Animal\r\ndisease – Diagnostic procedure for anthrax
\r\n\r\nLời nói đầu
\r\n\r\nTCVN 5274:2010 thay thế TCVN\r\n5274:1990;
\r\n\r\nTCVN 5274:2010 do Cục Thú y biên\r\nsoạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo\r\nlường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.
\r\n\r\n\r\n\r\n
BỆNH\r\nĐỘNG VẬT – QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN BỆNH NHIỆT THÁN
\r\n\r\nAnimal\r\ndisease – Diagnostic procedure for anthrax
\r\n\r\nCẢNH BÁO: Bệnh nhiệt thán là\r\nbệnh truyền nhiễm nguy hiểm giữa người và động vật. Việc áp dụng tiêu chuẩn này\r\ncó thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu\r\nchuẩn này không thể đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến\r\nviệc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác\r\nan toàn sức khỏe thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn qui định\r\ntrước khi sử dụng tiêu chuẩn.
\r\n\r\n\r\n\r\nTiêu chuẩn này quy định quy trình\r\nchẩn đoán bệnh nhiệt thán trên động vật do vi khuẩn Bacillus anthracis gây\r\nra.
\r\n\r\n\r\n\r\nTrong tiêu chuẩn này sử dụng các\r\nthuật ngữ, định nghĩa sau đây:
\r\n\r\n2.1. Bacillus anthracis
\r\n\r\nTrực khuẩn gram dương, hiếu khí,\r\nkhông di động, có hình thành giáp mô và nha bào.
\r\n\r\n2.2. Bệnh nhiệt thán\r\n(anthrax)
\r\n\r\nBệnh nhiệt thán (bệnh than) là bệnh\r\ntruyền nhiễm của nhiều loài động vật và có thể lây sang người, do vi khuẩn Bacillus\r\nanthracis gây ra. Bệnh có thể xảy ra ở thể quá cấp tính, thứ cấp tính và ít\r\nkhi xảy ra ở thể mạn tính.
\r\n\r\n\r\n\r\nCăn cứ vào triệu chứng lâm sàng,\r\nhình thái vi khuẩn và đặc điểm được kết luận trên môi trường cấy, giám định khả\r\nnăng mẫn cảm với penicilin hoặc độc lực vi khuẩn bằng phản ứng chuỗi polyme\r\n(PCR).
\r\n\r\n4. Môi trường\r\nnuôi cấy và thuốc thử
\r\n\r\nTrong tiêu chuẩn này chỉ sử dụng\r\ncác thuốc thử tinh khiết phân tích và sử dụng nước cất hoặc nước có chất lượng\r\ntương đương.
\r\n\r\n- Thạch
\r\n\r\n- Thạch máu
\r\n\r\n- Thạch bicarbonat
\r\n\r\nPha 100 ml thạch vào 83 ml nước.\r\nHấp và để nguội ở 50 oC trong nồi cách thủy. Thêm 7 ml huyết thanh\r\nngựa hay máu ngựa (lọc vô khuẩn nếu cần) và 10 ml dung dịch natri bicarbonat 7 %\r\n(huyết thanh ngựa, máu ngựa và natri bicarbonat nên để ở 50 oC trước\r\nkhi thêm vào thạch). Lắc đều và đổ ra đĩa Petri.
\r\n\r\n- Thạch polymyxin-lysozym-EDTA-tali\r\n(I) axetat (PLET)
\r\n\r\nHòa tan thạch BHI (thạch tim não)\r\ntrong nước (lượng thạch theo hướng dẫn của nhà sản xuất). Thêm EDTA 0,3 g/l và\r\ntali (I) axetat (C2H3O2TI) 0,4 g/l, hấp vô\r\ntrùng ở 121 oC trong 15 min. Để môi trường nguội tới 50 oC,\r\nthêm polymyxin B sulfat 30 000 UI/lít và lysozym 300 000 UI/l. Lắc đều và đổ ra\r\nđĩa Petri.
\r\n\r\n- Canh thang BHI.
\r\n\r\n- Agaroza.
\r\n\r\n- Ethidi bromua (EtBr).
\r\n\r\n- Giấy tẩm penicillin.
\r\n\r\n\r\n\r\nSử dụng các thiết bị, dụng cụ của\r\nphòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:
\r\n\r\n- Thiết bị điện di.
