TCVN 8400-45 : 2019
BỆNH ĐỘNG VẬT - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 45: BỆNH GẠO LỢN, BỆNH GẠO BÒ
Animal diseases - Diagnostic procedure - Part 45: Porcine cysticercosis, Bovine cysticercosis
Lời nói đầu
TCVN 8400-45 : 2019 được xây dựng trên cơ sở tham khảo tài liệu của tổ chức Thú y thế giới (OIE).
TCVN 8400-45 : 2019 do Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương - Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.
Bộ tiêu chuẩn TCVN 8400 Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán gồm các phần sau:
- TCVN 8400-1 : 2019, phần 1: Bệnh lở mồm long móng;
- TCVN 8400-2 : 2010, phần 2: Bệnh do vi khuẩn Streptococcus suis gây ra trên lợn;
- TCVN 8400-3 : 2010, phần 3: Bệnh giun xoắn;
- TCVN 8400-4 : 2010, phần 4: Bệnh Niu Cát Xơn;
- TCVN 8400-5 : 2011, phần 5: Bệnh tiên mao trùng;
- TCVN 8400-6 : 2011, phần 6: Bệnh xuất huyết thỏ;
- TCVN 8400-7 : 2011, phần 7: Bệnh đậu cừu và đậu dê;
- TCVN 8400-8 : 2011, phần 8: Bệnh nấm phổi do Aspergillus ở gia cầm;
- TCVN 8400-9 : 2011, phần 9: Bệnh viêm gan vịt typ I;
- TCVN 8400-10 : 2011, phần 10: Bệnh lao bò;
- TCVN 8400-11 : 2019, phần 11: Bệnh dịch tả vịt;
- TCVN 8400-12 : 2011, phần 12: Bệnh bạch lỵ và thương hàn ở gà;
- TCVN 8400-13 : 2019, phần 13: Bệnh sảy thai truyền nhiễm do Brucella;
- TCVN 8400-14 : 2011, phần 14: Bệnh tụ huyết trùng ở trâu bò;
- TCVN 8400-15 : 2011, phần 15: Bệnh xoắn khuẩn do Leptospira;
- TCVN 8400-16 : 2011, phần 16: Bệnh phù ở lợn do vi khuẩn E.coli;
- TCVN 8400-17 : 2011, phần 17: Bệnh do Staphylococcus aureus ở gà;
- TCVN 8400-18 : 2014, phần 18: Bệnh phù đầu gà (coryza);
- TCVN 8400-19 : 2014, phần 19: Bệnh phó thương hàn lợn;
- TCVN 8400-20 : 2014, phần 20: Bệnh đóng dấu lợn;
- TCVN 8400-21 : 2014, phần 21: Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS);
- TCVN 8400-22 : 2014, phần 22: Bệnh giả dại ở lợn;
- TCVN 8400-23 : 2014, phần 23: Bệnh ung khí thán;
- TCVN 8400-24 : 2014, phần 24: Bệnh viêm phế quản truyền nhiễm;
- TCVN 8400-25 : 2014, phần 25: Bệnh cúm lợn;
- TCVN 8400-26 : 2014, phần 26: Bệnh cúm gia cầm H5N1;
- TCVN 8400-27 : 2014, phần 27: Bệnh sán lá gan;
- TCVN 8400-28 : 2014, phần 28: Bệnh viêm ruột hoại tử do Clostridium perfringens;
- TCVN 8400-29 : 2015, phần 29: Bệnh Lympho leuko ở gà;
- TCVN 8400-30 : 2015, phần 30: Bệnh Marek ở gà;
- TCVN 8400-31 : 2015, phần 31: Bệnh tụ huyết trùng gia cầm;
- TCVN 8400-32 : 2015, phần 32: Bệnh gumboro ở gia cầm;
- TCVN 8400-33 : 2015, phần 33: Bệnh lê dạng trùng ở trâu bò;
- TCVN 8400-34 : 2015, phần 34: Bệnh biên trùng ở trâu bò;
- TCVN 8400-35 : 2015, phần 35: Bệnh Theileria ở trâu bò;
- TCVN 8400-36 : 2015, phần 36: Hội chứng suy mòn ở lợn sau cai sữa do Circo virus typ 2;
- TCVN 8400-37 : 2015, phần 37: Bệnh viêm phổi địa phương ở lợn;
- TCVN 8400-38 : 2015, phần 38: Bệnh tiêu chảy ở lợn do Corona virus;
- TCVN 8400-39 : 2016, phần 39: Bệnh viêm đường hô hấp mãn tính ở gà và gà tây;
- TCVN 8400-40 : 2016, phần 40: Bệnh nhiễm trùng huyết ở thủy cầm do vi khuẩn Riemerella anatipestifer gây ra;
- TCVN 8400-41 : 2019, phần 41: Bệnh dịch tả lợn châu Phi;
- TCVN 8400-42 : 2019, phần 42: Bệnh dịch tả loài nhai lại;
- TCVN 8400-43 : 2019, phần 43: Bệnh lưỡi xanh;
- TCVN 8400-44 : 2019, phần 44: Bệnh roi trùng Trichomonosis;
- TCVN 8400-45 : 2019, phần 45: Bệnh gạo lợn, bệnh gạo bò;
- TCVN 8400-46 : 2019, phần 46 : Bệnh Dại;
- TCVN 8400-47 : 2019, phần 47: Bệnh dịch tả lợn cổ điển;
BỆNH ĐỘNG VẬT - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 45: BỆNH GẠO LỢN, BỆNH GẠO BÒ
Animal diseases - Diagnostic procedure - Part 45: Porcine cysticercosis, Bovine cysticercosis
CẢNH BÁO - Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không thể đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn sức khỏe thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn.
1 Phạm vi áp dụng
Tiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh do nang sán Taenia solium ở lợn và nang sán Taenia saginata ở bò.
