) chỉnh pH đến 3,0. Cho\r\nmột lượng metanol (3.8) đủ để có được nồng độ metanol khoảng 10 % đến 30 %\r\ntrong thể tích cuối cùng. Chuyển một thể tích thích hợp vào bình định mức và\r\npha loãng bằng nước (3.1) đến thể tích cần thiết cho phép đo sắc ký [xấp xỉ\r\nbằng thể tích của dung dịch chuẩn hiệu chuẩn (3.17)].
\r\n\r\nLọc vài mililít dung dịch qua màng lọc cỡ lỗ\r\n0,45 (4.5) trước khi bơm vào cột HPLC.\r\nTiến hành chạy sắc ký theo 5.4.
Bảo vệ dung dịch chuẩn và dịch chiết tránh\r\nánh nắng trực tiếp của mặt trời. Nếu không thể phân tích các dịch chiết trong\r\ncùng ngày, thì các dịch chiết có thể được bảo quản ở 5 oC tối đa là\r\nba ngày.
\r\n\r\n5.3. Xác định tryptophan tổng số
Cân từ 0,1 g đến 1 g mẫu đã chuẩn bị (5.1)\r\nchính xác đến 0,2 mg vào bình polypropylen (4.4). Phần mẫu thử đã cân nên có\r\nhàm lượng nitơ khoảng 10 mg. Cho 8,4g bari hydroxit octahydrat (3.4) và 10 ml\r\nnước (3.1). Trộn trên máy trộn Vortex (4.8) hoặc máy khuấy từ (4.7). Để nam\r\nchâm được bọc bằng teflon trong hỗn hợp. Rửa thành bình bằng 4 ml nước (3.1).\r\nVặn nắp xoáy và đậy kín bình. Chuyển sang nồi hấp áp lực (4.6) có chứa nước\r\nsôi, và hấp bằng hơi nước trong 30 đến 60 phút. Đậy nồi hấp áp lực và hấp ở (110\r\noC ± 2 oC) trong 20 giờ.
\r\n\r\nTrước khi mở nồi hấp áp lực, giảm nhiệt độ\r\nchỉ vừa thấp hơn 100 oC. Để tránh tạo tinh thể Ba(OH)2.8H2O,\r\nthì thêm 30 ml nước (3.1) ở nhiệt độ phòng vào hỗn hợp đang ấm. Lắc hoặc khuấy\r\nnhẹ. Thêm 2,00 ml dung dịch nội chuẩn đậm đặc ()\r\n(3.16). Làm nguội bình trong nước hoặc bể đá trong 15 phút.
Sau đó, cho thêm 5 ml axit orthophosphoric\r\n(3.14). Giữ bình trong bể làm nguội và trung hòa bằng HCl 6 mol/l (3.11) trong\r\nkhi vẫn khuấy liên tục và chỉnh pH đến 3,0 bằng cách sử dụng 1mol/HCl (3.12).\r\nCho thêm một lượng metanol vừa đủ để có được nồng độ metanol khoảng từ 10 % đến\r\n30 % ở thể tích cuối cùng. Chuyển thể tích thích hợp sang bình định mức và pha\r\nloãng bằng nước (3.1) đến thể tích cần thiết cho phép đo sắc ký (ví dụ 100 ml).\r\nViệc bổ sung metanol không được tạo kết tủa.
\r\n\r\nLọc vài mililít dung dịch qua bộ lọc màng\r\n0,45 (4.5) trước khi bơm lên cột HPLC.\r\nTiến hành chạy sắc ký theo 5.4.
.................................
\r\n\r\nVis, sam là thể tích của dung dịch nội chuẩn\r\nđậm đặc (3.16) được bổ sung vào dịch chiết (5.2) (= 5,00 ml) hoặc dịch thủy\r\nphân (5.3) (= 2,00 ml) tính bằng mililít;
\r\n\r\nAis, sam là diện tích pic của chất nội chuẩn\r\ntrong dịch chiết (5.2) hoặc dịch thủy phân (5.3);
\r\n\r\nAtry,cal là diện tích của pic dung dịch chuẩn\r\nhiệu chuẩn trytophan (3.17);
\r\n\r\nVis,cal là thể tích của dung dịch\r\nnội chuẩn đậm đặc (= 2,00 ml) (3.16), được bổ sung vào dung dịch hiệu chuẩn\r\n(3.17), tính bằng mililít;
\r\n\r\nm là khối lượng của mẫu, tính bằng gam (được\r\nchỉnh về khối lượng ban đầu nếu đã được sấy khô và/hoặc khử chất béo).
\r\n\r\n\r\n\r\n7.1. Phép thử liên phòng thử nghiệm
\r\n\r\nCác chi tiết của phép thử liên phòng thử\r\nnghiệm về độ chụm của phương pháp được đưa ra trong phụ lục A. Các giá trị thu\r\nđược từ phép thử này có thể không áp dụng cho các dải nồng độ và các chất nền\r\n(matrix) khác với các giá trị đã nêu.
