TIÊU CHUẨN VIỆT\r\nNAM

TCVN 5281\r\n: 2007

THỨC\r\nĂN CHĂN NUÔI – XÁC ĐỊNH LYSIN HỮU DỤNG

Animal feeding stuffs\r\n– Detemination of available lysine

Lời giới thiệu

Lysin trong sản phẩm thực phẩm thường được\r\ncoi là dễ chuyển hóa khi nhóm amin cuối (amino )\r\ncủa chúng không kết hợp được. Phần lysin này có thể xác định được vì các nhóm\r\nnày kết hợp với 2,4-dinitrofluorobenzen.

1. Phạm vi và lĩnh\r\nvực áp dụng

Tiêu chuẩn này qui định phương pháp xác định\r\nlysin hữu dụng trong thức ăn chăn nuôi chứa các protein thực vật hoặc động vật.

Tuy nhiên, khi so sánh với phép xác định bằng\r\nsinh học thì phương pháp này đánh giá quá lượng lysin hữu dụng và cần phải chú\r\ný trong phần giải thích các kết quả.

2. Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết\r\ncho việc áp dụng tiêu chuẩn. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm ban hành thì\r\náp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm ban\r\nhành thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi.

TCVN 4325:2007 (ISO 6497:2002), Thức ăn chăn\r\nnuôi – Lấy mẫu.

TCVN 4328 (ISO 5983), Thức ăn chăn nuôi – Xác\r\nđịnh hàm lượng nitơ và tính hàm lượng protein thô.

TCVN 6952:2001 (6498:1998), Thức ăn chăn nuôi\r\n– Chuẩn bị mẫu thử.

3. Định nghĩa

Lysin hữu dụng (available lysine):

Lượng lysin còn lại sau khi lấy lượng lysin\r\ntổng số trừ đi lượng lysin không hữu dụng xác định được dưới các điều kiện qui\r\nđịnh trong tiêu chuẩn này.

Lượng lysin hữu dụng được biểu thị theo phần\r\ntrăm khối lượng của nguyên liệu thô.

4. Nguyên tắc

Phần mẫu thử đã nghiền được thủy phân bằng\r\naxit clohydric, sau đó lysin tổng số được tách bằng sắc ký cột và xác định bằng\r\nđo phổ ở bước sóng 570 nm.

Phần mẫu thử đã nghiền thứ hai được phản ứng\r\nvới dung dịch etanol của 2,4-dinitrofluorobenzen trong môi trường kiềm, được\r\nlàm sạch rồi cho thủy phân bằng axit clohydric, tách lysin không hữu dụng bằng\r\nsắc ký cột, và xác định bằng đo phổ ở bước sóng 570 nm.

5. Thuốc thử

Chỉ sử dụng các thuốc thử tinh khiết phân\r\ntích. Nước sử dụng phải là nước là nước cất hoặc nước có độ tinh khiết tương đương.

5.1. Ete dietyl, không chứa peroxit.

5.2. Natri bicacbonat, dung dịch 80g/l.

5.3. 2,4-Dinitrofluorobenzen (DNFB), trong dung dịch\r\netanol.

Hòa tan 0,15 ml DNFB trong 12 ml etanol 95 %\r\n(theo thể tích).

Chuẩn bị dung dịch này ngay trước khi sử\r\ndụng.

5.4. Axit clohydric, khoảng 6 mol/l.

Trộn 1 thể tích axit clohydric (p₂₀\r\n= 1,19 g/ml) với 1 thể tích nước.

5.5. Dung dịch natri xitrat, dung dịch đệm, pH\r\nkhoảng 2,2.

Hòa tan trong nước theo thứ tự sau:

21 g axit xitric ngậm một phân tử nước;

8 g natri hydroxit;

16 ml axit clohydric (p₂₀ =\r\n1,19 g/ml);

0,1 ml axit octanoic (caprylic);

20 ml thiodiglycol;

3 ml dung dịch ete dodecyl polyoxyetylen 30 %\r\n(theo thể tích) với khoảng 23 phân tử oxy-etylen1).