\r\n\r\n- Tủ ấm, có thể duy trì nhiệt độ 37\r\noC.
\r\n\r\n- Tủ sấy.
\r\n\r\n- Buồng cấy.
\r\n\r\n- Kính hiển vi quang học.
\r\n\r\n- Tủ lạnh.
\r\n\r\n- Que cấy.
\r\n\r\n- Đĩa Petri.
\r\n\r\n- Lọ thủy tinh, dung\r\ntích 100 ml, 200 ml, 500 ml và 1 000 ml.
\r\n\r\n\r\n\r\nNếu nghi gia súc mắc\r\nbệnh nhiệt thán, tuyệt đối không được mổ xác chết. Mẫu bệnh phẩm là máu, mẩu\r\ntai hoặc mẩu lách.
\r\n\r\n- Lấy mẫu máu: Sát\r\ntrùng vị trí lấy mẫu bằng cồn, để khô. Dùng bơm kim tiêm vô trùng lấy mẫu ở\r\ntĩnh mạch cổ hoặc tĩnh mạch tai. Sau khi lấy máu xong, sát trùng kỹ nơi lấy máu\r\nbằng cồn.
\r\n\r\n- Lấy mẫu tai: Sát\r\ntrùng vùng da tai, dùng kéo vô trùng cắt một mẩu tai (3 cm2) rồi cho\r\nvào lọ hay ống nghiệm đậy nút kín. Sát trùng tại nơi đã cắt.
\r\n\r\n- Sinh thiết lách:\r\nSát trùng và rạch một đường nhỏ sau cung xương sườn thứ 8 bên trái để lấy một\r\nmẫu lách.
\r\n\r\nCHÚ THÍCH: Lấy bệnh\r\nphẩm cẩn thận, tránh để mầm bệnh vương vãi ra ngoài môi trường. Vị trí lấy mẫu\r\nphải được sát trùng cẩn thận, môi trường xung quanh phải được tiêu độc khử\r\ntrùng theo hướng dẫn của cơ quan chuyên môn.
\r\n\r\nBệnh phẩm được bảo\r\nquản trong lọ vô trùng đóng kín nắp, dán nhãn, ghi rõ bệnh phẩm nghi mắc bệnh\r\nnhiệt thán.
\r\n\r\nChuyển bệnh phẩm đến\r\nphòng thử nghiệm càng nhanh càng tốt trong điều kiện lạnh khoảng 2 oC\r\nđến 8 oC. Bệnh phẩm phải được gửi kèm theo một phiếu xét nghiệm có\r\nghi rõ bệnh sử, triệu chứng, đặc điểm dịch tễ.
\r\n\r\n\r\n\r\n7.1. Chẩn đoán lâm\r\nsàng
\r\n\r\n7.1.1. Đặc điểm\r\ndịch tễ
\r\n\r\n- Dịch bệnh thường\r\nxảy ra ở những vùng trước đó đã xuất hiện bệnh, hoặc do vận chuyển gia súc từ vùng\r\ncó dịch nhiệt thán đến.
\r\n\r\n- Bệnh thường phát\r\nsinh vào mùa nóng ẩm, những tháng mưa nhiều (tháng 8, 9, tháng 10) hay cuối\r\nxuân đầu hè.
\r\n\r\n- Động vật ăn cỏ mẫn\r\ncảm nhất với bệnh. Lợn ít cảm nhiễm với bệnh hơn và thường mắc ở thể cục bộ.\r\nNgười cũng dễ bị nhiễm bệnh.
\r\n\r\n- Bệnh lây lan chủ\r\nyếu qua đường tiêu hóa do ăn thức ăn, nước uống… có lẫn nha bào nhiệt thán.\r\nBệnh cũng lây lan qua đường hô hấp hay các vết thương trên da.
\r\n\r\n7.1.2. Triệu chứng\r\nlâm sàng
\r\n\r\n7.1.2.1. Loài nhai\r\nlại
\r\n\r\n7.1.2.1.1. Thể quá\r\ncấp tính
\r\n\r\n- Thể bệnh này thường\r\ngặp ở trâu, bò. Con vật sốt cao từ 40,5 oC đến 42,5 oC,\r\nrun rẩy, thở gấp, các niêm mạc đỏ ửng hay tím bầm, nghiến răng, thè lưỡi, đầu\r\ngục xuống, mắt đỏ, đi loạng choạng, đứng không vững.