2 Thuật ngữ và định nghĩa
Trong tiêu chuẩn này sử dụng các thuật ngữ và định nghĩa sau:
2.1
Bệnh gạo lợn (Porcine cysticercosis/Taenia solium cysticercosis)
Bệnh gạo lợn là bệnh do ấu trùng sán dây Taenia solium (Cysticercus cellulosae) gây ra ở lợn với đặc trưng là các nang sán trong cơ như cơ lưỡi, cơ tim, cơ hoành, cơ hàm, cơ má, cơ cổ, cơ mông.
2.2
Bệnh gạo bò (Bovine cysticercosis/ Taenia saginata cysticercosis)
Bệnh gạo bò là bệnh do ấu trùng sán dây Taenia saginata (Cysticercus bovis) gây ra ở bò với đặc trưng là các nang sán trong cơ như cơ lưỡi, cơ tim, cơ hoành, cơ hàm, cơ má, cơ cổ, cơ mông.
3 Thuốc thử, vật liệu thử
Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết để phân tích, sử dụng nước cất, nước khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương không có nuclease, trừ các trường hợp có quy định khác.
3.1 Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho phương pháp nhuộm Haemotoxylin và Eosin
3.1.1 Formalin 10 % (thể tích) là dung dịch được pha từ dung dịch formaldehyde 38 % và dung dịch PBS (dung dịch đệm phosphat) với tỷ lệ 1 : 9.
3.1.2 Ethanol (C2H5OH) 70 % (thể tích), 90 % (thể tích) và tuyệt đối.
3.1.3 Xylen (C8H10).
3.1.4 Haematoxylin.
3.1.5 Eosin.
3.1.6 Paraffin, có độ nóng chảy từ 56 °C đến 60 °C.
3.1.7 Keo dán lamen.
3.2 Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho phương pháp PCR-RFLP (polymerase chain reaction - restriction fragment length polyphism) phát hiện kháng nguyên Taenia spp.
3.2.1 Kít tách chiết DNA (cho mẫu máu hoặc mẫu mô)
3.2.2 Kít nhân gen.
3.2.3 Cặp mồi (primers), gồm mồi xuôi và mồi ngược.
3.2.4 Agarose.
3.2.5 Dung dịch đệm TAE hoặc TBE (dung dịch đệm borat ethylenediamine tetra-acetic acid), (xem phụ lục D).
3.2.6 Sybr safe hoặc ethidium bromide.
3.2.7 Loading dye 6X (chất đệm tải mẫu).
3.2.8 Dung dịch đệm TE.
3.2.9 Thang chuẩn DNA (Ladder, marker).
3.2.10 Enzyme (gồm DdE I/ Hinf I/Hpa I).
3.2.11 Nước tinh khiết không có nuclease.
3.2.12 Đối chứng dương với giá trị Ct đã biết.
3.3. Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho phương pháp ELISA (enzymed linked immunosorbent assay) phát hiện kháng thể Taenia spp.
Hiện nay các kít ELISA thương mại có sẵn trên thị trường dùng để phát hiện kháng thể Taenia spp.. Khi sử dụng phương pháp ELISA cần theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất.
4 Thiết bị, dụng cụ
Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm và các thiết bị, dụng cụ sau:
4.1 Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp nhuộm Haemotoxylin và Eosin
4.1.1 Khuôn nhựa, loại chuyên dụng cho làm tiêu bản vi thể.
4.1.2 Máy xử lý mẫu mô tự động.
4.1.3 Nồi đun paraffin, có thể duy trì ở nhiệt độ từ 56 °C đến 65 °C.
4.1.4 Khay sắt, loại chuyên dụng cho làm tiêu bản vi thể.
4.1.5 Máy làm lạnh tiêu bản, có thể duy trì ở nhiệt độ từ âm 10 °C đến 4 °C.
4.1.6 Máy cắt tiêu bản, có thể cắt ở độ mỏng từ 3 µm đến 5 µm.
4.1.7 Nồi dãn tiêu bản, có thể làm nóng nước ở nhiệt độ từ 35 °C đến 65 °C.
4.1.8 Phiến kính.
4.1.9 Lamen.
4.1.10 Bộ cốc nhuộm tiêu bản hoặc máy nhuộm tiêu bản tự động.
4.1.11 Kính hiển vi quang học, có vật kính 4 X, 10 X, 20 X, 40 X, 60 X.
4.2 Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp PCR phát hiện kháng nguyên T. solium, T. saginata
4.2.1 Máy nhân gen PCR.
4.2.2 Máy ly tâm, có thể đạt gia tốc ly tâm 900 g; 6 000 g và 20 000 g.
4.2.3 Máy lắc trộn vortex.
4.2.4 Máy spindown.
4.2.5 Bộ điện di, gồm bộ nguồn và bể chạy điện di.
4.2.6 Máy đọc gel (blue light transilluminator hoặc UV light).
4.3 Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp ELISA phát hiện kháng thể Taenia spp.
4.3.1 Tủ ấm, có thể duy trì nhiệt độ ở 37 °C.
4.3.2 Máy đọc ELISA, có thể đọc ở bước sóng 405 nm.
5 Chẩn đoán lâm sàng
5.1 Dịch tễ học
- Lợn là vật chủ trung gian của sán Taenia solium, bò là vật chủ trung gian của sán Taenia saginata. Người là vật chủ cuối cùng của 2 loài sán trên.
- Đường truyền lây: Lợn bị nhiễm bệnh khi ăn phải trứng của sán T. solium, bò bị nhiễm bệnh khi ăn phải trứng của sán T. saginata ký sinh ở người thải ra.
- Bệnh thường xuất hiện ở những nơi có tập quán chăn nuôi thả rông, điều kiện chăn nuôi và vệ sinh kém, hố xí không tự hoại.
5.2 Triệu chứng lâm sàng
- Lợn, bò mắc bệnh gạo thường không có các biểu hiện triệu chứng điển hình.
- Sờ nắn lưỡi có thể phát hiện các nang sán trong cơ lưỡi.