Pha loãng bằng nước đến 1 000 ml.

5.6. Natri xitrat, dung dịch đệm, pH =\r\n5,28.

Hòa tan trong nước theo thứ tự sau:

24,5 g axit xitric ngậm một phân tử nước;

14 g natri hydroxit;

6,8 ml axit clohydric (p₂₀\r\n= 1,19 g/ml);

0,1 ml axit octanoic (caprylic);

3 ml dung dịch ete dodecyl polyoxyetylen 30 %\r\n(theo thể tích) với khoảng 23 phân tử oxy-etylen¹⁾.

Pha loãng bằng nước đến 1 000 ml. Dùng axit\r\nclohydric (p₂₀ = 1,19 g/ml) hoặc dung dịch natri hydroxit 50\r\n% (theo khối lượng) để chỉnh pH đến 5,28 ± 0,02

5.7. Thuốc thử ninhydrin.

5.7.1. Natri propionat, dung dịch đệm, pH 5,5\r\n± 0,1

Hòa tan 168 g natri hydroxit trong khoảng 400\r\nml nước. Làm nguội, rồi thêm 498 ml axit propionic trong khi lắc liên tục. Pha\r\nloãng bằng nước đến 1 000 ml.

5.7.2. Chuẩn bị thuốc thử

Chuẩn bị thuốc thử ninhydrin trong môi trường\r\nnitơ và ở nơi tối. Cho 1 lít peroxit không chứa ete monometyl của glycol\r\netylen, 1 lít dung dịch đệm natri propionat (5.7.1) và 40 g ninhyrin vào bình\r\ncầu 2 lít, lắc cho đến khi hòa tan hết, sau đó thêm 1,33 g thiếc (II) clorua\r\nngậm hai phân tử nước (SnCl₂.2H₂O). Lắc cho đến khi hòa\r\ntan hết (xem chú thích).

Nếu giữ ở 4 ^oC dưới áp suất nhẹ\r\ntrong môi trường nitơ và ở nơi tối, thì thuốc thử này có thể bền trong 1 tháng.

CHÚ THÍCH: Nếu xuất hiện kết tủa SnCl₂,\r\nthì thay kẽm (II) clorua bằng 7,5 ml dung dịch thiếc (III) clorua 150 g/l hoặc\r\nbằng 1,5 g hydrindantin trên lít thuốc thử.

5.8. Lysin, dung dịch chuẩn, tương ứng với 1 mmol\r\ncủa lysin trên lít.

Hòa tan 182,5 mg lysin monohydroclorua trong\r\n100 ml axit clohydric 0,1 mol/l. Lấy chính xác 10 ml dung dịch này và pha loãng\r\nđến 100 ml bằng dung dịch đệm natri xitrat pH 2,2 (5.5).

1 ml dung dịch này chứa 1 mol lysin.

6. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử\r\nnghiệm thông thường và cụ thể như sau:

6.1. Máy nghiền, có các đặc tính sau\r\nđây:

a) được cấu tạo bằng vật liệu không hút ẩm;

b) dễ làm sạch và có khoảng trống không sử\r\ndụng tối thiểu;

c) cho phép nghiền nhanh và nghiền đều, không\r\nlàm nóng quá mức và ngăn tiếp xúc với không khí bên ngoài càng nhiều càng tốt.

d) có khả năng điều chỉnh để thu được các hạt\r\ncó các kích cỡ qui định trong 7.1.

6.2. Bình cầu, có dung tích 250 ml\r\nvà 1 000 ml, đáy phẳng, cổ ngắn có khớp nối mài hình nón và bình sinh hàn khớp\r\nvới bình cầu.

