TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 8400-56:2023

BỆNH ĐỘNG VẬT - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 56: BỆNH TỤ HUYẾT TRÙNG Ở LỢN, TRÂU, BÒ, GIA CẦM

Animal disease - Diagnostic procedure - Part 56: Pasteurellosis in swine, cattle, poultry

Lời nói đầu

TCVN 8400-56:2023 thay thế TCVN 8400-14:2011 và TCVN 8400-31:2015.

TCVN 8400-56:2023 do Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương, Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

Bộ tiêu chuẩn TCVN 8400 Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán gồm các phần sau đây:

- TCVN 8400-1:2019, Phần 1: Bệnh lở mồm long móng;

- TCVN 8400-2:2010, Phần 2: Bệnh do vi khuẩn Streptococcus suis gây ra trên lợn;

- TCVN 8400-3:2010, Phần 3: Bệnh giun xoắn;

- TCVN 8400-4:2010, Phần 4: Bệnh Niu cátxơn;

- TCVN 8400-5:2011, Phần 5: Bệnh tiên mao trùng;

- TCVN 8400-6:2011, Phần 6: Bệnh xuất huyết thỏ;

- TCVN 8400-7:2011, Phần 7: Bệnh đậu cừu và đậu dê;

- TCVN 8400-8:2011, Phần 8: Bệnh nấm phổi do Aspergillus ở gia cầm;

- TCVN 8400-9:2011, Phần 9: Bệnh viêm gan vịt typ I;

- TCVN 8400-10:2022, Phần 10: Bệnh lao bò;

- TCVN 8400-11:2019, Phần 11: Bệnh dịch tả vịt;

- TCVN 8400-12:2011, Phần 12: Bệnh bạch lỵ và thương hàn ở gà;

- TCVN 8400-13:2019, Phần 13: Bệnh sảy thai truyền nhiễm do Brucella;

- TCVN 8400-15:2019, Phần 15: Bệnh xoắn khuẩn do Leptospira;

- TCVN 8400-16:2011, Phần 16: Bệnh phù ở lợn do vi khuẩn E. coli;

- TCVN 8400-17:2011, Phần 17: Bệnh do Staphylococcus aureus ở gà;

- TCVN 8400-18:2014, Phần 18: Bệnh phù đầu gà (coryza);

- TCVN 8400-19:2014, Phần 19: Bệnh phó thương hàn lợn;

- TCVN 8400-20:2014, Phần 20: Bệnh đóng dấu lợn;

- TCVN 8400-21:2014, Phần 21: Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS);

- TCVN 8400-22:2014, Phần 22: Bệnh giả dại ở lợn;

- TCVN 8400-23:2014, Phần 23: Bệnh ung khí thán;

- TCVN 8400-24:2014, Phần 24: Bệnh viêm phế quản truyền nhiễm;

- TCVN 8400-25:2014, Phần 25: Bệnh cúm lợn;

- TCVN 8400-26:2014, Phần 26: Bệnh cúm gia cầm H5N1;

- TCVN 8400-27:2014, Phần 27: Bệnh sán lá gan;

- TCVN 8400-28:2014, Phần 28: Bệnh viêm ruột hoại tử do Clostridium perfringens;

- TCVN 8400-29:2015, Phần 29: Bệnh Lympho leuko ở gà;

- TCVN 8400-30:2015, Phần 30: Bệnh Marek ở gà;

- TCVN 8400-32:2015, Phần 32: Bệnh gumboro ở gia cầm;

- TCVN 8400-33:2015, Phần 33: Bệnh lê dạng trùng ở trâu bò;

- TCVN 8400-34:2015, Phần 34: Bệnh biên trùng ở trâu bò;

- TCVN 8400-35:2015, Phần 35: Bệnh Theileria ở trâu bò;

- TCVN 8400-36:2015, Phần 36: Hội chứng suy mòn ở lợn sau cai sữa do Circo vi rút typ 2;

- TCVN 8400-37:2015, Phần 37: Bệnh viêm phổi địa phương ở lợn;

- TCVN 8400-38:2015, Phần 38: Bệnh tiêu chảy ở lợn do Corona vi rút;

- TCVN 8400-39:2016, Phần 39: Bệnh viêm đường hô hấp mãn tính ở gà;

- TCVN 8400-40:2016, Phần 40: Bệnh nhiễm trùng huyết ở thủy cầm do vi khuẩn Riemerella anatipestifer gây ra;

- TCVN 8400-41:2019, Phần 41: Bệnh dịch tả lợn châu Phi;

- TCVN 8400-42:2019, Phần 42: Bệnh dịch tả loài nhai lại nhỏ;

- TCVN 8400-43:2019, Phần 43: Bệnh lưỡi xanh;

- TCVN 8400-44:2019, Phần 44: Bệnh roi trùng Trichomonosis;

- TCVN 8400-45:2019, Phần 45: Bệnh gạo lợn, bệnh gạo bò;

- TCVN 8400-46:2019, Phần 46: Bệnh dại;

- TCVN 8400-47:2019, Phần 47: Bệnh dịch tả lợn cổ điển;

- TCVN 8400-48:2020, Phần 48: Bệnh tiêu chảy có màng nhày do vi rút ở bò;

- TCVN 8400-49:2020, Phần 49: Bệnh viêm mũi khí quản truyền nhiễm ở bò;

- TCVN 8400-50:2020, Phần 50: Bệnh viêm não Nhật Bản;

- TCVN 8400-51:2020, Phần 51: Bệnh viêm phổi, màng phổi truyền nhiễm ở bò;

- TCVN 8400-52:2022, Phần 52: Bệnh nhiệt thán ở gia súc;

- TCVN 8400-53:2022, Phần 53: Bệnh viêm phổi hóa mủ do vi khuẩn Ornithobacterium rhinotracheale

- TCVN 8400-54:2022, Phần 54: Bệnh tỵ thư ở gia súc;

- TCVN 8400-55:2022, Phần 55: Bệnh u nhày ở thỏ.

- TCVN 8400-56:2023, Phần 56: Bệnh tụ huyết trùng ở lợn, trâu, bò, gia cầm.

BỆNH ĐỘNG VẬT - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 56: BỆNH TỤ HUYẾT TRÙNG Ở LỢN, TRÂU, BÒ, GIA CẦM

Animal disease - Diagnostic procedure - Part 56: Pasteurellosis in swine, cattle, poultry

CẢNH BÁO - Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không thể đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn sức khỏe thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn.

