TIÊU CHUẨN QUỐC GIA
TCVN 8407:2010
GIỐNG VI SINH VẬT THÚ Y - QUY TRÌNH NUÔI GIỮ GIỐNG XOẮN KHUẨN LEPTOSPIRA
Master seed of microorganisms for veterinary use - The procedure for preservation of virulent Leptospira strain
TCVN 8407:2010 do Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.
GIỐNG VI SINH VẬT THÚ Y - QUY TRÌNH NUÔI GIỮ GIỐNG XOẮN KHUẨN LEPTOSPIRA
Master seed of microorganisms for veterinary use - The procedure for preservation of virulent Leptospira strain
CẢNH BÁO - Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không thể đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn sức khỏe thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn.
Tiêu chuẩn này quy định quy trình nuôi giữ giống Leptospira được sử dụng trong sản xuất và kiểm nghiệm vắc xin.
2. Yêu cầu đối với giống Leptospira
2.1. Nhận dạng
- Quan sát dưới kính hiển vi nền đen, vi khuẩn có hình xoắn lò xo khoảng 20 vòng xoắn đều nhau, hai đầu hơi uốn cong, kích thước chiều rộng với chiếu dài tương ứng 0,06 mm X (3 đến 30) mm.
- Kháng thể trong máu của động vật mẫn cảm được tiêm canh khuẩn vô hoạt sẽ ngưng kết đặc hiệu với chủng vi khuẩn dùng làm kháng nguyên.
- Vi khuẩn mọc tốt trong các môi trường chuyên dụng, đặc biệt là trong môi trường EMJH (The Johnson and Harris modification of the Ellinghausen and Mc Cullough medium) có pH từ 7,2 đến 7,4 được nuôi cấy hiếu khí ở nhiệt độ từ 28 °C đến 30 °C.
- Soi tươi dưới kính hiển vi nền đen bội giác thấp 10-15 X 10-20, vi khuẩn có dạng mảnh, di động theo nhiều kiểu: thẳng tiến, xoay vòng hoặc bật lò xo.
- Quan sát tiêu bản nhuộm bằng phương pháp Morosop dưới kính hiển vi bội giác cao 10-15 X 100 (vật kính dầu) vi khuẩn có hình sợi, hai đầu hơi cong, bắt màu tím đậm, có kích thước (0,1 đến 1) mm X (6 đến 20) mm. Do đặc tính di động cùng với kích thước nhỏ dài nên qua được màng lọc 0,2 mm.
2.2. Độc lực
2.2.1. Với chuột lang non
Với chuột lang non (khối lượng từ 120 g/con đến 130 g/con): Tiêm liều 3 ml canh khuẩn nuôi từ 4 ngày đến 7 ngày vào xoang bụng sẽ gây sốt nhẹ (tăng 0,5 °C đến 1 °C), có thể có hoàng đản ở niêm mạc mắt, hoặc chết.
2.2.2. Với thỏ non
Với thỏ non (khối lượng từ 200 g/con đến 250 g/con): Tiêm liều 3 ml canh trùng nuôi từ 4 ngày đến 7 ngày vào xoang bụng chỉ gây sốt nhẹ (tăng 0,5 °C đến 1 °C), không có triệu chứng lâm sàng rõ rệt.
2.3. Tính miễn dịch
Thỏ được tiêm dưới da 5 ml kháng nguyên (vô hoạt ở 56 °C trong 60 min) 2 lần cách nhau 7 ngày sẽ sản sinh ra kháng thể ngưng kết với kháng nguyên tương ứng ở hiệu giá thấp nhất là 1/100.
Thỏ được gây miễn dịch theo Phụ lục A phải tạo được kháng thể có hiệu giá ngưng kết với kháng nguyên cùng chủng không dưới 1/10.000, không có phản ứng chéo giữa các chủng ở độ pha loãng huyết thanh 1/6400.
Kháng huyết thanh này được dùng để kiểm tra giống và xác định mẫu dương tính trong phản ứng trung hoà.
3.1. Giữ giống ở nhiệt độ nhỏ hơn hoặc bằng -80 °C
- Giống giữ ở -80 °C được lấy ra khỏi tủ đông sâu và làm rã đông nhanh ở 37 °C, cấy chuyển sang môi trường EMJH mới chuẩn bị. Giống được phục hồi sau khoảng từ 10 ngày đến 15 ngày.
- Giống sau khi phục hồi được tăng cường qua động vật mẫn cảm: Hai chuột lang non (khối lượng từ 120 g/con đến 130 g/con) hoặc hai thỏ non (khối lượng từ 200 g/con đến 250 g/con) được tiêm canh khuẩn vào xoang bụng với liều từ 3 ml/con đến 4 ml/con. Sau 7 h đến 24 h lấy máu cấy vào môi trường EMJH, nuôi cấy ở nhiệt độ từ 28 °C đến 30 °C khoảng từ 7 ngày đến 15 ngày.
- Sau khi tăng cường qua động vật mẫn cảm, giống phải đạt các yêu cầu trong Điều 2.
- Sau khi kiểm tra đạt các yêu cầu trong Điều 2, giống được cấy chuyển sang môi trường EMJH. Bổ sung 2,5 % dimethylsulfoxide (DMSO), chia vào các ống nghiệm và bảo quản nhiệt độ thấp hơn hoặc bằng -80 °C. Cứ 1 năm tăng cường giống 1 lần.
3.2. Giữ giống ở nhiệt độ phòng (28 °C đến 30 °C)
- Giống phải được cấy chuyển 7 ngày một lần sang môi trường chuyên dụng, tỷ lệ giống cấy chuyển là 1 % đến 2 %, nuôi cấy ở nhiệt độ từ 28 °C đến 30 °C. Sau khoảng từ 3 tháng đến 5 tháng giống được tăng cường qua động vật mẫn cảm như 3.1.
- Giống giữ tươi sau khi tăng cường qua động vật phải đạt yêu cầu trong Điều 2.
PHỤ LỤC A
(Quy định)
QUY TRÌNH CHUẨN BỊ KHÁNG HUYẾT THANH ĐƠN GIÁ QUA THỎ
Thỏ dùng chuẩn bị kháng huyết thanh có khối lượng từ 2 kg đến 3 kg, không có kháng thể Leptospira. Thỏ được tiêm canh khuẩn (2 X 108CFU/ml) theo quy trình sau:
- Ngày thứ 1: 2 ml canh khuẩn chết vào dưới da.
- Ngày thứ 8: 4 ml canh khuẩn chết vào dưới da.
- Ngày thứ 15: 0,5 ml canh khuẩn sống vào tĩnh mạch.
- Ngày thứ 18: 1 ml canh khuẩn sống vào tĩnh mạch.
- Ngày thứ 22: 4 ml canh khuẩn sống vào tĩnh mạch.
- Ngày thứ 25: 6 ml canh khuẩn sống vào tĩnh mạch.
Sau 7 ngày lấy máu kiểm tra hiệu giá ngưng kết với kháng nguyên cùng chủng. Huyết thanh thỏ phải đạt hiệu giá ngưng kết > 1/12.800, thu hoạch máu chắt huyết thanh để dùng làm phản ứng ngưng kết kiểm tra giống.
Nếu thỏ vẫn chưa đạt hiệu giá quy định thì được phép tiêm thêm liều 6 ml canh khuẩn sống vào tĩnh mạch. Sau 7 ngày lại lấy máu để kiểm tra hiệu giá ngưng kết. Nếu kết quả không đạt thì loại bỏ thỏ đó.
THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] TCN 941 -2006 Quy trình nuôi giữ giống xoắn khuẩn Leptospira
[2] Australian Standards Dianostic Techniques for Animal Diseases
[3] Pfizer - Leptoferm®5 - USA.
[4] OIE: Chapter 2.2.4-Leptospirosis