6.3. Chén nung, bằng thủy tinh thiêu\r\nkết loại P 16 (cỡ lỗ 10 m đến 16 m).

6.4. Bể dầu,  khả năng duy trì ở\r\nnhiệt độ đảm bảo cho việc đối lưu (120 ^oC đến 130 ^oC)

6.5. Máy cất quay.

6.6. Thiết bị phân tích tự động axit amin, hoặc nếu không sẵn\r\ncó, thì dùng hệ thống sắc ký thủ công bao gồm:

a) sắc ký cột, chiều dài khoảng 250 mm và\r\nđường kính trong 6 mm được duy trì nhiệt độ ổn định ở 55 ^oC bằng túi\r\nnước và bể tuần hoàn nhiệt, và được nhồi đầy đến 200 mm bằng resin trao đổi\r\ncation với các nhóm chức năng sulfonic, có cỡ hạt 13 ± 2 2) trong môi trường axit\r\nmạnh 8 %.

b) bơm pittông nhỏ, tạo được tốc độ 50\r\nml/giờ;

c) bộ thu nhận phần chiết;

d) nồi cách thủy đun sôi;

e) phổ kế cài đặt ở bước sóng 570 nm, có các\r\ncuvét dày 10 mm.

6.7. Pipet chia độ,  có dung tích 1 ml; 5\r\nml và 10 ml.

6.8. Bình định mức, có dung tích 10 ml;\r\n20 ml và 100 ml.

6.9. Cân phân tích.

7. Lấy mẫu

TCVN 4325:2007 (ISO 6497:2002).

8. Cách tiến hành

8.1. Chuẩn bị mẫu thử

Nghiền từ 5 g đến 10 g mẫu phòng thử nghiệm\r\nđể thu được các hạt lọt hết qua sàng có cỡ lỗ 315 .

CHÚ THÍCH: Cỡ lỗ của sàng được qui định nhỏ\r\nhơn so với khuyến cáo trong TCVN 6952:2001 (ISO 6498:1998) là để đảm bảo được\r\nsự tiếp xúc tối đa với DNFB.

8.2. Phần mẫu thử

Cân hai phần mẫu thử, mỗi phần tương ứng với\r\nkhoảng 100 mg protein thô chính xác đến 1mg và cho lần lượt vào hai bình cầu\r\n(6.2) [xem TCVN 4328 (ISO 5983) để xác định hàm lượng protein].

8.3. Lysin tổng số

8.3.1. Thủy phân bằng axit clohydric

Cho 500 ml axit clohydric 6 mol/l (5.4) vào bình\r\ncầu 1 000 ml (xem 8.2). Lập bình sinh hàn và đặt bình cầu vào trong bể dầu\r\n(6.4) đã được làm nóng trước từ 120 ^oC đến 130 ^oC.

Sau khi đun sôi nhẹ trong 24 giờ, làm nguội\r\nbình và lọc lượng chứa trong bình qua chén nung (6.3). Sử dụng máy cất quay\r\n(6.5) làm bay hơi dịch lọc ở nhiệt độ không quá 40 ^oC. Cho nước vào\r\ncặn thu được và cho bay hơi tiếp. Lặp lại thao tác này cho đến khi phần lớn\r\naxit clohydric được loại bỏ hết; thông thường, tráng bốn lần, mỗi lần bằng 30\r\nml nước là đủ.

Hòa tan cặn trong dung dịch đệm natri xitrat\r\ncó pH 2,2 (5.5) và chuyển lượng này sang bình định mức một vạch 100 ml (6.8).\r\nThêm dung dịch đệm natri xitrat pH 2,2 (5.5) cho đến vạch, lọc qua giấy lọc gấp\r\nnếp.

