TIÊU CHUẨN QUỐC GIA
TCVN 9109 : 2011
THỨC ĂN CHĂN NUÔI – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG RACTOPAMINE HYDROCLORUA BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
Animal feeding stuff – Determination of ractopamine hydrochloride content by high performance liquid chromatographic method
1. Phạm vi áp dụng
Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng ractopamine hydroclorua (ractopamine – HCl) trong thức ăn chăn nuôi bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
Giới hạn phát hiện của phương pháp là 0,5 mg/kg.
2. Tài liệu viện dẫn
Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).
TCVN 4851 (ISO 3696), Nước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm – Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử.
3. Nguyên tắc
Ractopamine-HCl trong thức ăn chăn nuôi được chiết bằng metanol/nước với tỷ lệ 90:10 (thể tích) đã được axit hóa. Dịch chiết được pha loãng bằng dung dịch axit axetic 2% sau đó được định lượng bằng HPLC với deteror huỳnh quang.
4. Thuốc thử
Chỉ sử dụng các thuốc thử tinh khiết phân tích và sử dụng nước loại 1 theo TCVN 4851 (ISO 3696)
4.1. Metanol, loại dùng cho HPLC.
4.2. Axetonitril, loại dùng cho HPLC.
4.3. Dung dịch axit axetic loãng
Lấy 980 ml nước vào cốc thủy tinh, thêm 20 ml axit axetic băng. Trộn kỹ.
4.4. Chất chuẩn ractopamine-HCl
4.5. Dung dịch chuẩn ractopamine-HCl
4.5.1. Dung dịch chuẩn gốc, 1000 µg/ml
Cân 100 mg chất chuẩn ractopamine-HCl, chính xác đến 0,0001 g, cho vào bình định mức 100 ml (lượng cân được điều chỉnh theo hàm lượng chất chuẩn ractopamine-HCl). Hòa tan và thêm metanol đến vạch. Trộn đều.
Bảo quản dung dịch chuẩn gốc ở nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C. Sử dụng trong vòng 3 tháng.
4.5.2. Dung dịch chuẩn trung gian, 20 mg/ml
Lấy chính xác 1 ml dung dịch chuẩn gốc (4.5.1) vào bình định mức 50 ml và thêm dung dịch axit axetic loãng (4.3) đến vạch. Lắc đều.
Bảo quản dung dịch chuẩn gốc ở nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C. Sử dụng trong vòng 2 tuần.
4.5.3. Dung dịch chuẩn làm việc, 0,1 µg/ml, 0,4 µg/ml, 0,8 µg/ml và 1,6 µg/ml.
Lấy chính xác lần lượt các thể tích 0,5 ml, 1,0 ml, 2,0 ml và 4,0 ml dung dịch chuẩn trung gian (4.5.2) vào các bình định mức tương ứng 100 ml, 50 ml, 50 ml và 50 ml và thêm dung dịch axit axetic loãng (4.3) đến vạch. Lắc đều.
Bảo quản dung dịch chuẩn gốc ở nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C. Sử dụng trong vòng 2 tuần.
4.6. Dung dịch chiết
Lấy 900 ml metanol vào cốc thủy tinh dung tích 1500 ml, thêm 100 ml nước và 2 ml axit clohydric đậm đặc (37 %). Trộn kỹ.
4.7. Pha động cho HPLC
Lấy 400 ml axetonitril vào cốc thủy tinh dung tích 1500 ml, thêm 600 ml nước, 20 ml axit axetic băng và 1,08 ± 0,05 g natri 1-octanesulfonat (C8H17O3SNa). Trộn kỹ và lọc qua bộ lọc dung môi có màng lọc 0,45 µm.
5. Thiết bị, dụng cụ
Sử dụng thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:
5.1. Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,0001 g.
5.2. Cân, có thể cân chính xác đến 0,01 g.
5.3. Máy nghiền, có mắt sàng kích thước 3 mm.
5.4. Máy trộn phòng thử nghiệm, ví dụ máy trộn Hobart hoặc tương tự.
5.5. Máy lắc tròn hoặc máy lắc ngang có thể đạt tốc độ 250 r/min.
5.6. Giấy lọc, Whatman. No. 41 (15 cm) hoặc loại tương đương.
5.7. Bình nón, dung tích 500 ml, có nút mài.
5.8. Bình nón, dung tích 125 ml.
5.9. Đầu lọc, gắn được vào xyranh, có cỡ lỗ 0,45 µm.