\r\n\r\n- Con vật chết nhanh\r\nsau khi xuất hiện triệu chứng từ một đến vài giờ.
\r\n\r\n- Sau khi chết, các\r\nlỗ tự nhiên (miệng, lỗ mũi, hậu môn và âm hộ) chảy máu đen và khó đông.
\r\n\r\n7.1.2.1.2. Thể cấp\r\ntính
\r\n\r\n- Con vật sốt cao từ\r\n40 oC đến 42 oC, tim đập nhanh, thở nhanh, niêm mạc đỏ\r\nthẫm.
\r\n\r\n- Phân màu đen lẫn\r\nmáu, nước tiểu lẫn máu.
\r\n\r\n- Mồm, mũi và bọt màu\r\nhồng lẫn máu.
\r\n\r\n- Hầu, ngực và bụng\r\nbị sưng, nóng.
\r\n\r\n7.1.2.1.3. Thể á\r\ncấp tính
\r\n\r\n- Con vật sốt cao, ăn\r\nít hay bỏ ăn.
\r\n\r\n- Những chỗ da mỏng\r\nthường sưng, nóng rồi cứng lại, không đau, về sau chỗ da sưng bị loét và chảy\r\nnước hơi vàng, có lẫn ít máu.
\r\n\r\n- Niêm mạc mắt,\r\nmiệng, hậu môn màu đỏ.
\r\n\r\n7.1.2.1.4. Thể\r\nngoài da
\r\n\r\nCon vật có các ung\r\nnhiệt thán ở vùng cổ, mông, ngực… Ban đầu trên da có các vùng sưng, nóng, đau,\r\nvề sau lạnh dần không đau, giữa ung nhiệt thán bị thối, có lúc thành mụn loét\r\nmàu đỏ thẫm, chảy nước vàng.
\r\n\r\n7.1.2.2. Ngựa
\r\n\r\nNgựa sốt từ 41 oC\r\nđến 42 oC, đau bụng dữ dội khó thở. Ngựa run rẩy, nước tiểu lẫn máu,\r\nphân lẫn màu và mủ. Mũi, miệng có thể chảy máu, con vật chết nhanh, sau khi\r\nchết bụng chướng to, lòi dom.
\r\n\r\n7.1.2.3. Lợn
\r\n\r\nLợn bị sưng hầu, có\r\nkhi lan xuống cả ngực, bụng, lên mặt. Chỗ sưng có màu đỏ sẫm, tím bầm. Lợn khó\r\nnuốt, khó thở, không kêu được.
\r\n\r\n7.2. Chẩn đoán trong phòng thử\r\nnghiệm
\r\n\r\n7.2.1. Xử lí mẫu
\r\n\r\nNếu mẫu bệnh phẩm lấy từ động vật\r\nđã chết từ lâu, hay để lâu hoặc các sản phẩm từ động vật như lông, bột xương,\r\nthì phải nghiền bệnh phẩm thành huyễn dịch từ 5 % đến 10%, một\r\nphần cấy vào môi trường thạch máu, nước thịt, một phần huyễn dịch còn lại được\r\nlàm sốc nhiệt bằng cách đun trong nồi cách thủy ở 62,5 oC ± 0,5 oC\r\ntrong 15 min hoặc thêm vào một lượng tương đương cồn 95% đến 100% và để trong\r\nvòng 1 h.
\r\n\r\n7.2.2. Kiểm tra\r\nhình thái vi khuẩn từ bệnh phẩm
\r\n\r\n7.2.2.1. Làm tiêu\r\nbản
\r\n\r\n- Với mẫu máu: Nhỏ\r\nmột giọt máu lên phiến kính sạch sau đó dàn mỏng, đều bằng phiến kính khác, để\r\nkhô.
\r\n\r\n- Với mẫu da tai và\r\nlách: Cắt một miếng nhỏ mẫu phết lên phiến kính, để khô.
\r\n\r\n7.2.2.2. Cố định\r\nvà nhuộm tiêu bản
\r\n\r\nTiêu chuẩn được cố\r\nđịnh và nhuộm Giemsa (xem Phụ lục B) hoặc nhuộm giáp mô theo phương pháp\r\nM’Fadyean (xem Phụ lục C).