8.3.2. Chuẩn bị cột lần cuối và hấp thụ dịch\r\nthủy phân

Nối bơm của thiết bị (6.6) vào bộ phận chứa\r\ndung dịch đệm natri xitrat có pH 5,28 (5.6); sai đó chỉnh tốc độ dòng đến 50\r\nml/giờ. Nối bơm vào cột resin, đã được làm nóng trước đến 55 ^oC, và\r\ncho dung dịch đệm (5.6) đi qua cột trong 20 phút để tạo sự cân bằng. Tháo bơm\r\nra. Loại bỏ phần lớn chất lỏng phía trên cột resin, chú ý sao cho bề mặt của\r\ncột resin không bị khô.

Dùng pipet (6.7) lấy 0,5 ml dịch thủy phân\r\n(hoặc 1 ml nếu sử dụng hệ thống thủ công) cho lên cột, sau đó cho đi qua cột\r\nresin có sự hỗ trợ của áp suất nitơ nhẹ. Tráng thành cột bằng 0,5 ml dung dịch\r\nđệm natri xitrat có pH 5,28 (5.6) và cho qua cột resin. Điền đầy cột đến đỉnh\r\nbằng dung dịch đệm natri xitrat (5.6) và nối với bơm.

8.3.3. Xác định

8.3.3.1. Hệ thống tự động

Cài đặt thiết bị phân tích. Hiệu chuẩn thiết\r\nbị bằng 0,25 lysin [0,25 ml dung dịch chuẩn lysin\r\n(5.8)] hoặc theo lượng qui định trong chỉ dẫn của nhà sản xuất, tiến hành như\r\nmô tả trong 8.3.2.

8.3.3.2. Hệ thống thủ công

8.3.3.2.1. Định vị lysin

Phần chất rửa giải chứa lysin phải được kiểm\r\ntra bằng cách dùng dung dịch lysin đã biết trước nồng độ, ví dụ dung dịch 1 (5.8). Đối với mục đích này, loại bỏ\r\n25 ml đến 30 ml chất rửa giải đầu tiên và thu lấy các phần 1 ml vào các ống thử\r\nnghiệm cho đến khi được phần thứ 50 tính từ khi bắt đầu rửa giải. Thêm vào mỗi\r\nphần 1 ml thuốc thử ninhydrin (5.7) vào các phần từ phần 30 đến phần 50. Trộn\r\nđều, chuyển vào nồi cách thủy đun sôi và để trong 15 phút. Để nguội. Pha loãng\r\nbằng cách thêm 10 ml dung dịch đệm natri xitrat có pH 5,28 (5.6). Trộn và đo\r\nchất hấp thụ ở 570 nm bằng phổ kế, dùng dung dịch đệm natri xitrat có pH 5,28\r\n(5.6) làm dịch lỏng đối chứng.

CHÚ THÍCH: Dưới các điều kiện qui định, lysin\r\nthường được rửa giải ở các phần từ phần 39 đến phần 45, đây chỉ là thông tin để\r\ntham khảo.

8.3.3.2.2. Xác định

Nếu lysin được rửa giải từ các phần từ phần\r\n39 đến phần 45 thì loại bỏ 38 ml chất rửa giải đầu tiên, thu lấy và gộp các\r\nphần (phần thứ 39 đến phần thứ 45) tương ứng với pic lysin và cho bay hơi bằng\r\nmáy cất quay (6.5).

CHÚ THÍCH: Sau khi thu hồi các phần có chứa\r\nlysin, cho khoảng 200 ml dung dịch đệm đi qua cột để loại bỏ hết thành phần\r\nkhông mong muốn có thể còn sót lại.

Hòa tan cặn trong 5 ml dung dịch đệm natri\r\nxitrat có pH 5,28 (5.6) và thêm 5 ml thuốc thử ninhydrin (5.7). Trộn đều,\r\nchuyển vào nồi cách thủy đun sôi và để trong 15 phút. Để nguội. Pha loãng hỗn\r\nhợp bằng dung dịch đệm natri xitrat có pH 5,28 (5.6) sao cho nồng độ lysin của\r\ndung dịch thử ở khoảng 0,02 (V₁\r\nlà phần thể tích mẫu thử thu được).