5.3 Bệnh tích
- Khi mổ khám, thấy các nang sán giống hạt gạo phân bố ở các cơ: cơ lưỡi, cơ hàm, cơ tim, cơ hoành, cơ má, cơ đùi.
- Đặc điểm của nang sán gạo lợn: bọc màu trắng, hình hạt gạo đường kính 8 mm - 10 mm, bên trong chứa dịch thể trong suốt và một đầu sán lộn ngược ra phía ngoài. Vỏ bọc là lớp mô liên kết, đầu sán hình cầu, có 4 giác bám, có đỉnh đầu và 2 hàng móc đỉnh.
- Đặc điểm của nang sán gạo bò: hình bọc nhỏ, hơi tròn, màu trắng trong, dài 5 mm - 9 mm, rộng 3 mm - 6 mm, trong bọc chứa dịch thể trong suốt và một đầu sán lộn ngược ra phía ngoài. Đầu sán có 4 giác bám, không có đỉnh và móc đỉnh.
6 Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm
6.1 Lấy mẫu và xử lý mẫu bệnh phẩm
Đối với lợn, bò khi được mổ khám: lấy phần cơ lưỡi, cơ tim, thịt (cơ) nghi ngờ có nang sán. Tùy từng phương pháp xét nghiệm để xử lý và bảo quản phù hợp.
6.2 Phát hiện nang sán bằng cắt lát các cơ
6.2.1 Bảo quản mẫu
Mẫu xét nghiệm (xem 6.1) được bao gói bằng túi nilon, miệng túi được dán kín, bảo quản ở nhiệt độ 4 °C - 8 °C.
6.2.2 Cách tiến hành
Dùng dao cắt lát các cơ sao cho các mặt cắt song song và độ dày của lát cắt không quá 5 mm, quan sát để phát hiện sự có mặt của các nang sán.
6.2.3 Đọc kết quả
Mẫu dương tính:
- Với bệnh gạo lợn: khi phát hiện nang sán có mặt trong cơ lưỡi, cơ tim, thịt (cơ) lợn có đặc điểm: bọc màu trắng, hình hạt gạo đường kính từ 8 mm đến 10 mm, bên trong chứa dịch thể trong suốt và 1 đầu nang sán lộn ngược ra phía ngoài, màu trắng.
- Với bệnh gạo bò: khi phát hiện nang sán có mặt trong cơ lưỡi, cơ tim, thịt (cơ) bò có đặc điểm: hình bọc nhỏ, hơi tròn, màu trắng trong, dài từ 5 mm đến 9 mm, rộng từ 3 mm đến 6 mm, trong bọc chứa dịch thể trong suốt và một đầu sán lộn ngược ra phía ngoài, màu trắng.
Mẫu âm tính khi không phát hiện nang sán ở các cơ.
6.3 Phát hiện nang sán bằng phương pháp nhuộm Haemotoxylin và Eosin
6.3.1 Xử lý mẫu
Cắt mẫu xét nghiệm (xem 6.1) có các nang sán nghi ngờ với độ dày từ 5 mm đến 10 mm cho vào lọ chứa formalin 10 % (thể tích) (3.1.1) sao cho thể tích mẫu bệnh phẩm và formalin 10 % (thể tích) (3.1.1) có tỷ lệ là 1:10 (thể tích), ghi ký hiệu mẫu trên thành lọ.
6.3.2 Bảo quản mẫu
Mẫu xét nghiệm đảm bảo ngập trong formalin 10 % (thể tích) (3.1.1) theo tỷ lệ mẫu bệnh phẩm và formalin 10 % (thể tích) (3.1.1) là 1:10 (thể tích). Nếu chưa xét nghiệm trong vòng 24 h, bổ sung hoặc thay mới formalin 10 % (thể tích) (3.1.1).
6.3.3 Chuẩn bị mẫu
- Mẫu bệnh phẩm được cố định trong dung dịch formalin 10 % (thể tích) (3.1.1) trong thời gian 24 h;
- Cắt các tổ chức đã cố định trên thành miếng nhỏ dày khoảng 1 mm, dài khoảng 1 cm rồi đặt vào khuôn nhựa (4.1.1).
6.3.4 Cách tiến hành
6.3.4.1 Xử lý mẫu bằng máy xử lý mô tự động
- Đổ hóa chất vào các cốc của máy xử lý mẫu mô tự động (4.1.2) theo trình tự: 2 cốc đựng Ethanol 70 % (thể tích) (3.1.2), 2 cốc đựng Ethanol 90 % (thể tích) (3.1.2), 2 cốc đựng Ethanol tuyệt đối (3.1.2), 2 cốc đựng xylen (3.1.3), 2 cốc đựng paraffin (3.1.6).
- Cài đặt thời gian: điều chỉnh nút cài đặt thời gian cho từng cốc hóa chất từ 1 h đến 2h.
- Đặt khuôn nhựa (4.1.1) đựng mẫu vào giỏ của máy xử lý mẫu mô tự động (4.1.2), treo giỏ vào móc tương ứng với cốc đựng Ethanol 70 % (thể tích) (3.1.2).
- Bật máy hoạt động, để máy chạy tự động đến khi kết thúc chu trình xử lý mô.
GHI CHÚ: Trường hợp không dùng máy xử lý mô tự động, xử lý mẫu thủ công theo phụ lục B.
- Đúc khuôn: rót paraffin (3.1.6) nóng chảy từ nồi đun paraffin (4.1.3) vào khay sắt chuyên dụng (4.1.4), mở khuôn nhựa (4.1.1), gắp bệnh phẩm vào khay sắt (4.1.4), đặt khuôn nhựa (4.1.1) lên trên. Để nguội, tách lấy khối paraffin.
6.3.4.2 Cắt tiêu bản
- Cắt gọt khối paraffin cho bằng phẳng, đặt trên mặt máy làm lạnh tiêu bản (4.1.5);
- Đặt khối paraffin lên máy cắt tiêu bản (4.1.6) sao cho mặt khối paraffin song song với mép lưỡi dao, cắt bỏ những lát đầu đến khi lát cắt có đủ các tổ chức, điều chỉnh độ dày của lát cắt từ 3 µm đến 5 µm;
- Cắt một vài lát, chọn lát cắt phẳng thả vào nồi dãn tiêu bản (4.1.7) với nhiệt độ nước từ 35 °C đến 40 °C; dùng phiến kính (4.1.8) vớt lát cắt, dựng nghiêng, để khô.