5.10. Xyranh nhựa, dùng một lần, dung tích 3 ml.
5.11. Micropipet, dung tích từ 10 µl đến 100 µl.
5.12. Lọ đựng mẫu (vial), dung tích 2 ml, có nắp vặn PTFE, loại dùng cho HPLC.
5.13. Hệ thống HPLC, được trang bị:
5.13.1. Bơm cao áp, đã khử xung, tốc độ dòng từ 0,1 ml/min đến 0,5 ml/min.
5.13.2. Bộ phận bơm mẫu, bằng tay hoặc tự động, có khả năng bơm 100 µl mẫu.
5.13.3. Detertor huỳnh quang, có thể đặt được bước sóng kích thích ở 226 nm và bước sóng phát xạ ở 305 nm.
5.13.4. Bộ phận xử lý tín hiệu, hoặc kết nối máy tính.
5.13.5. Cột phân tích trên hệ thống HPLC.
5.13.5.1. Cột phân tích, 5 µm C18, 3,9 mm x 15 cm hoặc loại tương đương.
5.13.5.2. Cột bảo vệ, C18 hoặc loại tương đương.
6. Lấy mẫu
Phương pháp lấy mẫu không được quy định trong tiêu chuẩn này, nên lấy mẫu theo TCVN 4325:2007 (ISO 6497:2002)[1].
Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải đúng là mẫu đại diện, không bị suy giảm chất lượng hay bị thay đổi trong quá trình vận chuyển và bảo quản.
7. Chuẩn bị mẫu thử
7.1. Đối với mẫu dạng viên có kích thước hạt lớn hơn 3 mm: nếu lượng mẫu nhỏ hơn 2 kg thì nghiền trên máy nghiền mẫu có mắt sàng kích thước 3 mm (5.3); nếu lượng mẫu không nhỏ hơn 2 kg thì trộn đều và lấy mẫu theo phương pháp đường chéo để thu được lượng mẫu khoảng 1kg, sau đó nghiền trên máy nghiền mẫu (5.3).
7.2. Đối với mẫu dạng bột có kích thước hạt nhỏ hơn hoặc bằng 3 mm và mẫu dạng viên đã được chuẩn bị theo 7.1 thì trộn đều một lượng mẫu phòng thử nghiệm từ 0,5 kg đến 2 kg bằng thiết bị trộn phòng thử nghiệm (5.4) trong vòng 10 min. Sau đó chia hỗn hợp bằng thiết bị chia đôi hoặc chia tư nếu cần cho đến khi thu được lượng phần mẫu thử không nhỏ hơn 500 g.
7.3. Phần mẫu thử được bảo quản trong lọ kín, ở điều kiện nhiệt độ từ 2°C đến 25°C, nơi khô ráo.
CHÚ THÍCH: Nên chuẩn bị mẫu trong phòng có thông gió. Nên đeo kính, khẩu trang và găng tay bảo vệ.
8. Cách tiến hành
8.1. Chiết mẫu
8.1.1. Cân 80 g ± 1 g phần mẫu thử, chính xác đến 0,0001 g, cho vào bình nón dung tích 500 ml có nút mài (5.7), thêm 200 ml ± 2 ml dung dịch chiết (4.6) và đưa lên máy lắc (5.5) trong thời gian ít nhất là 12 h (để qua đêm), với tốc độ lắc tối thiểu là 250 r/min, sao cho mẫu sau khi lắc được chiết hoàn toàn. Sau đó để yên mẫu trong thời gian 30 min rồi lọc dịch chiết qua giấy lọc Whatman No. 41 (5.6) vào bình nón dung tích 125 ml (5.8).
8.1.2. Pha loãng dịch chiết thu được từ 8.1.1 bằng dung dịch axit axetic loãng (4.3) (tối thiểu 10 lần) sao cho hàm lượng ractopamine-HCl trong dịch chiết sau khi pha nằm trong phạm vi đường chuẩn. Trộn kỹ.
8.1.3. Lọc một thể tích thích hợp dịch chiết đã pha loãng vào trong lọ chứa mẫu (5.12) qua đầu lọc (5.9).
CHÚ THÍCH: Dịch chiết đã pha loãng ổn định được ít nhất 72 h ở nhiệt độ phòng, dưới ánh sáng huỳnh quang.