Đo độ hấp thụ ở 570 nm bằng phổ kế, dùng hỗn\r\nhợp của một phần thể tích dung dịch đệm natri xitrat (5.6) và một phần thể tích\r\nthuốc thử ninhydrin (5.7) làm dịch lỏng đối chứng, cho vào nồi cách thủy đun\r\nsôi trong 15 phút và sau khi làm nguội thì pha loãng đến thể tích V₁

8.3.3.2.3. Hiệu chuẩn phổ kế

Lấy chính xác 5 ml dung dịch lysin chuẩn\r\n(5.8). Cho 5 ml thuốc thử ninhydrin (5.7). Trộn đều, chuyển sang nồi cách thủy\r\nđun sôi và để trong 15 phút. Để nguội và pha loãng đến 100 ml bằng dung dịch\r\nđệm natri xitrat có pH 5,28 (5.6).

Đo độ hấp thụ bằng phổ kế dưới cùng điều kiện\r\nnhư trong 8.3.3.2.2.

8.4. Lysin không hữu dụng

8.4.1. Phản ứng dinitrophenylation

Dùng pipet (6.7) chuyển 8 ml dung dịch natri\r\nbicacbonat (5.2) cho vào bình cầu 250 ml (xem 8.2). Để khoảng 10 phút, khuấy liên\r\ntục. Sau đó thêm dung dịch DNFB (5.3), đậy nắp bình, lắc và đảm bảo rằng các\r\nhạt không bám lên thành bình, để hỗn hợp qua đêm ở nhiệt độ phòng và ở nơi tối.

8.4.2. Làm sạch

Dùng máy cất quay (6.5) làm bay hơi cho đến\r\nkhô ở nhiệt độ nhỏ hơn 40 ^oC. Cho 75 ml ete dietyl (5.1) vào bình\r\ncầu, khuấy và để tách pha. Loại bỏ hết ete dietyl, chú ý tránh kéo theo các hạt\r\nrắn. Lặp lại các thao tác này trên hai lần, mỗi lần dùng 50 ml ete dietyl. Làm\r\nbay hơi các vết dietyl ete cuối cùng bằng cách đun nóng trên máy cất quay.

8.4.3. Thủy phân bằng axit clohydric

Chuyển sang bình cầu 150 ml axit clohydric\r\n(5.4) và tiến hành như mô tả trong 8.3.1 nhưng chuyển hết lượng cặn và hòa tan\r\ntrong dung dịch đệm natri xitrat có pH 2,2 (5.5) trong bình định mức 20 ml (6.8)\r\n(hoặc 10 ml nếu dùng hệ thống thủ công).

8.4.4. Làm lắng dịch thủy phân và xác định

Tiến hành như mô tả trong 8.3.2 và 8.3.3.

Trong trường hợp hệ thống thủ công, thì đọc\r\nlần cuối cùng trên phổ kế có thể thực hiện được bằng cách pha loãng thể tích\r\nlysin cùng với hỗn hợp thuốc thử đến 20 ml bằng dung dịch đệm natri xitrat có\r\npH 5,28 (5.6) (V₂ là thể tích dung dịch thử thu được).

8.5. Số lần xác định

Tiến hành hai lần xác định trên cùng mẫu thử,\r\ncùng hai cặp phần mẫu thử khác nhau.

9. Biểu thị kết quả

9.1. Phương pháp tính và công thức

9.1.1. Lysin tổng số

9.1.1.1. Xác định bằng cách sử dụng dụng cụ\r\nphân tích tự động

Lysin tổng số, w₁, được\r\nbiểu thị theo phần trăm khối lượng, tính bằng công thức sau đây:

trong đó:

S₀ là diện tích pic tương\r\nứng với 0,25 lysin;

S₁ là diện tích pic\r\ntương ứng với lysin tổng số xác định được trong 8.3.3.1;

m₁ là khối lượng của\r\nphần mẫu thử cho vào trong bình thứ nhất, tính bằng gam;

V₀ là thể tích của dịch\r\nthủy phân được chuyển vào cột (thông thường, V₀ = 0,5 ml),\r\ntính bằng mililít.