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh tụ huyết trùng do vi khuẩn Pasteurella multocida gây ra ở lợn, trâu, bò, gia cầm.

Tiêu chuẩn này cũng có thể áp dụng để chẩn đoán bệnh do vi khuẩn Pasteurella multocida gây ra ở động vật có vú, động vật nhai lại hoang dã, dê, cừu, nai, linh dương,...

2  Tài liệu viện dẫn

Tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với tài liệu viện dẫn không ghì năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các bản sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 8128:2015 Vi sinh vật trong thực phẩm, thức ăn chăn nuôi và nước - Chuẩn bị, sản xuất, bảo quản và thử hiệu năng của môi trường nuôi cấy.

TCVN 8402:2010 Bệnh động vật - Quy trình mổ khám.

3  Thuật ngữ, định nghĩa và các từ viết tắt

3.1  Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này sử dụng các thuật ngữ và định nghĩa sau:

3.1.1

Bệnh tụ huyết trùng (Pasteurellosis)

Bệnh truyền nhiễm, thường xảy ra ở thể cấp tính, phổ biến ở lợn, trâu, bò, gia cầm do vi khuẩn Pasteurella multocida gây ra. Ngoài ra động vật có vú, động vật nhai lại, động vật hoang dã cũng có thể mắc bệnh.

Theo phân loại bệnh của Tổ chức Thú y Thế giới, bệnh tụ huyết trùng ở trâu, bò (Haemorrhagic Septicaemia) do Pasteurella multocida typ B và bệnh tụ huyết trùng ở gia cầm (Fowl Cholera - bệnh dịch tả gia cầm) do Pasteurella multocida typ A gây ra được xếp vào danh mục các bệnh truyền nhiễm bảng B.

3.1.2

Vi khuẩn Pasteurella multocida (P. multocida)

Vi khuẩn Gram âm, đa hình thái, thường đứng đơn lẻ hoặc đôi, không di động, không nha bào, hiếu khí, yếm khí tùy tiện, chiều rộng có kích thước từ 0,2 μm đến 0,4 μm và chiều dài có kích thước từ 0,6 μm đến 2,5 μm.

Dựa vào sự khác nhau của giáp mô, chia P. multocida thành 5 typ huyết thanh gồm: A, B, D, E, F. Tùy vào typ huyết thanh của vi khuẩn sẽ gây bệnh khác nhau trên các loài động vật khác nhau.

- P. multocida typ A gây bệnh cho trâu, bò, cừu, lợn, thỏ, gia cầm, một số động vật nuôi và động vật hoang dã.

- P. multocida typ B gây bệnh cho trâu, bò, lợn, gia cầm và một số loài nhai lại khác.

- P. multocida typ D gây bệnh cho lợn (viêm phổi, viêm teo mũi), gia cầm và một số loại vật nuôi.

- P. multocida typ E gây bệnh cho trâu, bò (chỉ ở châu Phi).

- P. multocida typ F gây bệnh cho gà, gà tây.

3.2  Các từ viết tắt

4  Thuốc thử, vật liệu thử và môi trường nuôi cấy

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích; sử dụng nước cất hoặc nước khử ion hoặc nước có độ tinh khiết tương đương không có Rnase, trừ khi có quy định khác.

4.1  Bộ thuốc nhuộm Gram (Xem Phụ lục A.1)

4.2  Bộ thuốc nhuộm Giemsa (Xem Phụ lục A.2)

4.3  Môi trường BHI (Xem Phụ lục B.1)

4.4  Môi trường thạch máu (Xem Phụ lục B.2)

4.5  Máu, là máu cừu hoặc máu bê hoặc máu thỏ, vô trùng.

4.6  Môi trường thạch MacConkey (Xem Phụ lục B.3)

4.7  Các môi trường xác định các đặc tính sinh hóa (Xem Phụ lục C)

4.8  Nguyên liệu cho PCR (Xem Phụ lục D, Phụ lục G)

4.9  Nguyên liệu cho Realtime PCR (Xem Phụ lục E)

4.10  Nguyên liệu cho LAMP (Xem Phụ lục F)

4.11  Nước muối sinh lý, là dung dịch NaCl 0,9 %, vô trùng.

4.12  Chất chống đông, là EDTA hoặc heparin hoặc citrat natri 3,8 %.

5  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm sinh học và các thiết bị, dụng cụ sau:

5.1  Tủ ấm, duy trì nhiệt độ 37 °C ± 0,5 °C

5.2  Kính hiển vi, có vật kính với độ phóng đại 10 X, 40 X, 100 X

5.3  Nồi hấp, duy trì ở nhiệt độ 121 °C.

5.4  Máy ly tâm, ly tâm với gia tốc 1 500 g, 6 000 g, 12 000 g.

5.5  Máy Realtime PCR

5.6  Máy PCR

5.7  Bộ điện di, gồm bộ nguồn điện di, bể điện di, khay điện di.

5.8  Máy đọc gel

5.9  Pank, kéo, vô trùng.

5.10  Bể điều nhiệt, duy trì nhiệt độ từ 56 °C ± 0,5 °C.

5.11  Bơm tiêm, có dung tích 5 ml, 10 ml, vô trùng.

5.12  Kim tiêm, loại 18 G hoặc 20 G hoặc 23 G, vô trùng.

5.13  Ống nghiệm, có thể tích từ 10 ml đến 15 ml, sạch và vô trùng.

5.14  Đĩa petri (hộp lồng), có đường kính từ 90 mm đến 100 mm, sạch và vô trùng.

5.15  Que cấy, vô trùng.

5.16  Bông cồn, bông cot-ton đã được tẩm cồn 70 %

5.17  Tăm bông, vô trùng.

5.18  Phiến kính, sạch.

5.19  Cưa, kìm, vô trùng.

5.20  Cối chày sứ nghiền mẫu, vô trùng.

5.21  Ống ly tâm (hay ống eppendorf), vô trùng, có thể tích 0,2 ml, 1,5 ml.