\r\n\r\nTiêu bản sau khi\r\nnhuộm được để khô và quan sát dưới kính hiển vi với độ phóng đại 1000X.
\r\n\r\n7.2.2.3. Kết luận
\r\n\r\n- Với tiêu bản nhuộm\r\ngiemsa: vi khuẩn B. antharacis có dạng vi trực khuẩn, hai đầu\r\nvuông, đứng thành cặp hay tập trung thành chuỗi ngắn; kích thước (từ 1 μ
- Với tiêu bản nhuộm\r\nM’Fadyean: vi khuẩn B. anthracis thường đứng cặp đôi hay thành\r\nchuỗi ngắn, hai đầu vuông. Giáp mô bao quanh vi khuẩn bắt màu hồng, tế bào vi\r\nkhuẩn bắt màu xanh đen.
\r\n\r\n7.2.3. Tiêm động\r\nvật thí nghiệm
\r\n\r\nĐộng vật thí nghiệm\r\nlà chuột nhắt trắng hoặc chuột lang.
\r\n\r\nBệnh phẩm được nghiền\r\nvới nước sinh lý theo tỷ lệ 1:10 thành huyễn dịch huyền phù. Tiêm dưới da đùi\r\nvới liều 0,1 ml cho chuột nhắt trắng hoặc 0,4 ml cho chuột lang.
\r\n\r\nVi khuẩn B. anthacis\r\nlàm chết chuột lang trong 48 h và chuột bạch trong 24 h với bệnh tích chỗ\r\ntiêm sưng, thủy thũng có chất keo nhày màu hồng.
\r\n\r\nCHÚ THÍCH: Tiêm động\r\nvật thí nghiệm chỉ thực hiện khi các phương pháp khác không hiệu quả.
\r\n\r\n7.2.4. Nuôi cấy,\r\nphân lập và giám định vi khuẩn
\r\n\r\n7.2.4.1. Nuôi cấy,\r\nphân lập vi khuẩn
\r\n\r\nBệnh phẩm mới được\r\ncấy vào môi trường thạch máu (máu cừu, máu bê), cạnh thang BHI (canh thang tim não).\r\nBệnh phẩm cũ được cấy vào môi trường thạch máu, thạch PLET [thạch\r\npolymyxin-lysozym-EDTA-tali(l) axetat], canh thang BHI. Vi khuẩn được nuôi cấy\r\ntrong điều kiện hiếu khí ở 37 oC trong 24 h.
\r\n\r\n- Trên môi trường\r\ncanh thang BHI: sau 24 h nuôi cấy, vi khuẩn B. anthracis mọc thành cặn\r\ndính dưới đáy ống, lắc có vẩn bông như sương mù.
\r\n\r\n- Trên môi trường\r\nthạch máu: khuẩn lạc của vi khuẩn B. anthracis màu trắng xám, mặt\r\nnhám, xù xì (dạng R). Vi khuẩn không gây dung huyết. Dùng que cấy tách dễ dàng\r\ntoàn bộ khuẩn lạc lên khỏi mặt thạch.
\r\n\r\n- Trên môi trường\r\nthạch PLET: khuẩn lạc của vi khuẩn B. anthracis màu trắng kem, xù\r\nxì.
\r\n\r\n7.2.4.2. Giám định\r\nvi khuẩn
\r\n\r\n7.2.4.2.1. Giám\r\nđịnh hình thái vi khuẩn từ môi trường nuôi cấy
\r\n\r\n7.2.4.2.1.1. Làm\r\ntiêu bản
\r\n\r\nDùng que cấy lấy\r\nkhuẩn lạc hòa đều vào giọt nước sinh lý trên phiến kính hoặc lấy một vòng que\r\ncấy canh trùng đã nuôi cấy vi khuẩn dàn mỏng lên trên phiến kính, để khô và cố\r\nđịnh tiêu bản trên ngọn lửa đèn cồn.
\r\n\r\n7.2.4.2.1.2. Nhuộm\r\ntiêu bản
\r\n\r\nNhuộm Gram (xem Phụ\r\nlục A) hoặc nhuộm giáp mô theo phương pháp M’Fadyean (xem Phụ lục E).
\r\n\r\nKhu nhuộm giáp mô, vi\r\nkhuẩn nghi ngờ cần được nuôi cấy trên môi trường thạch bicarbonat. Ủ ở 37 oC\r\ntrong 24 h trong điều kiện có từ 10 % đến 20 % khí CO2.
\r\n\r\n7.2.4.2.1.3. Kết\r\nluận
\r\n\r\n- Với tiêu bản nhuộm\r\nGram: vi khuẩn B. anthracis bắt màu tím (Gram dương), đứng cặp đôi hay\r\nthành chuỗi ngắn (từ canh trùng vi khuẩn xếp thành chuỗi dài), hai đầu vuông.
\r\n\r\n- Với tiêu bản nhuộm\r\nM’Fadyean: vi khuẩn B. anthracis thường đứng cặp đôi hay thành\r\nchuỗi ngắn, hai đầu vuông. Giáp mô bao quanh vi khuẩn bắt màu hồng, tế bào vi\r\nkhuẩn bắt màu xanh đen.
\r\n\r\n7.2.4.2.2. Giám\r\nđịnh khả năng mẫn cảm của vi khuẩn B. anthracis với penicillin
\r\n\r\nB. anthracis
7.2.4.2.3. Giám\r\nđịnh độc lực của vi khuẩn B. anthracis bằng phương pháp phản ứng chuỗi\r\npolyme (PCR)
\r\n\r\nMục đích: xác định sự\r\ncó mặt của hai plasmid là pXO1 và pXO2.
\r\n\r\nCHÚ THÍCH: Plasmid\r\npXO1 chứa các gen mã hóa cho độc tố của vi khuẩn B. anthracis. Plasmid\r\npXO2 chứa gen cho sự tổng hợp giáp mô của vi khuẩn B. anthracis. B.\r\nanthracis cần hai yếu tố này để gây bệnh.
\r\n\r\nCác cặp mồi thích hợp\r\nđể xác định sự có mặt của hai plasmid pXO1, pXO2 và phương pháp tiến hành được\r\nquy định trong Phụ lục E.
\r\n\r\n7.2.4.3. Đọc kết\r\nquả
\r\n\r\nKết quả dương tính\r\nkhi vi khuẩn kiểm tra có hình thái của vi khuẩn B. anthracis và dương\r\ntính với một trong hai phương pháp giám định quy định trong 7.2.4.2.2 và\r\n7.2.4.2.3.
\r\n\r\n7.3. Kết quả
\r\n\r\nKết quả dương tính\r\nkhi con vật có các đặc điểm dịch tễ, triệu chứng của bệnh và có một trong các\r\nkết quả chẩn đoán phòng thử nghiệm sau dương tính:
\r\n\r\n- Trên tiêu bản máu\r\ncó nhiều vi khuẩn hình trực khuẩn có giáp mô;
\r\n\r\n- Kết quả nuôi cấy,\r\nphân lập, giám định vi khuẩn dương tính.
\r\n\r\n\r\n\r\n
A.1. Thuốc thử
\r\n\r\nA.1.1. Dung dịch tím tinh thể
\r\n\r\n| \r\n Tím tinh thể (C25H30N3Cl) \r\n | \r\n \r\n 2,0 g \r\n | \r\n
| \r\n Etanol 95 % \r\n | \r\n \r\n 20,0 ml \r\n | \r\n
| \r\n Amoni oxalat [(NH4)C2O4.2H2O)] \r\n | \r\n \r\n 0,8 g \r\n | \r\n
| \r\n Nước \r\n | \r\n \r\n 80,0 ml \r\n | \r\n
Hòa tan tím tinh thể trong etanol\r\nvà hòa tan amoni oxalat trong nước. Trộn 2 dung dịch này với nhau, lắc đều.
\r\n\r\nA.1.2. Dung dịch fuscin gốc
\r\n\r\n| \r\n Basic fuchsin (CH19O) \r\n | \r\n \r\n 1 g \r\n | \r\n
| \r\n Etanol 95% \r\n | \r\n \r\n 10 ml \r\n | \r\n
| \r\n Phenol (C6H6O) \r\n | \r\n \r\n 5 g \r\n | \r\n
| \r\n Nước \r\n | \r\n \r\n 100 ml \r\n | \r\n
Pha loãng dung dịch theo tỉ lệ 1:10\r\n(phần thể tích) với nước khi sử dụng.