6.3.4.3 Nhuộm tiêu bản
- Tẩy paraffin trong xylen (3.1.3) 3 lần (3 cốc) (4.1.10), thời gian mỗi lần từ 3 min đến 5 min;
- Ngâm trong Ethanol tuyệt đối (3.1.2) 2 lần (2 cốc), thời gian mỗi lần từ 3 min đến 5 min;
- Ngâm trong Ethanol 90 % (3.1.2), thời gian từ 3 min đến 5 min;
- Ngâm trong Ethanol 70 % (3.1.2), thời gian từ 3 min đến 5 min;
- Rửa dưới vòi nước chảy, thời gian từ 3 min đến 5 min;
- Ngâm trong thuốc nhuộm Haematoxylin (3.1.4), thời gian từ 3 min đến 5 min;
- Rửa dưới vòi nước chảy, thời gian từ 3 min đến 5 min;
- Ngâm trong thuốc nhuộm Eosin (3.1.5), thời gian từ 60 s đến 90 s;
- Rửa dưới vòi nước chảy làm sạch Eosin còn bám trên phiến kính;
- Loại bỏ nước còn bám trên phiến kính bằng cách ngâm trong Ethanol 90 % (thể tích) (3.1.2) trong thời gian từ 1 min đến 3 min, sau đó ngâm trong Ethanol tuyệt đối (3.1.2) 3 lần (3 cốc), thời gian mỗi lần từ 1 min đến 3 min; chuyển sang ngâm trong xylen (3.1.3) 2 lần (2 cốc), thời gian mỗi lần từ 1 min đến 3 min; gắn lamen (4.1.9) bằng keo dán lamen (3.1.7). Để khô, soi dưới kính hiển vi quang học (4.1.11).
6.3.5 Đọc kết quả
Tiêu bản được xem dưới kính hiển vi quang học (4.1.11):
- Đối với các nang sán sống: được bao quanh bởi các tế bào viêm: bạch cầu đơn nhân lớn, bạch cầu ái toan. Bên trong chứa dịch màu hồng và đầu sán.
- Đối với các nang sán đã bị phân hủy: được bao quanh bởi các tế bào viêm gồm: bạch cầu ái toan, đại thực bào, tế bào lympho và tế bào sợi. Nang sán bị canxi hóa bắt màu hồng.
6.4 Phương pháp sinh học phân tử PCR-RFLP
6.4.1 Lấy mẫu
Tách các nang nghi ngờ từ các cơ lưỡi, cơ tim, thịt (xem 6.1) cho vào ống đựng mẫu, ghi ký hiệu mẫu.
6.4.2 Bảo quản mẫu
Tất cả các mẫu xét nghiệm đều được bảo quản trong thùng lạnh (nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C) chuyển đến phòng thử nghiệm.
6.4.3 Chuẩn bị mẫu
Mẫu kiểm tra là nang sán nghi ngờ. Cắt khoảng 1 g mẫu, nghiền mẫu với dung dịch PBS (theo phụ lục A) bằng cối chày sứ vô trùng. Ly tâm ở gia tốc 900 g bằng máy ly tâm (4.2.2) trong 10 min, thu phần dịch nổi để xét nghiệm PCR.
6.4.4 Cách tiến hành
6.4.4.1 Tách chiết DNA (Deoxyribonucleic acid)
Lấy phần dịch nổi tại 6.3.3 để tiến hành tách chiết DNA.
Sử dụng bộ kít tách chiết (3.2.1) thích hợp và an toàn theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
VÍ DỤ: dùng kít tách chiết DNAeasy® Blood & Tissue Kít, Qiagen (Cat. No.69 504)6.4.4.2 Chuẩn bị cặp mồi
Phản ứng khuếch đại được thực hiện trong máy nhân gen (4.2.1) theo phương pháp PCR khuếch đại đoạn gen đặc hiệu 12S rDNA và sử dụng cặp mồi (3.2.3) để phát hiện Taenia spp. (xem phụ lục D). Mồi được chuẩn bị như sau:
- Mồi ở trạng thái đông khô phải được ly tâm nhanh bằng máy spindown (4.2.4) ở gia tốc 6 000 g trong 30 s để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Dùng dung dịch đệm TE (3.2.8) để hoàn nguyên mồi ở nồng độ 100 µM làm gốc.
- Mồi được sử dụng ở nồng độ 20 µM: pha loãng mồi gốc bằng nước không có nuclease (20 µl mồi gốc và 80 µl nước).
6.4.4.3 Tiến hành phản ứng Nested-PCR sàng lọc Taenia spp.
6.4.4.3.1 Phản ứng nhân gen vòng 1
Sử dụng cặp mồi TaenF và TnR đã được chuẩn bị (6.4.4.2) cho phản ứng nhân gen vòng 1.
Sử dụng kít nhân gen (3.2.2) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
VÍ DỤ: Kít Taq PCR master mix, Qiagen (Cat. No. 201 443)1), thành phần cho 1 phản ứng nhân gen vòng 1 xem phụ lục D2.
Cài đặt chu trình nhiệt cho máy nhân gen (4.2.1) xem phụ lục D3.
6.4.4.3.2 Phản ứng nhân gen vòng 2
Thành phần cho 1 phản ứng giống phản ứng nhân gen vòng 1, thay mồi TaenF bằng mồi nTAE (xem phụ lục D2).
Cài đặt chu trình nhiệt cho máy nhân gen (4.2.1) xem phụ lục D4.