5.22  Tủ lạnh, duy trì nhiệt độ từ 4 °C đến 8 °C

5.23  Máy lắc (Máy vortex), có tốc độ lắc từ 50 rpm đến 2 400 rpm

5.24  Microp ipet và đầu tip các loại, có dung tích 100 μl, 200 μl, 1000 μl

6  Chẩn đoán lâm sàng

6.1  Đặc điểm dịch tễ

- Bệnh tụ huyết trùng là bệnh truyền nhiễm ở nhiều loài động vật, phổ biến ở lợn, trâu, bò, gia cầm. Bệnh xảy ra thường ở thể cấp tính. Ở lợn, trâu, bò mắc bệnh do P. multocida typ A với đặc trưng là sốt và viêm phổi; Lợn, trâu, bò mắc bệnh do P. multocida typ B với đặc trưng là xuất huyết, nhiễm trùng huyết; Gia cầm mắc bệnh do P. multocida typ A với đặc trưng là tiêu chảy, phân lỏng;

- Động vật mọi lứa tuổi đều có thể mắc bệnh tụ huyết trùng. Trâu, bò thường mắc lúc 2 tuổi đến 3 tuổi; Lợn thường mắc lúc 16 tuần tuổi đến 18 tuần tuổi; Gia cầm thường mắc lúc 3 tuần tuổi đến 4 tuần tuổi;

- Bệnh tụ huyết trùng xảy ra quanh năm, nhưng hay gặp nhất là lúc thời tiết giao mùa, ở miền Bắc là lúc thời tiết chuyển từ mùa xuân sang mùa hè và mùa thu sang mùa đông; ở miền Nam là từ mùa mưa sang mùa khô và ngược lại;

- Bệnh lây trực tiếp từ con ốm sang con khỏe qua tiếp xúc, qua đường hô hấp hoặc gián tiếp qua thức ăn nước uống, dụng cụ chăn nuôi, vận chuyển, động vật trung gian như chó, mèo, chuột, côn trùng, ruồi, muỗi, mòng ....

6.2  Triệu chứng lâm sàng và bệnh tích đại thể

6.2.1  Ở lợn

6.2.1.1  Triệu chứng lâm sàng

Thường gặp ở 3 thể sau:

- Thể cấp tính:

Lợn sốt cao (có thể lên tới 42 °C), khó thở, thở thể bụng.

Da ở vùng bụng, nách, bẹn có màu đỏ tím.

Tỷ lệ chết có thể lên tới 40%.

- Thể bán cấp tính (Thể á cấp tính):

Thể bán cấp tính thường xảy ra ở lợn choai hoặc lợn ở giai đoạn xuất chuồng, từ 16 tuần đến 18 tuần tuổi.

Lợn ho, thở thể bụng.

- Thể mạn tính:

Thường xảy ra ở lợn từ 10 tuần đến 16 tuần tuổi.

Triệu chứng đặc trưng là lợn ho dai dẳng, thở mạnh, sốt nhẹ hoặc sốt không điển hình.

6.2.1.2  Bệnh tích đại thể

- Thể cấp tính: Bệnh tích chưa biểu hiện rõ ràng.

- Thể bán cấp tính:

Xoang ngực, xoang bao tim và xoang phúc mạc tích nhiều nước.

Phổi viêm, màu đỏ sẫm do tụ huyết và xuất huyết. Phổi có nhiều điểm bị gan hóa, có nhiều tổ chức xơ hóa, có thể có ổ hoại tử bã đậu. Màng phổi viêm, có thể dính vào lồng ngực.

Hạch ở hầu, họng sưng, xuất huyết.

- Thể mạn tính:

Xác lợn thường gầy.

Phổi có nhiều điểm bị gan hóa, có nhiều tổ chức xơ hóa, có thể có ổ hoại tử bã đậu.

Có hiện tượng viêm khớp có mủ.

6.2.2  Ở trâu, bò

6.2.2.1  Triệu chứng lâm sàng

Thường gặp ở 3 thể:

- Thể quá cấp tính:

Thể này ít gặp. Trâu, bò phát bệnh nhanh, sốt cao từ 41 °C đến 42 °C, chết nhanh trong vòng 24 h. Trâu, bò có triệu chứng thần kinh như điên cuồng, hung dữ, lồng lên, run rẩy ngã xuống, giãy rụa, ...

- Thể cấp tính:

Thể này xảy ra phổ biến. Thời gian nung bệnh từ 1 ngày đến 3 ngày, trâu, bò sốt cao từ 40 °C đến 42 °C.

Trâu, bò chảy nước mắt, nước mũi liên tục. Các niêm mạc mắt, mũi, miệng đỏ ửng rồi sẫm màu.

Các hạch lympho sưng: đặc biệt là hạch dưới hầu làm cho trâu, bò thè lưỡi ra ngoài, thở khó khăn; hạch trước đùi sưng làm cho trâu, bò đi lại khó khăn.

Trâu, bò nằm liệt, đái ra máu, thở khó khăn, trên niêm mạc có nhiều vết sẫm màu và chết sau 3 ngày đến 5 ngày.

Tỷ lệ chết có thể lên tới 100 %.

- Thể mạn tính:

Rất ít gặp. Đây là thể tiến triển sau của thể cấp tính nếu trâu, bò không chết. Trâu, bò đi lại khó khăn, viêm khớp mạn tính; viêm phế quản và viêm phổi mạn tính; viêm ruột mạn tính biểu hiện là lúc táo bón, lúc tiêu chảy.

6.2.2.2  Bệnh tích đại thể

- Niêm mạc ở mắt, mũi, mồm và tổ chức liên kết dưới da bị tụ huyết, xuất huyết.

- Các hạch lâm ba, đặc biệt là hạch sau hầu, họng sưng to, xuất huyết.

- Xoang ngực, xoang bụng tích nhiều dịch, có lẫn máu.

- Lòng ống khí quản, phế quản có dịch nhày nhớt, nhiều bọt và xuất huyết.

- Tim sưng to, xoang bao tim tích dịch màu vàng, mỡ vành tim xuất huyết, cơ tim xuất huyết.

- Phổi viêm, tổ chức phổi dai, không xốp, có nhiều phần bị gan hóa. Màng phổi viêm tơ huyết, dày lên, có thể dính vào thành lồng ngực.

6.2.3  Ở gia cầm

6.2.3.1  Triệu chứng lâm sàng

Thường thấy ở 3 thể:

- Thể quá cấp tính:

Gia cầm chết nhanh khi chưa biểu hiện triệu chứng.