\r\n\r\nA.1.3. Dung dịch lugol
\r\n\r\n| \r\n Kali iodua \r\n | \r\n \r\n 2 g \r\n | \r\n
| \r\n Iodua tinh thể \r\n | \r\n \r\n 1 g \r\n | \r\n
| \r\n Nước \r\n | \r\n \r\n 200 ml \r\n | \r\n
Nghiền kali iodua và iodua tinh\r\nthể, cho nước vào từ từ và lắc đều.
\r\n\r\nA.1.4. Cồn axeton
\r\n\r\n| \r\n Etanol 95 % \r\n | \r\n \r\n 3 phần thể tích \r\n | \r\n
| \r\n Axeton [(CH3)2CO] \r\n | \r\n \r\n 1 phần thể tích \r\n | \r\n
A.2. Cách tiến hành
\r\n\r\nNhỏ dung dịch tím tinh thể lên tiêu\r\nbản và để từ 1 min đến 2 min, sau đó rửa nhanh với nước và để khô.
\r\n\r\nNhỏ dung dịch lugol và để trong 1\r\nmin rồi rửa nhanh với nước và để khô.
\r\n\r\nNhỏ cồn axeton rồi rửa thật nhanh\r\nvới nước và để khô.
\r\n\r\nNhỏ dung dịch fucsin loãng và để trong\r\n1 min rồi rửa với nước và thấm khô hoặc sấy khô.
\r\n\r\nA.3. Xem tiêu bản
\r\n\r\nXem tiêu bản bằng kính hiển vi\r\nquang học với vật kính dầu có độ phóng đại 100X.
\r\n\r\n\r\n\r\n
B.1. Thuốc thử giemsa
\r\n\r\nGiemsa (C14H14CIN3S),\r\ndạng bột 1 g
\r\n\r\nGlyxerin 60\r\nml
\r\n\r\nMetanol nguyên chất 60\r\nml
\r\n\r\nLàm nóng glyxerin đến khoảng 55 oC\r\nđến 60 oC trong nồi cách thủy. Thêm thuốc thử Giemsa, trộn đều và ủ\r\ntrong 2 h. Sau đó để nguội và thêm metanol, giữ trong khoảng 2 tuần trước khi\r\nsử dụng. Khi sử dụng, pha loãng theo tỷ lệ 1:10 (phần thể tích) trong dung dịch\r\nđệm phosphat 0,01 M (pH 7,0) và giữ trong 30 min.
\r\n\r\nCHÚ THÍCH: Có thể sử dụng thuốc thử\r\nGiemsa thương mại và pha loãng theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
\r\n\r\nB.2. Cách tiến hành
\r\n\r\nSau khi làm xong tiêu bản máu, cố định\r\ntiêu bản bằng metanol nguyên chất trong 10 min rồi rửa bằng nước. Nhỏ dung dịch\r\nGiemsa ngập tiêu bản, để trong 20 min đến 30 min rồi rửa nhanh với nước và sấy\r\nkhô.
\r\n\r\nB.3. Xem tiêu bản
\r\n\r\nXem tiêu bản bằng kính hiển vi\r\nquang học với vật kính dầu có độ phóng đại 100X.
\r\n\r\n\r\n\r\n
C.1. Thuốc thử polycrom xanh\r\nmetylen (thuốc thử M’Fadyean)
\r\n\r\nDung dịch A
\r\n\r\nXanh metylen (C16H18N3SCl) 0,3\r\ng
\r\n\r\nEtanol 95 % 30\r\nml
\r\n\r\nDung dịch B
\r\n\r\nKali hydroxit 0,01\r\ng
\r\n\r\nNước 100\r\nml.
\r\n\r\nTrộn dung dịch A và dung dịch B,\r\nlắc đều. Hỗn hợp được để trong không khí, thỉnh thoảng lắc lên trong thời gian\r\nít nhất 1 năm trước khi sử dụng (có thể làm giảm thời gian bằng cách thêm từ từ\r\nK2CO3 để đạt được nồng độ cuối cùng là 1 %).
\r\n\r\nCHÚ THÍCH: Có thể sử dụng thuốc thử\r\nM’Fadyean thương mại.
\r\n\r\nC.2. Cách tiến hành
\r\n\r\nPhiếu tiêu bản rồi cố định bằng cồn\r\nnguyên chất trong 30 min đến 60 min hoặc để khô và cố định bằng nhiệt. Nhỏ dung\r\ndịch polycrom xanh melylen cho ngập tiêu bản. Để trong 30 s đến 60 s, sau đó\r\nrửa với nước hypoclorit và để khô.
\r\n\r\nC.3. Xem tiêu bản
\r\n\r\nXem tiêu bản bằng kính hiển vi\r\nquang học với vật kính dầu có độ phóng đại 100X.
\r\n\r\n\r\n\r\n
D.1. Cách tiến hành
\r\n\r\nCấy vi khuẩn cần kiểm tra vào 1,5\r\nml nước thịt và nuôi cấy trong 2 h ở 37 oC. Điều chỉnh để đạt được\r\nđộ đục 0,5 Mc Farland.
\r\n\r\nVi khuẩn được cấy lên toàn bộ bề\r\nmặt của đĩa thạch Mueller Hinton hay thạch máu bằng một tăm bông vô trùng. Đặt\r\nđĩa giấy tẩm penicillin G 10 UI lên đĩa và ấn nhẹ để đảm bảo giấy tẩm kháng\r\nsinh tiếp xúc với môi trường. Đặt đĩa thạch ở 37 oC trong 18 h.
\r\n\r\nSử dụng Bacilus cereus là\r\nmột đối chứng kháng với penicillin và Staphylococcus aureus ATCC\r\nlà chủng mẫn cảm với penicillin.
\r\n\r\nD.2. Đánh giá kết quả
\r\n\r\nĐánh giá vòng vô khuẩn: vòng vô\r\nkhuẩn lớn hơn hoặc bằng 29 mm là mẫn cảm.
\r\n\r\n\r\n\r\n
E.1. Chiết tách DNA
\r\n\r\nHòa tan một vòng que cấy vi khuẩn\r\nvào 25 μl nước khử ion hay nước vô trùng. Đun nóng tới 95 oC trong\r\nthời gian 20 min. Sau đó, làm lạnh tới 4 oC và ly tâm, lấy phần dung\r\ndịch nổi để sử dụng cho phản ứng PCR.
\r\n\r\nE.2. Thành phần của phản ứng PCR
\r\n\r\nTrong tổng thể tích phản ứng là 50\r\nμl gồm: các cặp mồi (xem Bảng E.3); dATP, dTTP, dCTP và dGTP có cùng nồng độ\r\n200 μM; MgCl2 1,5 μM và 2,5 UI ampi Taq DNA polymeraza, tất cả trong\r\nđệm NH4. Thêm 5 μl mẫu DNA.
\r\n\r\nCHÚ THÍCH: Có thể sử dụng sản phẩm\r\nthương mại và làm theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Sản phẩm thương mại có chứa\r\ntất cả thành phần nguyên liệu trừ các cặp mồi và mẫu.
\r\n\r\nE.3. Các cặp mồi cho phản ứng\r\nPCR
\r\n\r\nBảng\r\nE.3 – Các cặp mồi cho phản ứng PCR
\r\n\r\n| \r\n Đích \r\n | \r\n \r\n Tên\r\n mồi \r\n | \r\n \r\n Trình\r\n tự từ đầu 5’ tới 3’ \r\n | \r\n \r\n Kích\r\n thước sản phẩm \r\n | \r\n \r\n Nồng\r\n độ \r\n | \r\n
| \r\n Kháng\r\n nguyên bảo hộ (PA) \r\n | \r\n \r\n PA\r\n 5 \r\n3048-3029 \r\n | \r\n \r\n TCC-TAA-CAC-TAA-CGA-AGT-CG \r\n | \r\n \r\n 596\r\n bp \r\n | \r\n \r\n 1\r\n μM \r\n | \r\n
| \r\n PA\r\n 5 \r\n2452-2471 \r\n | \r\n \r\n | \r\n |||
| \r\n Giáp\r\n mô \r\n | \r\n \r\n 1234 \r\n1411-1430 \r\n | \r\n \r\n CTG-AGC-CAT-TAA-TCG-ATA-TG \r\n | \r\n \r\n 846\r\n bp \r\n | \r\n \r\n 0,2\r\n μM \r\n | \r\n
| \r\n 1301 \r\n2257-2238 \r\n | \r\n \r\n TCC-CAC-TTA-CGT-AAT-CTG-AG \r\n | \r\n
E.4. Chu trình nhiệt cho phản\r\nứng PCR
\r\n\r\n- Chạy 1 vòng ở 95 oC\r\ntrong 5 min.