9.1.1.2. Xác định bằng cách sử dụng hệ thống\r\nphân tích thủ công

Lysin tổng số, w₁, được\r\nbiểu thị theo phần trăm khối lượng, tính bằng công thức sau đây:

trong đó:

A₀ là độ hấp thụ của\r\ndung dịch lysin chuẩn xác định được trong 8.3.3.2.3;

A₁ là độ hấp thụ xác\r\nđịnh được trong 8.3.3.2.2;

V₀ là thể tích của dịch\r\nthủy phân được chuyển sang cột (thông thường, V₀ = 1 ml),\r\ntính bằng mililít.

m₁ là khối lượng của\r\nphần mẫu thử cho vào trong bình cầu thứ nhất, tính bằng gam;

9.1.2. Lysin không hữu dụng

9.1.2.1. Xác định bằng cách sử dụng dụng cụ\r\nphân tích tự động

Lysin không hữu dụng, w₂,\r\nđược biểu thị bằng phần trăm khối lượng, tính bằng công thức sau đây:

trong đó:

S₀ là diện tích pic\r\ntương ứng với 0,25 lysin;

S₂ là diện tích pic\r\ntương ứng với lysin không hữu dụng, xác định được trong 8.4.4;

m₂ là khối lượng của\r\nphần mẫu thử cho vào trong cầu bình thứ hai, tính bằng gam;

V₀ là thể tích của dịch\r\nthủy phân được chuyển sang cột (thông thường, V₀ = 0,5 ml),\r\ntính bằng mililít.

9.1.2.2. Xác định bằng cách sử dụng hệ thống\r\nthủ công

Lysin không hữu dụng, w₂,\r\nđược biểu thị bằng phần trăm khối lượng, tính bằng công thức sau đây:

trong đó:

A₀ là độ hấp thụ của\r\ndung dịch lysin chuẩn xác định được trong 8.3.3.2.3;

A₂ là độ hấp thụ xác\r\nđịnh được trong 8.4.4;

V₀ là thể tích của dịch\r\nthủy phân được chuyển sang cột (thông thường, V₀ = 1 ml),\r\ntính bằng mililít;

V₂ là thể tích của dung\r\ndịch thử (thông thường, V₂ = 20 ml), tính bằng mililít;

m₂ là khối lượng của\r\nphần mẫu thử cho vào bình thứ hai, tính bằng gam;

9.1.3. Lysin hữu dụng

Lysin hữu dụng, w₃, được\r\nbiểu thị bằng phần trăm khối lượng, tính bằng công thức sau đây:

w₁ – w₂

trong đó

w₁ là lysin\r\ntổng số (xem 9.1.1);

w₂ là lysin không hữu\r\ndụng (xem 9.1.2).

CHÚ THÍCH: Lysin hữu dụng, được biểu thị bằng\r\nphần trăm khối lượng của lysin tổng số, tính bằng công thức sau đây:

9.2. Độ lặp lại

Chênh lệch giữa các kết quả thu được của hai\r\nlần xác định được tiến hành đồng thời hoặc kế tiếp nhanh do cùng một người phân\r\ntích không quá 10 % giá trị trung bình của các kết quả thu được.

10. Báo cáo thử\r\nnghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải nêu được phương pháp\r\nsử dụng và kết quả thu được. Báo cáo cũng phải đề cập đến mọi chi tiết không\r\nqui định tiêu chuẩn này hoặc tùy ý lựa chọn, cùng với bất kỳ chi tiết nào ảnh\r\nhưởng đến kết quả.

Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm mọi thông tin\r\ncần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu.