QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH VI KHUẨN, VIRUS, PHYTOPLASMA GÂY BỆNH THỰC VẬT
PHẦN 2-12: YÊU CẦU CỤ THỂ ĐỐI VỚI QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH VIRUS SỌC LÁ LẠC PEANUT STRIPE VIRUS
Procedure for identification of plant disease caused by bacteria, virus, phytoplasma
Part 2-12: Particular requirements for identification of Peanut stripe virus
Lời nói đầu
TCVN 12371-2-12:2022 do Cục Bảo vệ thực vật biên soạn, BộNông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.
Bộ TCVN 12371 Quy trình giám định vi khuẩn, virus, phytoplasma gây bệnh thực vật gồm các phần sau:
- TCVN 12371-1:2019: Phần 1: Yêu cầu chung
- TCVN 12371-2-1:2018: Phần 2-1: Yêu cầu cụ thể đối với Plum pox virus
- TCVN 12371-2-2:2018: Phần 2-2: Yêu cầu cụ thể đối với vi khuẩn Xylella fastidiosa Wells et al.
- TCVN 12371-2-3:2019: Phần 2-3: Yêu cầu cụ thể đối với vi khuẩn Clavibactermichiganensis subsp. michiganensis (Smith) Davis et al.
- TCVN 12371-2-4:2020: Phần 2-4: Yêu cầu cụ thể đối với Alfalfa mosaic virus
- TCVN 12371-2-5:2020: Phần 2-5: Yêu cầu cụ thể đối với vi khuẩn Pantoeastewartii (Smith) Mergaert
- TCVN 12371-2-6:2020: Phần 2-6: Yêu cầu cụ thể đối với Potato spindle tuber viroid
- TCVN 12371-2-7:2021: Phần 2-7: Yêu cầu cụ thể đối với Coffee ringspot virus
- TCVN 12371-2-8:2021: Phần 2-8: Yêu cầu cụ thể đối với vi khuẩn Pseudomonas syringae pv. garcae
- TCVN 12372-2-9:2021: Phần 2-9: Yêu cầu cụ thể đối với Rice grassy stunt virus và Rice ragged stunt virus
- TCVN 12371-2-10:2021: Phần 2-10: Yêu cầu cụ thể đối với Southern rice black streaked dwarf virus
- TCVN 12371-2-11:2022: Phần 2-11: Yêu cầu cụ thể đối với quy trình giám định virus chùn ngọn chuối do Banana bunchy top virus
- TCVN 12371-2-12:2022: Phần 2-12: Yêu cầu cụ thể đối với quy trình giám định virus sọc lá lạc Peanut stripe virus
QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH VI KHUẨN, VIRUS, PHYTOPLASMA GÂY BỆNH THỰC VẬT
PHẦN 2-12: YÊU CẦU CỤ THỂ ĐỐI VỚI QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH VIRUS SỌC LÁ LẠC PEANUT STRIPE VIRUS
Procedure for identification of plant disease caused by bacteria, virus, phytoplasma
Part 2-12: Particular requirements for identification of Peanut stripe virus
Tiêu chuẩn này quy định các yêu cầu cụ thể đối với quy trình giám định virus sọc lá lạc Peanut stripe virus.
Tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).
TCVN 12371-1:2019. Quy trình giám định vi khuẩn, virus, phytoplasma gây bệnh thực vật. Phần 1: Yêu cầu chung.
Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm (theo điều 3 của TCVN 12371- 1:2019) và các thiết bị, dụng cụ sau:
3.1 Máy chu trình nhiệt (PCR)
3.2 Máy điện di
3.3 Hệ thống đọc bản gel UV
Chỉ sử dụng các hóa chất loại tinh khiết phân tích trừ khi có quy định khác. Hóa chất sử dụng theo điều 4 của TCVN 12371-1:2019 và các hóa chất dưới đây. Phương pháp pha các loại dung dịch tham khảo phụ lục B.
4.1 Agarose
4.2 Nước cất 01 lần
4.3 Nước khử ion
4.4 Cồn (C2H5OH): 70 %
4.5 Thuốc nhuộm Loading dye
4.6 Axit acetic (CH3COOH)
4.7 Etylenediaminetetraacetic Axit (EDTA) (C10H16N2O8): tinh thể
4.8 Tris-Base (C4H11NO3): tinh thể
4.9 Natri hydroxide (NaOH): tinh thể
5.1 Lấy mẫu
Lấy mẫu theo điều 5.1 của TCVN 12371-1:2019.
5.2 Bảo quản mẫu
Bảo quản mẫu khi giám định hoặc sau khi giám định theo điều 5.2.2.1 của TCVN 12371-1:2019
Triệu chứng gây hại của virus trên cây lạc khác nhau tùy thuộc vào các chủng của virus và giống lạc được trồng. Trên lá non hầu hết các chủng gây triệu chứng ban đầu là các vết đốm nhỏ hoặc vệt hình nhẫn mất màu, úa vàng. Toàn bộ cây bị thấp lùn. Trên lá già triệu chứng bệnh biểu hiện đặc trưng cho từng chủng virus gồm: đốm mất màu nhẹ, đốm loang lổ mầu xanh đậm, xuất hiện vết sọc trên lá, đốm hình nhẫn, vệt mất màu hình đường thẳng, đốm hình lá cây sồi hoặc xuất hiện các vết chết hoại. Triệu chứng bệnh sẽ tồn tại trong suốt giai đoạn sinh trưởng, phát triển của cây. Trong số 07 chủng của virus được tìm thấy tại khu vực Đông Nam Á, chủng gây ra triệu chứng đốm loang lổ mầu xanh đậm và đốm mất màu nhẹ là phổ biến nhất”.
Khi kiểm tra lô hàng cần chú ý các nước mà virus có phân bố (xem phụ lục A) và các loài cây ký chủ mà virus gây hại (xem phụ lục A).
Hình 1 - Triệu chứng của bệnh sọc lá lạc biểu hiện trên lá già với các vết đốm mầu xanh đen, tập trung phần trên của lá [2] | Hình 2-Triệu chứng của bệnh sọc lá lạc biểu hiện trên lá non với các đốm hình nhẫn, khảm xanh vàng và các vết chết hoại [2] |
Hình 3 - Hìnhảnh cây lạc không nhiễm bệnh (a) với cây lạc bị nhiễm bệnh sọc lá lạc (b) [1] | |
7.1 Giám định bằng RT-PCR
7.1.1 Tách chiết RNA
Thực hiện theo điều 7.2.1 của TCVN 12371-1:2019.
7.1.2 Nhân gen
RNA thu được sau khi tách chiết tiến hành nhân gen trong máy chu trình nhiệt (PCR) (3.1).
Sử dụng cặp mồi đặc hiệu:
PStV-F: 5’- GGC GAG TAT GAA AT A GAT-3’
PStV-R: 5’- GGT GGT AAA ACC ACA CTG-3’
Thực hiện phản ứng RT-PCR một bước (one-step RT-PCR)
Chu trình nhiệt:
45 °C - 54 °C trong 30 phút 94 °C trong 2 phút 94 °C trong 30 giây 50 °C trong 30 giây 72 °C trong 60 giây 72 °C trong 10 phút | Lặp lại 35 chu kì |
* Nhiệt độ của từng giai đoạn trong chu trình nhiệt có thể thay đổi tùy theo sinh phẩm, thuốc thử sử dụng của từng nhà sản xuất.
7.1.3 Đọc kết quả
Sản phẩm PCR được điện di bằng máy điện di (3.2) sử dụng gel agarose 1,5 % (4.1) trong đệm điện diTAE (B.1).
Đọc kết quả điện di bằng hệ thống đọc bản gel UV (3.3).
Mẫu dương tính cho đoạn gen kích thước kích thước 611 bp khi sử dụng cặp mồi đặc hiệu PStV- F/PStV-R.
7.2 Kết luận
Mẫu giám định được kết luận là virus sọc lá lạc Peanut stripe virus khi có kết quả dương tính với phương pháp giám định bằng RT-PCR.
Nội dung phiếu kết quả giám định gồm những thông tin cơ bản sau:
Thông tin về mẫu giám định
Tên loài
Phương pháp giám định
Người giám định/cơ quan giám định
Phiếu kết quả giám định chi tiết tham khảo phụ lục C.