\r\n\r\n- Chạy 30 vòng: 95 oC\r\ntrong 0,5 min; 55 oC trong 0,5 min; 72 oC trong 0,5 min.
\r\n\r\n- Chạy 1 vòng ở 72 oC\r\ntrong 5 min.
\r\n\r\n- Làm mát ở 4 oC.
\r\n\r\nE.5. Chạy điện di
\r\n\r\n- Mỗi ống sản phẩm được thêm vào 10\r\n% thể tích dung dịch thuốc nhuộm (6X).
\r\n\r\n- Cho 10 μl sản phẩm vào các giếng\r\ntrên bản thạch agaroza 1 % được pha trong dung dịch TBA.
\r\n\r\n- Cho 10 μl ladder 1 kb (1\r\nkilobase) vào giếng ngoài cùng.
\r\n\r\n- Bản thạch được điện di ở 80 V\r\ntrong 1 h, sau đó được nhuộm trong dung dịch ethidi bromua.
\r\n\r\n- Khi tiến hành phản ứng PCR cần\r\nphải có đối chứng dương và đối chứng âm. Đối chứng dương là một chủng tự nhiên\r\nđã biết độc lực chứa gen PA và có giáp mô hay có thể dùng chủng Sterne (có PA)\r\nvà chủng Pasteur (có giáp mô). Đối chứng âm là Bacillus spp không có độc\r\nlực, B. subtilis/ B.cereus.
\r\n\r\nE.6. Đánh giá kết quả
\r\n\r\nXem sản phẩm điện di trên bản thạch\r\nở máy phát tia UV.
\r\n\r\n- Với kháng nguyên PA:
\r\n\r\nKết quả dương tính khi đối chứng âm\r\nkhông có vạch sản phẩm có kích thước 596 bp.
\r\n\r\nKết quả âm tính khi đối chứng\r\ndương, đối chứng âm và mẫu kiểm tra không có vạch sản phẩm có kích thước 596\r\nbp.
\r\n\r\n- Với giáp mô:
\r\n\r\nKết quả dương tính khi đối chứng\r\ndương và mẫu kiểm tra có vạch sản phẩm có kích thước 846 bp và đối chứng âm\r\nkhông có vạch sản phẩm có kích thước 596 bp.
\r\n\r\nKết quả âm tính khi đối chứng\r\ndương, đối chứng âm và mẫu kiểm tra không có vạch sản phẩm có kích thước 846\r\nbp.
\r\n\r\n\r\n\r\n
THƯ\r\nMỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO
\r\n\r\n[1] TCVN 5154:2009, Vi sinh vật\r\ntrong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi – Phương pháp phát hiện Bacillus\r\nanthracis.
\r\n\r\n[2] MA Hornitzky, 2004, Australia\r\nand New Zealand Standard Diagnostic Procedure.
\r\n\r\n[3] OIE, 2008. Manual of\r\nDiagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animal, Chapter 2.1.1.
\r\n\r\n[4] P.J. Quin, M.E. Cater, B.\r\nMarkey, G.R.Cater, 1994. Clinical veterinary microbiology.
\r\n\r\n[5] Nguyễn Vĩnh Phước, 1978. Giáo\r\ntrình bệnh truyền nhiễm gia súc.
\r\n\r\n[6] Viện Thú y quốc gia – JICA,\r\n2002. Cẩm nang chẩn đoán tiêu chuẩn về các bệnh gia súc ở Việt Nam.
\r\n\r\n[7] World Health Organization\r\nRegional Office for South-East Asia New Delhi. Manual for Laboratory\r\nDiagnosis for Anthrax.
File gốc của Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 5274:2010 về Bệnh động vật – Quy trình chẩn đoán bệnh nhiệt thán đang được cập nhật.
Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 5274:2010 về Bệnh động vật – Quy trình chẩn đoán bệnh nhiệt thán
Tóm tắt
| Cơ quan ban hành | Đã xác định |
| Số hiệu | TCVN5274:2010 |
| Loại văn bản | Tiêu chuẩn Việt Nam |
| Người ký | Đã xác định |
| Ngày ban hành | 2010-01-01 |
| Ngày hiệu lực | |
| Lĩnh vực | Nông nghiệp |
| Tình trạng | Hết hiệu lực |