8.2. Mẫu trắng
Thực hiện chiết mẫu trắng như đối với mẫu thử theo 8.1. Mẫu trắng là mẫu thức ăn chăn nuôi không có ractopamine-HCl.
8.3. Phân tích trên HPLC
8.3.1. Điều kiện vận hành HPLC
- Nhiệt độ cột: nhiệt độ môi trường;
- Tốc độ dòng: 1,0 ml/min;
- Thể tích bơm: 20 µl;
- Bước sóng kích thích: 266 nm;
- Bước sóng phát xạ: 305 nm;
- Thời gian vận hành: 10 min.
8.3.2. Quy trình phân tích trên máy HPLC
Nên sử dụng cột bảo vệ, việc sử dụng bảo vệ cột không có bất cứ ảnh hưởng nào đến kết quả phân tích. Cân bằng hệ thống sắc ký bằng pha động (4.7) trong 30 min trước khi bơm mẫu.
Quy trình bơm mẫu theo thứ tự sau:
- dung dịch mẫu trắng;
- dung dịch chuẩn;
- dung dịch pha loãng;
- mẫu thu hồi;
- mẫu thử nghiệm;
- dung dịch chuẩn.
CHÚ THÍCH: Cần bơm các dung dịch chuẩn trước và sau mỗi đợt phân tích, mỗi đợt phân tích không quá 20 lần bơm mẫu. Nếu vượt quá 20 lần thì phải bơm các dung dịch chuẩn thêm một lần vào khoảng giữa đợt bơm mẫu.
Xác định diện tích (hoặc chiều cao) pic đối với các dung dịch chuẩn và dung dịch mẫu thử tương ứng.
Sau khi vận hành, phải làm sạch hệ thống HPLC bằng hỗn hợp gồm axetonitril (4.2) [hoặc metanol (4.1)] : nước với tỉ lệ 1:1 (thể tích) trong 30 min.
8.4. Đường chuẩn
Dựng đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa diện tích (hoặc chiều cao) pic thu được của dung dịch chuẩn làm việc (4.5.3) với nồng độ ractopnmine-HCl, tính bằng microgam trên mililit (µg/ml), theo quan hệ tuyến tính bậc 1:
y = ax + b
trong đó:
y là diện tích (hoặc chiều cao) pic;
x là nồng độ của ractopamine-HCl;
a là hệ số góc;
b là hằng số.
Phải đảm bảo rằng các diện tích (hoặc chiều cao) pic nhận được của mẫu thử nằm trong phạm vi đường chuẩn. Nếu pic thu được có độ lớn vượt quá độ lớn của pic chuẩn có nồng độ cao nhất thì phải pha loãng phần mẫu thử và phân tích lại.
9. Tính kết quả
Hàm lượng ractopamine-HCl trong mẫu thử, X, được tính bằng miligam trên kilogam (mg/kg) theo công thức sau:
trong đó:
A là hiệu số giữa diện tích (hoặc chiều cao) pic của dịch chiết mẫu thử và diện tích (hoặc chiều cao) pic của mẫu trắng;
a, b là các thông số của đường chuẩn y = ax + b;
V là thể tích dịch pha loãng cuối cùng theo 8.1.2, tính bằng mililit (ml);
w là khối lượng mẫu thử, tính bằng gam (g).
Kết quả cuối cùng là giá trị trung bình của hai lần phân tích lặp lại, được biểu thị đến hai chữ số thập phân.
10. Báo cáo thử nghiệm
Báo cáo kết quả phải bao gồm ít nhất các thông tin dưới đây:
- mọi thông tin cần thiết để nhận biết mẫu thử;
- phương pháp sử dụng, viện dẫn của tiêu chuẩn này;
- kết quả và đơn vị biểu thị kết quả;
- ngày tháng lấy mẫu và kiểu loại lấy mẫu (nếu biết);
- ngày tháng thử nghiệm;
- các điểm đặc biệt quan sát được trong quá trình thử nghiệm;
- mọi thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc được coi là tùy chọn, cùng với các chi tiết về các sự cố bất kỳ mà có thể ảnh hưởng đến kết quả.
THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] TCVN 4325:2007 (ISO 6497:2002) Thức ăn chăn nuôi – Lấy mẫu.