- Thể cấp tính:

Gia cầm chết khi mới xuất hiện triệu chứng trong vài giờ đến 2 ngày.

Gia cầm ủ rũ, xù lông, bỏ ăn, thở khó, thở mạnh, có dịch nhớt chảy ra từ miệng và mũi.

Gia cầm tiêu chảy, phân lỏng, nhiều nước, phân lúc đầu trắng sau chuyển thành màu xanh, có thể có dịch nhày, lẫn máu.

Toàn thân gia cầm màu xanh tím, nhất là vùng đầu không lông như mào, tích.

- Thể mạn tính:

Đây là thể tiến triển từ thể cấp tính nhưng gia cầm không chết.

Mắt và mũi của gia cầm có chất dịch dính, kết mạc mắt viêm, có dử mắt.

Gia cầm ngoẹo cổ, khó thở, có tiếng khò khè ở khí quản.

Ở vùng đầu, chân, cánh, vùng xương ức của gia cầm có những ổ viêm cục bộ.

6.2.3.2  Bệnh tích đại thể

- Thể quá cấp tính: Chưa biểu hiện bệnh tích.

- Thể cấp tính:

Phổi xuất huyết.

Xoang bao tim có dịch màu vàng. Lớp mỡ vành tim, cơ tim có xuất huyết vệt hoặc lấm tấm bằng đầu đinh ghim.

Dạ dày tuyến xuất huyết lấm tấm.

Gan sưng, trên bề mặt có điểm hoại tử lấm tấm.

Buồng trứng xuất huyết.

Ruột xuất huyết từng mảng lớn hay lấm tấm. Chất chứa trong ruột lẫn máu.

- Thể mạn tính:

Phần mặt sưng, kết mạc mắt viêm.

Có các ổ mủ rải rác trong toàn cơ thể.

Phổi sưng, có viêm.

Gan sưng.

Khớp chân, đệm chân, xoang bụng, vòi trứng có dịch bã đậu.

6.3  Chẩn đoán phân biệt

6.3.1  Chẩn đoán phân biệt bệnh tụ huyết trùng với một số bệnh khác ở lợn

- Bệnh dịch tả lợn cổ điển: Do vi rút thuộc họ Flaviviridae, giống Pestivirus gây ra. Ban đầu lợn sốt cao (41 °C - 42 °C), phân táo; sau khi giảm sốt lợn tiêu chảy, phân thối khắm đặc trưng. Niêm mạc dạ dày, ruột có nhiều mảng xuất huyết, loét, đặc trưng là nốt loét ở van hồi manh tràng. Hạch lâm ba sưng, xuất huyết (như vân đá hoa, nặng hơn thì thâm tím). Lách không sưng, phần rìa có nhồi huyết răng cưa. Thận xuất huyết điểm lan tràn hoặc thành đám trên bề mặt.

- Bệnh dịch tả lợn Châu Phi: Do vi rút thuộc họ Asfaviridae, giống Asfavirus gây ra. Bệnh tích đặc trưng của bệnh là các hạch lâm ba sưng, xuất huyết; Niêm mạc dạ dày, ruột xuất huyết; Lách sưng, xuất huyết nặng; Thận xuất huyết đinh ghim.

- Bệnh đóng dấu lợn: Do vi khuẩn Erysipelothrix rhusiopathiae gây ra. Trên da có những vết (dấu) đỏ hình vuông, hình tròn,... các vết này lúc đầu đỏ tươi, sau đỏ thẫm, tím bầm, khô lại thành vẩy. Van tim viêm, nhất là van 2 lá viêm ở thể loét, sùi. Khớp gối và khớp bàn chân viêm.

- Bệnh phó thương hàn lợn: Do vi khuẩn Salmonella choleraesuis chủng Kunzendorf và Salmonella typhimurium gây nên. Lợn tiêu chảy. Ở phần tai, mõm, bụng và 4 chân của lợn có xuất huyết, sau dần chuyển sang màu xanh, vàng. Ở gan có hoại tử điểm, ruột già có nhiều vết loét.

- Bệnh viêm teo mũi ở lợn: Do vi khuẩn Bordetella bronchiseptica hoặc vi khuẩn P. multocida typ D hoặc cả hai vi khuẩn này kết hợp gây ra. Biểu hiện đặc trưng của bệnh là viêm mũi, xoang mũi gây teo xương mũi hoặc làm cong bã mía mũi làm cho mặt bị méo mó. Lợn từ 1 tuần đến 3 tuần tuổi là mẫn cảm nhất.

- Bệnh viêm phổi màng phổi: Do vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae gây ra. Lợn sốt cao (40,5 °C - 41 °C), có ho, phải há mồm ra để thở, có tư thế ngồi để thở. Màng phổi viêm có nhiều sợi tơ huyết (fibrin), có thể viêm dính vào phần sườn. Phổi viêm thành từng mảng, có tính chất đối xứng.

- Bệnh viêm phổi địa phương (bệnh suyễn lợn): Do vi khuẩn Mycoplasma hyopneumoniae gây ra. Lợn thường gầy, ho, khó thở, không sốt cao (dưới 40 °C). Phổi viêm đối xứng, viêm từ thùy tim sang thùy đỉnh ở phía trước và thùy hoành ở phía sau. Phổi bị viêm lúc đầu có màu đỏ, sau chuyển sang thâm, bề mặt bóng, bên trong có chất keo, tiếp sau phổi chắc lại như miếng thịt (phổi bị nhục hóa).

- Bệnh Glasser’s (bệnh viêm đa xoang) ở lợn: Do vi khuẩn Haemophilus parasuis gây ra. Đặc trưng của bệnh là viêm thanh mạc, viêm màng phổi, viêm màng não, viêm khớp.

6.3.2  Chẩn đoán phân biệt bệnh tụ huyết trùng với một số bệnh khác ở trâu, bò

- Bệnh nhiệt thán: Do vi khuẩn Bacillus anthracis gây ra. Trâu, bò sốt cao (có thể lên tới 42 °C), có triệu chứng thần kinh và chết nhanh. Khi chết, xác chết phình to, các lỗ tự nhiên chảy máu thâm đen, không đông. Lách sưng to, dễ nát.

- Bệnh ung khí thán: Do vi khuẩn Clostridium chauvoei gây ra. Trâu, bò sốt (thường dưới 40 °C). Trên các bắp thịt ở cổ, vai, bắp chân, đùi, mông có các khối sưng (ung) nếu ấn tay thấy lõm và có các tiếng lạo xạo. Cắt ở chỗ có ung, thấy có chất keo lầy nhầy, có thấy sùi bọt, có tiếng lạo xạo, phần cơ có màu thâm đen.

6.3.3  Chẩn đoán phân biệt bệnh tụ huyết trùng với một số bệnh khác ở gia cầm

- Bệnh Newcastle: Do giống Avulavirus, thuộc họ Paramyxoviridae gây ra. Gia cầm bỏ ăn, lông xù, có thể bị liệt chân, liệt cánh (cánh xã như khoác áo tơi), mũi chảy dịch nhớt màu đỏ xám, vươn cổ há mỏ để thở, mào và tích sưng phù, có màu tím sẫm. Khí quản chứa nhiều dịch viêm, niêm mạc viêm cata. Phổi sưng to, xuất huyết. Dạ dày cơ, dạ dày tuyến, lớp mỡ vành tim xuất huyết.

- Bệnh cúm gia cầm độc lực cao: Do vi rút Influenza typ A, thuộc họ Orthomyxoviridae gây ra. Mào và tích gia cầm sưng, thâm tím. Phân thường loãng, có màu trắng, xanh, vàng. Niêm mạc khí quản có dịch nhày lẫn máu. Phổi xung huyết, tụ huyết nặng. Tim, gan, lách, thận xuất huyết, dạ dày, niêm mạc đường tiêu hóa xuất huyết.

- Bệnh phù đầu gà (Coryza): Do vi khuẩn Avibacterium paragallinarum gây ra. Đây là bệnh truyền nhiễm đường hô hấp cấp tính ở gà với các đặc trưng là chảy nước mũi, kết mạc mắt bị viêm cata, túi khí viêm, mặt và tích sưng phù dưới da.

- Bệnh nhiễm trùng huyết ở thủy cầm: Do vi khuẩn Riemerella anatipestifer gây ra. Triệu chứng đầu tiên là thủy cầm bị tiêu chảy, chảy nước mắt, nước mũi, hít thở khó khăn, có ho nhẹ, đi lại khó khăn, kéo lê chân hoặc không đi lại được. Thủy cầm mất cân bằng, sưng phù đầu, nghoẹo cổ, đầu và cổ bị run, dễ bị kích thích bởi tiếng động, hai chân duỗi ra như bơi. Bệnh tích đặc trưng là viêm tơ huyết thành màng ở các cơ quan nội tạng.

7  Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

7.1  Lấy mẫu và bảo quản mẫu

7.1.1  Lấy mẫu

Đối với động vật nghi mắc bệnh còn sống lấy mẫu là dịch tiết đường hô hấp trên hoặc mẫu máu có chất chống đông.

- Lấy mẫu dịch tiết đường hô hấp trên: Dùng tăm bông (5.17) lấy dịch mũi hoặc dịch hầu họng, cho tăm bông vào ống nghiệm (5.13) có chứa dung dịch nước muối sinh lý (4.11), đậy kín, ghi ký hiệu mẫu;

- Mẫu máu có chất chống đông: Sát trùng vị trí lấy máu bằng cồn 70 %, dùng bơm tiêm (5.11) và kim tiêm (5.12) lấy khoảng 1 ml đến 3 ml máu từ tĩnh mạch. Chuyển máu sang ống nghiệm đã có chất chống đông (4.13), trộn đều nhẹ nhàng trong 10 giây, đậy kín, ghi ký hiệu mẫu;

Đối với động vật đã chết hoặc động vật nghi mắc bệnh cần mổ khám để kiểm tra bệnh tích, lấy mẫu bệnh phẩm được thực hiện theo TCVN 8402:2010 và hướng dẫn kỹ thuật về lấy mẫu, bảo quản và vận chuyển mẫu bệnh phẩm động vật trên cạn. Bệnh phẩm bao gồm: Phổi, gan, lách, máu tim, dịch xoang bao tim, tủy xương.

- Lấy mẫu phổi, gan, lách: Dùng pank, kéo (5.9) cắt từ 10 g đến 100 g mỗi loại bệnh phẩm, để vào từng lọ hay túi ni lon vô trùng riêng biệt, đậy kín, ghi ký hiệu mẫu;

- Lấy mẫu máu tim, dịch xoang bao tim: Dùng bơm tiêm (5.11) và kim tiêm (5.12) hoặc pipet (5.24) để hút lấy máu tim, dịch xoang bao tim. Để mẫu trong bơm tiêm hoặc chuyển sang lọ vô trùng riêng biệt, đậy kín, ghi ký hiệu mẫu;

- Tủy xương: Xương ống đã được róc bỏ phần thịt, để vào từng túi ni lon vô trùng riêng biệt, đậy kín, ghi ký hiệu mẫu.

7.1.2  Bảo quản mẫu

Mẫu bệnh phẩm (xem 7.1.1) được đựng trong dụng cụ vô trùng, bảo quản ở nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C trong thùng bảo ôn, vận chuyển đến phòng thí nghiệm tốt nhất trước 24 h kể từ khi lấy mẫu.

CHÚ THÍCH: Tất cả các mẫu phải được dán nhãn, ghi mã kí hiệu, gửi kèm theo phiếu gửi mẫu bệnh phẩm và các thông tin dịch tễ, triệu chứng lâm sàng và bệnh tích của ca bệnh.

7.2  Chuẩn bị mẫu, nuôi cấy và phân lập P. multocida

7.2.1  Chuẩn bị mẫu và nuôi cấy P. multocida

- Mẫu là dịch tiết đường hô hấp trên: Ống nghiệm đã có tăm bông lấy mẫu (xem 7.1.1) được lắc kỹ bằng máy lắc (5.23). Dùng pipet (5.24) hoặc dùng que cấy (5.15) lấy từ 5 μl đến 10 μl dung dịch mẫu nhỏ lên bề mặt môi trường thạch máu (4.4), môi trường thạch MacConkey (4.6), môi trường BHI (4.3). Dùng que cấy (5.15) ria cấy chỗ đã nhỏ bệnh phẩm lên các môi trường thạch;

- Mẫu là máu có chất chống đông, dịch xoang bao tim: Dùng pipet (5.24) hoặc dùng que cấy (5.15) lấy máu hoặc dịch xoang bao tim phết lên bề mặt môi trường thạch máu (4.4), môi trường thạch MacConkey (4.6) và cho vào môi trường BHI (4.3). Dùng que cấy (5.15) ria cấy chỗ đã phết bệnh phẩm lên các môi trường thạch;

- Mẫu là phổi, gan, lách: Sát trùng bề mặt ngoài của mẫu bằng bông cồn (5.16), rồi dùng pank, kéo (5.9) cắt sâu vào tổ chức bên trong lấy một mẫu nhỏ. Dùng pank (5.9) kẹp lấy mẫu bệnh phẩm vừa cắt phết lên bề mặt môi trường thạch máu (4.4), môi trường thạch MacConkey (4.6) và cho mẫu phổi, gan, lách vào môi trường BHI (4.3). Dùng que cấy (5.15) ria cấy chỗ đã phết bệnh phẩm lên các môi trường thạch;

- Mẫu là tủy xương: Dùng cưa, kìm (5.19) cắt phần đầu của xương ống để bộc lộ phần tủy đỏ. Dùng pank, kéo (5.9) để lấy phần tủy đỏ để phết lên bề mặt môi trường thạch máu (4.4), môi trường thạch MacConkey (4.6) và cho vào môi trường BHI (4.3). Dùng que cấy (5.15) ria cấy chỗ đã phết bệnh phẩm lên các môi trường thạch;

Ủ các đĩa và ống môi trường đã cấy mẫu vào trong tủ ấm (5.1). Kiểm tra kết quả sau 18 h đến 24 h.

7.2.2  Phân lập P. multocida

Tính chất mọc của P. multocida trên các loại môi trường sau 18 h đến 24 h nuôi cấy:

- Trong môi trường BHI đã nuôi cấy vi khuẩn (7.2.1): P. multocida mọc làm môi trường đục, lắc có vẩn nhẹ (như sương mù), môi trường không có cặn ở đáy;

- Trên thạch máu đã nuôi cấy vi khuẩn (7.2.1): Khuẩn lạc P. multocida không gây dung huyết, có mùi tanh, có 3 dạng: dạng M (Mucous) - dạng nhầy, ướt, có kích thước to nhất, có màu trắng hơi xám; dạng S (Smooth) - dạng trơn, có kích thước nhỏ, bóng, rìa nhẵn, mặt hơi vồng; dạng R (Rough) - khuẩn lạc thường dẹt, xù xì;

- Trên thạch MacConkey đã nuôi cấy vi khuẩn (7.2.1): P. multocida không mọc;

Chọn khuẩn lạc nghi ngờ cấy vào môi trường BHI (4.3) hoặc thạch máu (4.4) nuôi trong tủ ấm (xem 5.1) để xác định P. multocida.

7.3  Xác định hình thái của P. multocida

7.3.1  Nguyên tắc xác định hình thái của vi khuẩn

Vi khuẩn bắt màu Gram dương hay Gram âm là do sự khác nhau về thành phần và cấu trúc vách của tế bào vi khuẩn. Vi khuẩn Gram dương có lớp peptidoglycan dầy, nhiều axit teichoic và lipid nên không bị cồn tẩy màu, giữ nguyên màu tím. Vi khuẩn Gram âm có một lớp peptidoglydocan gắn với lớp phospholipit kép, xen kẽ các protein ở màng ngoài, lớp màng này dễ bị phá hủy bởi cồn khi tẩy màu, do đó phức hợp tím tinh thể - iốt không bền, bị tẩy màu và được thay bằng bằng màu hồng của thuốc nhuộm fuchsin.

7.3.2  Xác định hình thái P. multocida từ bệnh phẩm

Cách làm tiêu bản:

- Từ bệnh phẩm máu có chất chống đông: Lấy 1 giọt máu nhỏ lên 1 phiến kính (5.18), sau đó dùng 1 phiến kính khác dàn mỏng giọt máu, để khô;

- Từ bệnh phẩm (phổi, gan, lách, tủy xương): Cắt một miếng nhỏ bệnh phẩm, phết mỏng trên phiến kính (5.18), để khô.

Tiêu bản đã được để khô, nhỏ cồn methanol ngập tiêu bản, để khô.

Sau đó tiêu bản được nhuộm theo phương pháp nhuộm Gram (xem Phụ lục A.1); Hoặc phương pháp nhuộm Giemsa (xem Phụ lục A.2);

Đọc kết quả nhuộm:

- Nhuộm Gram: P. multocida bắt màu hồng (màu của Gram âm), đa hình thái (cầu khuẩn, trực khuẩn, cầu trực khuẩn), lưỡng cực (hai đầu đậm hơn).

- Nhuộm Giemsa: P. multocida bắt màu xanh tím, đa hình thái, lưỡng cực.

7.3.3  Xác định hình thái P. multocida từ canh khuẩn, khuẩn lạc

Từ canh khuẩn (môi trường BHI đã nuôi cấy vi khuẩn) hoặc khuẩn lạc nghi ngờ là P. multocida (xem 7.2.2) tiến hành làm tiêu bản:

- Từ khuẩn lạc: Nhỏ 1 giọt nước muối sinh lý (4.11) lên phiến kính (5.18), dùng que cấy (5.15) lấy khuẩn lạc hòa đều vào giọt nước muối sinh lý.

- Từ canh khuẩn: Dùng que cấy (5.15) lấy một vòng canh khuẩn dàn mỏng lên trên phiến kính (5.18).

Tiêu bản được để khô và cố định trên ngọn lửa đèn cồn khoảng từ 3 giây đến 5 giây;

Nhuộm tiêu bản bằng phương pháp nhuộm Gram (xem Phụ lục A.1);

Đọc kết quả nhuộm Gram: P. multocida bắt màu hồng (màu của Gram âm), đa hình thái (cầu khuẩn, trực khuẩn, cầu trực khuẩn).

LƯU Ý: Việc xác định hình thái của vi khuẩn bằng kính hiển vi chỉ là nhận định ban đầu, chưa thể xác định được vi khuẩn. Cần xác định vi khuẩn bằng các phương pháp khác như các đặc tính sinh hóa của vi khuẩn, phương pháp PCR, LAMP, Realtime PCR, ngưng kết.

7.4  Xác định P. multocida bằng phản ứng sinh hóa

Từ canh khuẩn hoặc khuẩn lạc nghi ngờ là P. multocida (xem 7.2.2) tiến hành xác định một số đặc tính sinh hóa đặc trưng được nêu trong Bảng 1.

Môi trường xác định các đặc tính sinh hóa của P. multocida và cách tiến hành các phản ứng được nêu trong Phụ lục C.

Xác định đặc tính sinh hóa của P. multocida có thể sử dụng kít thương mại hoặc máy định danh vi khuẩn. Quy trình tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Bảng 1 - Một số đặc tính sinh hóa đặc trưng của P. multocida

7.5  Xác định P. multocida bằng phương pháp PCR

7.5.1  Chuẩn bị mẫu

- Với mẫu bệnh phẩm là dịch đường hô hấp trên: Ống nghiệm đã có tăm bông lấy mẫu (xem 7.1.1) được lắc kỹ bằng máy lắc (5.23). Dùng pipet (5.24) lấy 200 μl dung dịch mẫu cho vào ống ly tâm 1,5 ml để tách chiết ADN của vi khuẩn;

- Với mẫu bệnh phẩm là máu có chất chống đông hoặc dịch xoang bao tim: Dùng pipet (5.24) lấy 200 μl mẫu cho vào ống ly tâm 1,5 ml để tách chiết ADN của vi khuẩn;

- Với mẫu bệnh phẩm là phổi, gan, lách, tủy xương: Đồng nhất mẫu bằng cách dùng pank kéo (5.9) cắt nhỏ và nghiền mẫu bệnh phẩm với nước muối sinh lý (4.11) theo tỉ lệ 1 : 9 (phần thể tích) bằng cối chày sứ (5.20) hoặc bằng máy nghiền mẫu, máy dập mẫu. Chuyển huyễn dịch bệnh phẩm vừa đồng nhất vào ống ly tâm và ly tâm với gia tốc 1.500 g trong 10 min, loại bỏ cặn thu lấy dịch nổi phía trên vào ống 1,5 ml để tách chiết ADN của vi khuẩn;

Với khuẩn lạc nghi ngờ là P. multocida, lấy từ 3 khuẩn lạc đến 4 khuẩn lạc, hòa vào 200 μl nước vô trùng không chứa nuclease (nuclease free water); Với canh khuẩn thì lấy 200 μI để tách chiết ADN của vi khuẩn.

7.5.2  Tách chiết ADN

Tách chiết ADN từ bệnh phẩm hoặc vi khuẩn nghi ngờ bằng kít thương mại. Quy trình tách chiết theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: Kít tách chiết ADN của hãng Qiagen (DNeasy Blood & Tissue Kit, Catalog number: 69504); Kít tách chiết ADN của hãng Invitrogen (PureLink™ Genomic DNA Mini Kit, Catalog number: K182002).

Với vi khuẩn hay canh khuẩn nghi ngờ là P. multocida có thể tách chiết ADN của vi khuẩn bằng phương pháp sốc nhiệt (xem Phụ lục D.2).

7.5.3  Tiến hành

Xác định P. multocida bằng phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu được nêu trong bảng 2.

Bảng 2 - Cặp mồi xác định P. multocida ^[1,7]

[1] OIE, 2021. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. Chapter 3.4.10: Heamorrhagic septiceamia;

[7] Development of PCR assays for species and type specific identification of Pasteurella multocida isolates.

Chuẩn bị mẫu, các bước tiến hành phản ứng PCR, chu trình nhiệt của phản ứng PCR được quy định tại Phụ lục D

7.5.4  Đọc kết quả

Mẫu kiểm tra dương tính khi có vạch sản phẩm giống mẫu đối chứng dương (kích cỡ sản phẩm 460 bp);

Mẫu kiểm tra âm tính khi không có vạch sản phẩm giống mẫu đối chứng dương.

7.6  Xác định P. multocida bằng phương pháp Realtime PCR

7.6.1  Chuẩn bị mẫu

Xem 7.5.1.

7.6.2  Tách chiết ADN

Xem 7.5.2.

7.6.3   Tiến hành

Xác định P. multocida bằng phương pháp Realtime PCR với cặp mồi và mẫu dò đặc hiệu được nêu trong bảng 3.

Bảng 3 - Cặp mồi và mẫu dò xác định P. multocida ^[2]

[2] OIE, 2021. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. Chapter 3.3.9: Fowl Cholera

Chuẩn bị mẫu, các bước tiến hành phản ứng Realtime PCR, chu trình nhiệt của phản ứng Realtime PCR được quy định tại Phụ lục E.

7.6.4  Đọc kết quả

Xem Phụ lục E.5.

7.7  Xác định P. multocida bằng phương pháp LAMP

7.7.1  Chuẩn bị mẫu

Xem 7.5.1.

7.7.2  Tách chiết ADN

Xem 7.5.2.

7.7.3  Tiến hành

Xác định P. multocida bằng phương pháp LAMP với cặp mồi đặc hiệu được nêu trong bảng 4.

Bảng 4 - Trình tự các cặp mồi cho phản ứng LAMP ^[9]

[9] Loop-mediated Isothermal Amplification assay (LAMP) based detection of Pasteurella multocida in cases of haemorrhagic septicaemia and fowl cholera

CHÚ THÍCH: dấu (+) được thay bằng trình tự TTTT khi thiết kế mồi để nối giữa trình tự F1c và F2 (trong mồi FIP), nối trình tự B2 và B1c (trong mồi BIP).

Chuẩn bị mẫu, các bước tiến hành phản ứng LAMP, chu trình nhiệt của phản ứng và đọc kết quả được quy định tại Phụ lục F.

7.7.4  Đọc kết quả

Kết quả của phản ứng LAMP có thể đọc bằng mắt ở điều kiện ánh sáng bình thường dựa vào sự thay đổi màu của dung dịch trong ống phản ứng:

+ Mẫu kiểm tra dương tính: Ống mẫu có thay đổi màu, giống mẫu của ống đối chứng dương;

+ Mẫu kiểm tra âm tính: Ống mẫu không thay đổi màu, có mẫu giống đối chứng âm.

Kết quả của phản ứng LAMP có thể đọc bằng đèn tia cực tím (đèn UV) hoặc điện di (Xem Phụ lục F.5).

7.8  Xác định typ huyết thanh của P. multocida bằng phương pháp PCR

7.8.1  Chuẩn bị mẫu

Xem 7.5.1.

7.8.2  Tách chiết ADN

Xem 7.5.2.

7.8.3  Tiến hành

Xác định P. multocida thuộc typ A hoặc typ B bằng phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu được nêu trong bảng G.1.

Chuẩn bị mẫu, các bước tiến hành phản ứng PCR, chu trình nhiệt của phản ứng PCR được quy định tại Phụ lục G

7.8.4  Đọc kết quả

Xem Phụ lục G.6.

Mẫu kiểm tra dương tính với P. multocida typ A khi kết quả PCR có vạch sản phẩm giống mẫu đối chứng dương (sản phẩm là 564 bp) hoặc mẫu kiểm tra dương tính với P. multocida typ B khi kết quả PCR có vạch sản phẩm giống mẫu đối chứng dương (sản phẩm là 620 bp).

Mẫu kiểm tra âm tính khi không có vạch sản phẩm giống mẫu đối chứng dương.

7.9  Xác định P. multocida bằng phương pháp ngưng kết

7.9.1  Chuẩn bị mẫu

Mẫu kiểm tra: canh khuẩn, khuẩn lạc nghi ngờ là P. multocida (xem 7.2.2).

Mẫu đối chứng dương: là kháng nguyên chuẩn (xem H.2.2).

Mẫu đối chứng âm (xem H.2.3).

7.9.2  Cách tiến hành

Xem Phụ lục H.

7.9.3  Đọc kết quả

Mẫu kiểm tra dương tính: có xuất hiện các hạt ngưng kết lấm tấm.

Mẫu kiểm tra âm tính: không xuất hiện hạt ngưng kết.

8  Kết luận

Lợn, trâu, bò, gia cầm được kết luận mắc bệnh tụ huyết trùng khi có đặc điểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đặc trưng của bệnh và một trong số các kết quả sau đây:

- Phân lập, xác định hình thái (xem 7.3) và xác định được vi khuẩn bằng các phản ứng sinh hóa (xem 7.4);

- Kết quả xét nghiệm PCR dương tính với P. multocida (xem 7.5);

- Kết quả xét nghiệm Realtime PCR dương tính với P. multocida (xem 7.6);

- Kết quả xét nghiệm LAMP dương tính với P. multocida (xem 7.7);

- Kết quả xét nghiệm PCR dương tính với P. multocida typ A hoặc typ B (xem 7.8);

- Kết quả xét nghiệm ngưng kết dương tính với P. multocida (xem 7.9).

Phụ lục A

(Quy định)

Các phương pháp nhuộm P. multocida

A.1  Phương pháp nhuộm Gram

A.1.1  Thuốc thử

A.1.1.1  Dung dịch tím tinh thể

Hòa tan tím tinh thể trong etanol và hòa tan amoni oxalat trong nước. Sau đó, trộn 2 dung dịch này với nhau và lắc cho tan hết.

A.1.1.2  Dung dịch fuchsin đậm đặc

Khi dùng, pha loãng dung dịch fuchsin đậm đặc với nước theo tỉ lệ 1 : 10 (thể tích).

A.1.1.3  Dung dịch lugol

Nghiền kali iodua và iốt tinh thể, cho nước vào từ từ và lắc cho tan.

A.1.1.4  Cồn axeton

A.1.2  Cách tiến hành

Nhỏ dung dịch tím tinh thể lên tiêu bản, để từ 1 min đến 2 min sau đó rửa nước nhanh và để khô.

Nhỏ dung dịch lugol, để 1 min sau đó rửa nước nhanh và để khô.

Nhỏ cồn axeton, rửa nước thật nhanh và để khô.

Nhỏ dung dịch fuchsin loãng, để 1 min sau đó rửa nước rồi thấm khô hoặc để khô.

A.1.3  Soi tiêu bản

Nhỏ 1 giọt dầu vào tiêu bản và soi tiêu bản bằng kính hiển vi quang học (5.2).

A.2  Phương pháp nhuộm Giemsa

A.2.1  Thuốc thử

A.2.1.1  Dung dịch Giemsa đậm đặc

Làm nóng glyxerin trong bể điều nhiệt (5.10). Thêm thuốc nhuộm Giemsa trộn đều và ủ trong 2 h. Sau đó để nguội và thêm cồn methanol và giữ trong khoảng 2 tuần trước khi sử dụng.

Khi sử dụng pha loãng theo tỷ lệ 1:10 (thể tích) trong dung dịch đệm phosphate 0,01 M (pH = 7,0) và giữ trong 30 min.

A.2.1.2  Dung dịch đệm phosphate

Hòa tan natri hydrophotphat, kali dihydrophotphat trong nước và lắc cho tan hết.

CHÚ THÍCH: Có thể sử dụng thuốc nhuộm Giemsa thương mại và pha loãng theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

A.2.2  Cách tiến hành

Sau khi làm xong tiêu bản máu, cố định bằng cồn metanol nguyên chất trong 10 min rồi rửa bằng nước.

Nhỏ dung dịch Giemsa ngập tiêu bản, để từ 20 min đến 30 min, rồi rửa nhanh với nước và sấy khô.

A.2.3  Soi tiêu bản

Nhỏ 1 giọt dầu vào tiêu bản và soi tiêu bản bằng kính hiển vi quang học (5.2).

Phụ lục B

(Quy định)

Môi trường nuôi cấy P. multocida

B.1  Môi trường BHI

B.1.1  Nguyên liệu

Thành phần:

VÍ DỤ: (*) dùng môi trường BHI (Brain Heart infusion) của hãng Merck (Cat. No. 110493)

Thạch máu cơ bản ^(**)

VÍ DỤ: (**) dùng môi trường thạch máu cơ bản (Blood agar base) của hãng Merck (Cat. No. 110886)

Môi trường thạch MacConkey^(***)

Phụ lục C

(Quy định)

Xác định các đặc tính sinh hóa của P. multocida

C.1  Môi trường và thuốc thử

C.1.1  Môi trường thạch Kligler hoặc thạch TSI (Triple Sugar Iron agar)

Thành phần:

VÍ DỤ: dùng môi trường thạch Kligler của hãng Merck (Cat. No. 103913)

Pepton