\r\n\r\n7.2. Độ lặp lại
\r\n\r\nChênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả của hai\r\nphép thử độc lập, đơn lẻ, thu được khi sử dụng cùng phương pháp, trên vật liệu\r\nthử giống hệt nhau trong cùng một phòng thử nghiệm, do một người thực hiện, sử\r\ndụng cùng thiết bị, thực hiện trong một khoảng thời gian ngắn, không quá 5 %\r\ncác trường hợp vượt quá giới hạn lặp lại r được nêu trong các bảng từ\r\nA.1 đến A.3.
\r\n\r\n7.3. Độ tái lập
\r\n\r\nChênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả của hai\r\nphép thử đơn lẻ, thu được khi sử dụng cùng phương pháp trên vật liệu thử giống\r\nhệt nhau, trong các phòng thử nghiệm khác nhau, do những người khác nhau thực\r\nhiện, sử dụng các thiết bị khác nhau, không quá 5% các trường hợp vượt quá giới\r\nhạn tái lập R cho trong các bảng từ A.1 đến A.3.
\r\n\r\n\r\n\r\nBáo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:
\r\n\r\na) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy\r\nđủ về mẫu;
\r\n\r\nb) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;
\r\n\r\nc) phương pháp thử nghiệm đã dùng, viện dẫn\r\ntiêu chuẩn này;
\r\n\r\nd) tất cả các chi tiết thao tác không được\r\nquy định trong tiêu chuẩn này hoặc những điều được coi là tùy ý cũng như mọi sự\r\ncố bất kỳ mà có thể ảnh hưởng đến kết quả thử;
\r\n\r\ne) kết quả thử nghiệm thu được, hoặc nếu thỏa\r\nmãn yêu cầu về độ lặp lại thì nêu kết quả cuối cùng thu được.
\r\n\r\n\r\n\r\n
Một phép thử liên phòng thử nghiệm do liên\r\nminh Châu âu tổ chức đã tiến hành phân tích trên ba mẫu phân tích gồm 12 phòng\r\nthử nghiệm để kiểm tra xác nhận phương pháp thủy phân. Trên mỗi mẫu thực hiện\r\nnăm phép phân tích kép. Các kết quả được nêu trong bảng A.1
\r\n\r\n| \r\n | \r\n \r\n
| \r\n \r\n
| \r\n \r\n
| \r\n
| \r\n Số lượng các phòng thử nghiệm có kết quả \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Số lượng kết quả thử nghiệm từ các phòng\r\n thử nghiệm còn lại \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Giá trị trung bình | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Độ lệch chuẩn lặp lại, sr,\r\n g/kg \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, % \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Giới hạn lặp lại, r (= 2,8 sr),\r\n g/kg \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Độ lệch chuẩn tái lập, sR,\r\n g/kg \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, % \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Giới hạn tái lập, R (= 2,8 sR),\r\n g/kg \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
![](\"00903047_files/image004.gif\"){kind=small}
Một nghiên cứu cộng tác khác gồm 13 phòng thử\r\nnghiệm tham gia phân tích trên hai mẫu để kiểm tra xác nhận phương pháp chiết\r\ntryptophan. Trên mỗi mẫu thực hiện năm phép phân tích kép. Các kết quả được nêu\r\ntrong Bảng A.2.
\r\n\r\n| \r\n | \r\n \r\n
| \r\n \r\n
| \r\n
| \r\n Số lượng phòng thử nghiệm gửi kết quả \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Số lượng kết quả thử nghiệm từ các phòng\r\n thử nghiệm còn lại \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Giá trị trung bình | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Độ lệch chuẩn lặp lại, sr,\r\n g/kg \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, % \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Giới hạn lặp lại, r (= 2,8 sr),\r\n g/kg \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Độ lệch chuẩn tái lập, sR,\r\n g/kg \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, % \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Giới hạn tái lập, R (= 2,8 sR),\r\n g/kg \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
Một phép thử liên phòng thử nghiệm khác gồm\r\nbảy phòng thử nghiệm tiến hành phân tích trên bốn mẫu để kiểm tra xác nhận\r\nphương pháp tryptophan đối với việc thủy phân. Các kết quả được nêu trong Bảng\r\nA.3.Trên mỗi mẫu thực hiện năm phép phân tích kép.
\r\n\r\n| \r\n | \r\n \r\n
| \r\n \r\n
| \r\n \r\n
| \r\n \r\n
| \r\n
| \r\n Số lượng phòng thử nghiệm gửi kết quả \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Số lượng kết quả thử nghiệm từ các phòng\r\n thử nghiệm còn lại \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Giá trị trung bình | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Độ lệch chuẩn lặp lại, sr,\r\n g/kg \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, % \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Giới hạn lặp lại, r (= 2,8 sr),\r\n g/kg \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Độ lệch chuẩn tái lập, sR,\r\n g/kg \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, % \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Giới hạn tái lập, R (= 2,8 sR),\r\n g/kg \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
B.1 Các điều kiện sắc ký đặc biệt sau đây có thể\r\ngiúp cho cho việc tách tryptophan và tốt\r\nhơn.
Việc rửa giải isocratic được thực hiện sau\r\nkhi làm sạch cột gradient:
\r\n\r\n| \r\n Cột sắc ký lỏng \r\n | \r\n \r\n 125 x 4 mm, được nhồi bằng C18,\r\n 5 | \r\n ||
| \r\n Nhiệt độ cột: \r\n | \r\n \r\n 32 oC \r\n | \r\n ||
| \r\n Pha động: \r\n | \r\n \r\n A: 0,01 mol/l KH2PO4/metanol,\r\n 95 + 5 (phần thể tích) \r\n | \r\n ||
| \r\n \r\n | \r\n \r\n B: Metanol \r\n | \r\n ||
| \r\n Chương trình gradient \r\n | \r\n \r\n 0 phút \r\n | \r\n \r\n 100 % A \r\n | \r\n \r\n 0 % B \r\n | \r\n
| \r\n \r\n | \r\n \r\n 15 phút \r\n | \r\n \r\n 100 % A \r\n | \r\n \r\n 0 % B \r\n | \r\n
| \r\n \r\n | \r\n \r\n 17 phút \r\n | \r\n \r\n 60 % A \r\n | \r\n \r\n 40 % B \r\n | \r\n
| \r\n \r\n | \r\n \r\n 19 phút \r\n | \r\n \r\n 60 % A \r\n | \r\n \r\n 40 % B \r\n | \r\n
| \r\n \r\n | \r\n \r\n 21 phút \r\n | \r\n \r\n 100 % A \r\n | \r\n \r\n 0 % B \r\n | \r\n
| \r\n \r\n | \r\n \r\n 33 phút \r\n | \r\n \r\n 100 % A \r\n | \r\n \r\n 0 % B \r\n | \r\n
| \r\n Tốc độ dòng: \r\n | \r\n \r\n 1,2 ml/phút \r\n | \r\n \r\n \r\n | \r\n \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Tổng số thời gian vận hành: \r\n | \r\n \r\n khoảng 33 phút \r\n | \r\n \r\n \r\n | \r\n \r\n \r\n | \r\n
![](\"00903047_files/image003.gif\"){kind=small}
B.2 Việc chạy sắc ký sẽ thay đổi tùy theo loại\r\nHPLC và vật liệu nhồi cột được sử dụng. Hệ thống được lựa chọn phải có khả năng\r\ntách đường nền của tryptophan và chất nội chuẩn. Tuy nhiên, quan trọng nhất là\r\ncác sản phẩm phân hủy được tách ra khỏi tryptophan và chất nội chuẩn. Dịch thủy\r\nphân không chứa chất nội chuẩn phải được chạy sắc ký để kiểm tra đường nền về\r\ntạp chất của chất nội chuẩn. Điều quan trọng là thời gian chảy đủ lâu để rửa\r\ngiải hết các sản phẩm phân hủy, trái lại các pic rửa giải chậm có thể cản trở\r\ncho việc chạy sắc ký sau đó.
\r\n\r\nHệ thống sắc ký cần cho độ nhạy tuyến tính\r\ntrên khắp dải vận hành. Độ nhạy tuyến tính phải được đo với nồng độ không đổi\r\n(chuẩn) của chất nội chuẩn và các nồng độ khác nhau của tryptophan. Điều quan\r\ntrọng là cỡ pic của cả tryptophan và chất nội chuẩn đều nằm trong dải tuyến\r\ntính của hệ thống HPLC/ huỳnh quang. Nếu các pic của tryptophan và/hoặc chất\r\nnội chuẩn là quá thấp hoặc quá cao, thì phải lặp lại phép phân tích với cỡ mẫu\r\nkhác và/hoặc thay đổi thể tích cuối cùng.
\r\n\r\nB.3 Nếu để quá lâu, thì bari hydroxit trở nên khó\r\nhòa tan. Điều này dẫn đến dung dịch không trong đối với phép xác định HPLC và\r\ncho kết quả thấp đối với tryptophan.
\r\n\r\n\r\n\r\n
[1] Commission directive 2000/45/EC of July\r\n2000, establishing Community methods of analysis for the determination of\r\nvitamin A, vitamin E and tryptophan in feedingstuffs.
\r\n\r\nFile gốc của Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 5283:2007 về thức ăn chăn nuôi – xác định hàm lượng tryptophan đang được cập nhật.
Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 5283:2007 về thức ăn chăn nuôi – xác định hàm lượng tryptophan
Tóm tắt
| Cơ quan ban hành | Đã xác định |
| Số hiệu | TCVN5283:2007 |
| Loại văn bản | Tiêu chuẩn Việt Nam |
| Người ký | Đã xác định |
| Ngày ban hành | 2007-01-01 |
| Ngày hiệu lực | |
| Lĩnh vực | Nông nghiệp |
| Tình trạng | Hết hiệu lực |