6.4.4.4 Điện di
6.4.4.4.1 Chuẩn bị bản gel
Pha thạch agarose (3.2.4) ở nồng độ từ 1,5 % đến 2 % bằng dung dịch đệm TBE 1X hoặc TAE 1X (xem phụ lục E) vào chai thủy tinh 250 ml, lắc cho tan.
Đun thạch sôi, khi nhiệt độ giảm xuống khoảng 40 °C đến 50 °C bổ sung 10 µl chất nhuộm màu (3.2.6) cho 100 ml thạch. Lắc nhẹ tránh tạo bọt để chất nhuộm màu tan đều.
Đổ thạch vào khay điện di đã được cài lược; không nên đổ bản thạch dày quá 0,8 cm.
Khi bản thạch đông lại, gỡ lược khỏi bản thạch.
Chuyển bản gel vào bể điện di (4.2.5), đổ dung dịch đệm (TBE 1X hoặc TAE 1X) (xem phụ lục E) cùng loại với dung dịch pha thạch agarose đã đun vào bể điện di cho tới khi ngập bản thạch.
GHI CHÚ: Có thể dùng các sản phẩm có sẵn chất nhuộm DNA để pha thạch agarose (ví dụ: Sybr safe DNA gel stain6.4.4.4.2 Chạy điện di
Hút 8 µl sản phẩm PCR trộn với 2 µl loading dye, nhỏ vào một giếng trên bản thạch.
Thực hiện điện di trong bộ điện di (4.2.5), chạy kèm theo thang chuẩn DNA (marker) (3.2.9) để dự đoán kích thước sản phẩm khuếch đại. Hút 10 µl thang chuẩn DNA (marker) (3.2.9) vào một giếng trên bản thạch.
Điện di ở hiệu điện thế 100 V trong thời gian 30 min.
Bản thạch sau khi điện di xong được lấy ra và đọc kết quả trên máy đọc gel (blue light transilluminator) (4.2.6).
CHÚ Ý: Trong trường hợp Master Mix có sẵn đệm tải mẫu thì khi tiến hành điện di hút 10 µl sản phẩm PCR cho vào từng giếng trên bản gel, không cần trộn loading dye.
6.4.4.5 Đọc kết quả
Đặt bản gen lên trên máy đọc gel (blue light transilluminator hoặc UV light) (4.2.6):
- Phản ứng được công nhận khi: Mẫu đối chứng dương tính có vạch sản phẩm kích thước 766 bp, và mẫu đối chứng âm tính không có vạch sản phẩm
- Mẫu dương tính: vạch sản phẩm có kích thước 766 bp;
- Mẫu âm tính: không có vạch sản phẩm xuất hiện;
- Mẫu nghi ngờ hiển thị vạch sản phẩm không rõ nét hoặc hiển thị nhiều hơn 1 vạch sản phẩm.
Mẫu dương tính và mẫu nghi ngờ được tiếp tục tiến hành phản ứng PCR-RFLP để định loài.
CHÚ THÍCH: Trên lợn có 3 loài gồm T. solium, T. hydatigena và T. asiatica có vạch sản phẩm kích thước giống nhau. Trên bò có 2 loài gồm T. saginata, T.hydatigena có vạch sản phẩm kích thước giống nhau. Vì vậy, cần tiến hành phản ứng PCR - RFLP để xác định T.solium trên lợn và T. saginata trên bò.
6.4.4.6 Tiến hành phản ứng PCR - RFLP xác định loài
6.4.4.6.1 Pha hỗn hợp phản ứng
- Thành phần cho 1 phản ứng PCR-RFLP (xem phụ lục D5);
- Chuyển 9 µl hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng;
- Cho 6 µl mẫu DNA có kích cỡ sản phẩm đã biết vào ống phản ứng: mẫu đối chứng dương;
- Cho 6 µl nước tinh khiết không có nuclease vào ống phản ứng: mẫu đối chứng âm;
- Cho 6 µl mẫu DNA kiểm tra (sản phẩm được nhân gen và có kết quả dương tính/ nghi ngờ của phản ứng Nested-PCR) vào ống phản ứng: mẫu kiểm tra;
- Ủ ít nhất 2h ở 37 °C hoặc ủ qua đêm.
6.4.4.6.2 Điện di
a. Chuẩn bị bản gel
Pha thạch agarose (3.2.4) ở nồng độ 3 % bằng dung dịch đệm TBE 1X hoặc TAE 1X (xem phụ lục E) vào chai thủy tinh 250 ml, lắc cho tan.
Đun thạch đến sôi, khi nhiệt độ giảm xuống khoảng 40 °C đến 50 °C, bổ sung 10 µl chất nhuộm màu (3.2.6) cho 100 ml thạch. Lắc nhẹ tránh tạo bọt để chất nhuộm màu tan đều.
Đổ thạch vào khay điện di đã được cài lược; không nên đổ bản thạch dày quá 0,8 cm.
Khi bản thạch đông lại, gỡ lược khỏi bản thạch.
Chuyển bản gel vào bể điện di (4.3.5), đổ dung dịch đệm (TBE 1X hoặc TAE 1X) (xem phụ lục E) cùng loại với dung dịch pha thạch agarose đã đun vào bể điện di cho tới khi ngập bản thạch.
GHI CHÚ: Có thể dùng các sản phẩm có sẵn chất nhuộm DNA để pha thạch agarose (ví dụ: Sybr safe DNA gel stainb. Chạy điện di
Hút 8 µl sản phẩm PCR trộn với 2 µl loading dye nhỏ vào một giếng trên bản thạch.
Thực hiện điện di trong bộ điện di (4.2.5), chạy kèm theo thang chuẩn DNA (marker) (3.2.9) để dự đoán kích thước sản phẩm khuếch đại. Hút 10 µl thang chuẩn DNA (marker) (3.2.9) vào một giếng trên bản thạch.
Điện di ở hiệu điện thế 100 V trong thời gian 40 min.
Bản thạch sau khi điện di xong được lấy ra và đọc kết quả trên máy đọc gel (blue light transilluminator hoặc UV Iight) (4.2.6).
c. Đọc kết quả
Đặt bản gen lên trên máy đọc gel (blue light transilluminator hoặc UV light) (4.2.6):
- Phản ứng được công nhận khi: Mẫu đối chứng dương tính có số lượng vạch sản phẩm và kích thước như giống bảng 1, và mẫu đối chứng âm tính không có vạch sản phẩm
- Mẫu dương tính: có số lượng vạch sản phẩm và kích thước như giống bảng 5;
- Mẫu âm tính: không có vạch sản phẩm xuất hiện;
- Mẫu nghi ngờ hiển thị vạch sản phẩm không rõ nét hoặc hiển thị nhiều hơn 1 vạch sản phẩm.
- Mẫu nghi ngờ hiển thị vạch sản phẩm không rõ nét hoặc số vạch và kích thước sản phẩm không tương ứng với đối chứng dương. Những mẫu nghi ngờ cần lặp lại xét nghiệm.
Bảng 1 - Kích thước sản phẩm phản ứng PCR-RFLP
|
| Gạo bò | Gạo lợn |
| Số vạch sản phẩm | 4 | 3 |
| Kích thước | 471bp | 469bp |
| 165bp | 290bp | |
| 128bp | 35bp | |
| 34bp |
|
6.5 Phương pháp huyết thanh học Ag-ELISA phát hiện kháng nguyên vòng của Taenia spp.
Hiện nay có một số bộ kít ELISA phát hiện kháng nguyên vòng của Taenia spp. có bán sẵn trên thị trường. Thực hiện phương pháp ELISA cần theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất (xem phụ lục G).
CHÚ Ý: Phương pháp này chỉ đặc hiệu cho giống Taenia spp., không đặc hiệu loài nên chỉ dùng trong điều tra dịch tễ để sàng lọc.
7 Kết luận
Lợn được kết luận là mắc bệnh gạo lợn, bò được kết luận là mắc bệnh gạo bò khi có các đặc điểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể của bệnh và có kết quả xét nghiệm kháng nguyên dương tính bằng một trong những phương pháp sau:
- Phương pháp cắt lát cơ;
- Phương pháp nhuộm Haemotoxylin và Eosin;
- Phương pháp PCR-RFLP.
| Natri hydrophotphat (Na2HPO4) | 9,47 g |
| Kali dihydrophotphat (KH2PO4) | 9,08 g |
| Nước cất | 900 ml |
Hòa tan Natri hydrophotphat (Na2HPO4), Kali dihydrophotphat (KH2PO4) và lắc tan hết. Điều chỉnh để dung dịch đạt pH = 7 ± 0,2.
CHÚ THÍCH: có thể sử dụng PBS thương mại và pha theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Xử lý mẫu trong phương pháp nhuộm Haemotoxylin và Eosin
Ngâm khuôn nhựa (4.1.1) đựng mẫu trong Ethanol 70 % (thể tích) (3.1.2), thời gian từ 2 h đến 3 h;
Ngâm trong Ethanol 90 % (thể tích) (3.1.2) lần thứ 1 (cốc 1), thời gian từ 2 đến 3 h;
Ngâm trong Ethanol 90 % (thể tích) (3.1.2) lần thứ 2 (cốc 2), thời gian từ 2 đến 3 h;
Ngâm trong Ethanol tuyệt đối (3.1.2) lần thứ 1 (cốc 1), thời gian từ 2 h đến 3 h;
Ngâm trong Ethanol tuyệt đối (3.1.2) lần thứ 2 (cốc 2), thời gian từ 2 h đến 3 h;
Ngâm trong xylen (3.1.3) lần thứ 1 (cốc 1), thời gian từ 2 h đến 3 h;
Ngâm trong xylen (3.1.3) lần thứ 2 (cốc 2), thời gian từ 2 h đến 3 h;
Ngâm tẩm parafin (3.1.6) lần thứ 1 (cốc 1), thời gian từ 2 h đến 3 h;
Ngâm tẩm parafin (3.1.6) lần thứ 2 (cốc 2), thời gian từ 2 h đến 3 h;
Tách chiết DNA của Taenia spp. bằng kít thương mại theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Ví dụ dùng kít tách chiết DNAeasy ® Blood & Tissue Kit, Qiagen (Cat. No.69504) như sau:
C.1 Pha dung dịch
- Dung dịch rửa 1: thêm 25 ml Ethanol từ 96 % đến 100 % (thể tích) vào 19 ml dung dịch rửa AW1 đậm đặc;
- Dung dịch rửa 2: thêm 30 ml Ethanol từ 96 % đến 100 % (thể tích) vào 13 ml dung dịch rửa AW2 đậm đặc.
C.2 Cách tiến hành
- Bước 1: ly giải mẫu
• Với mẫu nang nghi ngờ: nhỏ 180 ml dung dịch ATL vào ống 1,5 ml chứa phần dịch nổi sau khi được xử lý (6.3.3); nhỏ 20 µl protease K vào ống. Trộn đều bằng máy lắc trộn vortex (4.2.3), ủ qua đêm ở 56 °C đến khi kết thúc quá trình ly giải, và trộn lại bằng máy lắc trộn vortex (4.2.3) 15 s trước khi chuyển sang bước 2;
- Bước 2: nhỏ 200 µl dung dịch AL vào ống; trộn đều bằng máy lắc trộn vortex (4.2.3) trong 15 s. Ủ mẫu ở 56 °C trong 15 min;
- Bước 3: nhỏ 200 µl Ethanol từ 96 % đến 100 % (thể tích) vào ống, trộn đều bằng máy lắc trộn vortex (4.2.3).
- Bước 4: chuyển toàn bộ dung dịch trong ống vào cột lọc có ống thu; ly tâm cột lọc và ống thu ở gia tốc 6 000 g bằng máy ly tâm (4.2.2) trong 1 min, loại bỏ ống thu;
- Bước 5: chuyển cột lọc sang ống thu mới; nhỏ 500 µl dung dịch rửa 1, ly tâm ở gia tốc 6 000 g bằng máy ly tâm (4.2.2) trong 1 min, loại bỏ ống thu;
- Bước 6: chuyển cột lọc sang ống thu mới; nhỏ 500 µl dung dịch rửa 2, ly tâm ở gia tốc 20 000 g bằng máy ly tâm (4.2.2) trong 3 min, loại bỏ ống thu;
- Bước 7: chuyển cột lọc sang ống 1,5 ml hoặc 2 ml sạch Dnase/Rnase;
- Bước 8: nhỏ 50 µl dung dịch AE vào giữa màng cột lọc, ủ 1 min ở nhiệt độ phòng (từ 15 °C đến 25 °C); ly tâm cột lọc và ống 1,5 ml hoặc 2 ml ở gia tốc 6 000 g bằng máy ly tâm (4.2.2) trong 1 min
- Bước 9: bỏ cột lọc, giữ lại ống 1,5 ml hoặc 2 ml có chứa DNA;
Bảo quản DNA ở nhiệt độ 2 °C - 8 °C nếu thực hiện phản ứng PCR ngay hoặc nhiệt độ -20 °C nếu thực hiện phản ứng PCR sau 24 h.
D.1 Trình tự cặp mồi
| Gen đích | Vòng | Cặp mồi | Trình tự | Kích thước sản phẩm |
| 12S rDNA | Vòng 1 | TaenF (mồi xuôi 1) | (5’GTTTGCCACCTCGATGTTGACT 3’) | 846 bp |
| TnR (mồi ngược) | (5’CTCAATAATAATCGAGGGTGACGG 3') | |||
| Vòng 2 | nTAE (mồi xuôi 2) | (5’ CGTGAGCCAGGTCGGTTCTTAT 3’) | 766 bp | |
| TnR (mồi ngược) | (5’CTCAATAATAATCGAGGGTGACGG 3’) |
D.2 Thành phần phản ứng nhân gen bước 1, phản ứng Nested - PCR
| TT | Thành phần | Thể tích |
| 1 | Taq PCR Master Mix kít | 12,5 |
| 2 | Mồi xuôi (TaenF), 20 µM | 0,5 |
| 3 | Mồi ngược (TnR), 20 µM | 0,5 |
| 3 | Nước tinh khiết không có nuclease | 6,5 |
| Tổng thể tích | 20 | |
Chuyển 20 µl hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng;
Cho 5 µl mẫu DNA có kích cỡ sản phẩm đã biết vào ống phản ứng: mẫu đối chứng dương;
Cho 5 µl nước tinh khiết không có nuclease vào ống phản ứng: mẫu đối chứng âm;
Cho 5 µl mẫu DNA kiểm tra vào ống phản ứng: mẫu kiểm tra;
GHI CHÚ: phản ứng PCR phải bao gồm: mẫu kiểm tra, mẫu đối chứng dương, mẫu đối chứng âm.
D.3 Chu trình nhiệt phản ứng nhân gen vòng 1, phản ứng Nested - PCR
| Nhiệt độ | Thời gian | Số chu kỳ |
| 94 °C | 4 min | 1 vòng |
| 94 °C | 1 min | 40 vòng |
| 58 °C | 1,5 min | |
| 72 °C | 2 min |
CHÚ Ý: Chu trình nhiệt và thời gian phản ứng có thể thay đổi tùy theo bộ kit nhân gen. Khi sử dụng bộ kít khác nhau cần thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
D.4 Chu trình nhiệt phản ứng nhân gen vòng 2, phản ứng Nested - PCR
| Nhiệt độ | Thời gian | Số chu kỳ |
| 92 °C | 4 min | 1 vòng |
| 92 °C | 45 s | 25 vòng |
| 57 °C | 46 s | |
| 73 °C | 1 min |
CHÚ Ý: Chu trình nhiệt và thời gian phản ứng có thể thay đổi tùy theo bộ kít nhân gen. Khi sử dụng bộ kít khác nhau cần thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
D.5 Thành phần phản ứng PCR - RFLP[3,7]
| TT | Thành phần | Thể tích |
| 1 | Enzyme 1 (Ddel) | 0,3 |
| 2 | Enzyme 2 (Hinfl) | 0,3 |
| 3 | Enzyme 3 (Hpal) | 0,6 |
| 4 | Nước tinh khiết không có nuclease | 6,3 |
| 5 | Dung dịch đệm | 1,5 |
| Tổng thể tích | 9,0 | |
E.1 Thành phần
Dung dịch TAE/TBE 10X: 100 ml
Nước khử ion: 900 ml
Tổng: 1 000 ml dung dịch TBE 1X
E.2 Tiến hành
Lấy 100 ml dung dịch TBE 10X vào 900 ml nước khử ion, khuấy và lắc đều.
Bảo quản ở nhiệt độ phòng.
Phương pháp Ag-ELISA phát hiện kháng nguyên vòng của Taenia spp.
G.1 Lấy mẫu
Lấy 1,5 ml đến 2 ml máu ở tĩnh mạch cổ hoặc động mạch đuôi (đối với bò) nghi mắc bệnh gạo.
Rút pittong để tạo khoảng trống (hoặc bơm máu vào ống nghiệm vô trùng). Ghi ký hiệu mẫu, đặt nằm nghiêng 45° trong hộp đựng mẫu để đông máu trong 1 h đến 2 h ở nhiệt độ bình thường, tránh ánh nắng trực tiếp.
Chắt huyết thanh sang ống nghiệm vô trùng, ghi ký hiệu của mẫu lên ống chứa huyết thanh.
G.2 Bảo quản mẫu
Mẫu xét nghiệm bảo quản trong thùng lạnh (nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C), chuyển đến phòng thử nghiệm trong vòng 48 h. Trường hợp chưa xét nghiệm ngay, mẫu huyết thanh bảo quản ở nhiệt độ -20 °C.
G.3 Cách tiến hành
VÍ DỤ: dùng bộ kít phát hiện kháng nguyên vòng của Taenia spp. ở lợn của hãng ApdiaG.3.1 Chuẩn bị
- Dung dịch rửa: pha loãng 50ml dung dịch rửa đậm đặc với 1 000 ml nước cất. Bảo quản ở nhiệt độ từ 4 °C đến 8 °C;
- Hút 150 µl dung dịch TCA nhỏ vào ống eppendort chứa 150 µl mẫu đối chứng (âm, dương) và huyết thanh cần kiểm tra. Lắc và ủ ở nhiệt độ phòng trong 5-20 min. Tiếp tục lắc sau đó ly tâm với tốc độ 12 000 g trong từ 5 min đến 9 min;
- Nhỏ 150 µl dung dịch trong mỗi ống trên vào ống eppendort chứa 150 µl dung dịch Neutralision buffer.
G.3.2 Tiến hành phản ứng
- Để các thuốc thử ở nhiệt độ phòng từ 18 °C đến 25 °C trước khi sử dụng;
- Nhỏ 100 µl đối chứng (âm, dương), mẫu kiểm tra đã chuẩn bị (xem 3.1, phụ lục G) vào các giếng được chọn (mỗi mẫu thực hiện trên 2 giếng;
- Phủ kín đĩa, ủ và lắc ở tủ ấm (4.3.1) trong 15 min với tốc độ 700 - 800 rpm;
- Rửa đĩa 5 lần bằng dung dịch rửa;
- Nhỏ 100 µl dung dịch kháng kháng thể lợn vào từng giếng;
- Phủ kín đĩa, ủ và lắc ở tủ ấm (4.3.1) trong 15 min với tốc độ 700 - 800 rpm;
- Rửa đĩa 5 lần bằng dung dịch rửa;
- Nhỏ 100 µl dung dịch cơ chất vào mỗi giếng;
- Phủ kín đĩa và ủ ở nhiệt độ phòng trong 15 min;
- Nhỏ 50 µl dung dịch dừng phản ứng vào mỗi giếng;
- Đọc đĩa ở bước sóng 450 nm bằng máy đọc ELISA (4.3.2) trong vòng 15 min.
G.3.3 Đọc kết quả
- Tính giá trị OD (mật độ quang học) của mẫu đối chứng (âm, dương) và huyết thanh cần kiểm tra.
- Tính giá trị ngưỡng (Cut-off) theo công thức sau:
Cut-off = ODđối chứng âm x 3,5
- Chỉ số kháng nguyên (Ag Index):
Ag Index = ODmẫuf/ cut-off
Giá trị mẫu đối chứng nằm trong khoảng giới hạn sau:
1) Ag Index của đối chứng dương: lớn hơn hoặc bằng 1,3
2) Ag Index của đối chứng âm: nhỏ hơn hoặc bằng 0,8
- Đánh giá kết quả đối với mẫu huyết thanh kiểm tra:
1) Ag Index nhỏ hơn hoặc bằng 0,8: mẫu âm tính
2) Ag Index lớn hơn hoặc bằng 1,3: mẫu dương tính
CHÚ Ý: kít phát hiện kháng thể Taenia spp. không thể phân biệt được kháng thể do nhiễm tự nhiên hay kháng thể do tiêm vắc xin.
Thư mục tài liệu tham khảo
[1] OIE, 2014. Mannual of diagnostic test and Vaccines for Terrestrial animals. Chapter 2.9.5. Cysticercosis.
[2] Boa ME, Kassuku AA, Iii ALW, Keyyu JD, Phiri IK, Nansen P., 2002. Distribution and density of cysticerci of Taenia solium by muscle groups and organs in naturally infected local finished pigs in Tanzania. 2002;106: p.155-64.
[3] Devleesschauwer B, Aryal A, Tharmalingam J, Joshi DD, Rijal S, Speybroeck N, et al., 2013. Complexities in using sentinel pigs to study Taenia solium transmission dynamics under field conditions. Vet Parasitol [Internet], Elsevier;193(1-3) : p.172-8.
[4] Geysen, D., Kanobana, K., Victor, B., Rodriguez-hidalgo, R., Borchgrave, J.D.E., Brandt, J.E.F., Dorny, P., 2007. Validation of Meat Inspection Results for Taenia saginata Cysticercosis by PCR - Restriction Fragment Length Polymorphism 70, p.236-240. doi:10.4315/0362-028X-70.1.236.
[5] Phạm Văn Khuê và Phan Lục, 1996. Giáo trình ký sinh trùng thú y. NXB Đại học Nông Nghiệp I. Trang 240-242.
[6] Rodriguez-Hidalgo, R., Geysen, D., Benítez-Ortiz, W., Geerts, S., Brandt, J., 2002. Comparison of conventional techniques to differentiate between Taenia solium and Taenia saginata and an improved polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism assay using a mitochondrial 12 rDNA fragment. para J. Parasitol. 88, p. 1007-1011.
[7] WHO/FAO/OIE Guidelines for the surveillance, prevention and control of taeniosis/cysticercosis.
1) Sản phẩm do hãng Qiagen cung cấp. Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.
2) Sản phẩm do hãng Invitrogen cung cấp. Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.
3) Sản phẩm do hãng Invitrogen cung cấp. Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.
4) Sản phẩm do hãng Apdia cung cấp, mã sản phẩm REF 650 510. Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.
File gốc của Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-45:2019 về Bệnh động vật – Quy trình chuẩn đoán – Phần 45: Bệnh gạo lợn, bệnh gạo bò đang được cập nhật.
Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-45:2019 về Bệnh động vật – Quy trình chuẩn đoán – Phần 45: Bệnh gạo lợn, bệnh gạo bò
Tóm tắt
| Cơ quan ban hành | Đã xác định |
| Số hiệu | TCVN8400-45:2019 |
| Loại văn bản | Tiêu chuẩn Việt Nam |
| Người ký | Đã xác định |
| Ngày ban hành | 2019-01-01 |
| Ngày hiệu lực | |
| Lĩnh vực | Nông nghiệp |
| Tình trạng | Còn hiệu lực |