A.1 Tên khoa học và vị trí phân loại
Tên tiếng Việt: Virus sọc lá lạc
Tên khoa học: Peanut stripe virus
Tên khác:
Groundnut mild mottle virus
Groundnut mosaic virus
Groundnut stripe virus
Peanut chlorotic ring mottle virus
Peanut chlorotic ring virus
Peanut mild mottle virus
Peanut mosaic virus
Vị trí phân loại:
Bộ: Patatavirales
Họ: Potyviridae
Giống: Potyvirus
A.2 Phân bố
Châu Á: Trung Quốc; Ấn Độ, Nhật Bản, Malaysia, Myanmar, Philippines, Hàn Quốc, Đài Loan, Thái Lan;
Châu Phi: Senegal, Nam Phi;
Châu Mỹ: Hoa Kỳ.
A.3 Ký chủ chính
Arachis hypogaea (lạc), Glycine max (đậu tương), Lupinus albus (đậu lupin trắng), Medicago sativa (cỏ linh lăng), Sesamum indicum (vừng), Vigna radiata (đậu xanh), Vigna unguiculata (đậu đũa), Senna occidentalis (muồng tây).
A.4 Đặc điểm sinh học
Virus gây bệnh sọc lá lạc (PStV) lan truyền trong tự nhiên từ cây bệnh sang cây khỏe nhờ các loài rệp muội, virus được truyền theo kiểu không bền vững. Loài rệp đậu (Aphis craccivora) là môi giới truyền bệnh phổ biến nhất trên ruộng trồng lạc. Tỷ lệ truyền virus của loài rệp đậu lên đến 100% khi 10 cá thể rệp cùng truyền virus, trong khi tỷ lệ truyền virus của một cá thể rệp đậu chỉ đạt 17%. Ngoài rệp đậu, một số loài rệp khác như rệp đào (Myzus persicae), rệp bông (A. gossypii), rệp đậu tương (A. glycines) và rệp mận (Hysteroneura setariae) đều có khả năng truyền virus với hiệu quả cao. PStV có khả năng truyền qua hạt giống lạc với tỷ lệ truyền lên đến 37%. Virus có thể lây nhiễm trong phôi và mầm hạt.
PStV lan truyền trong tự nhiên chỉ được khoảng cách tương đối ngắn từ nguồn bệnh ban đầu. Virus truyền từ cây nhiễm bệnh sang cây khỏe chỉ trong khoảng cách 100 mét tại những ruộng có mật độ các loài rệp muội ở mức thấp. Trong khi đó, tại những ruộng có mật độ rệp muội cao, virus có khả năng lan truyền xa đến 300 mét.
B.1 Dung dịch đệm điện di TAE
0,5 M EDTA (B.2) | 2 ml |
Tris-Base (4.8) | 4,84 gram |
Axit acetic (4.6) | 1,15ml |
Nước cất (4.2) | 1000 ml |
Hoà tan các thành phần trên trong 800 ml nước cất trước, khuấy đều. Thêm lượng nước cất cho đủ 1000 ml. Bảo quản ở nhiệt độ phòng thí nghiệm. Thời hạn sử dụng: 03 tháng.
B.2 Dung dịch 0,5 M EDTA (pH 8)
EDTA (4.7) | 18,61 g |
Nước cất (4.2) | 100 ml |
Hoà tan lượng EDTA trong 80 ml nước cất trước, khuấy đều và chỉnh pH 8,0 bằng dung dịch NaOH 10 M (B.3). Thêm lượng nước cất cho đủ 100 ml. Bảo quản ở 4 °C. Thời hạn sử dụng: 03 tháng.
B.3 Dung dịch NaOH 10 M
NaOH (4.9) | 40 gram |
Nước cất (4.2) | 100 ml |
Hoà tan lượng NaOH trên trong 80 ml nước cất trước, khuấy đều. Thêm lượng nước cất cho đủ 100 ml. Bảo quản ở nhiệt độ phòng thí nghiệm. Thời hạn sử dụng: 03 tháng.
Cơ quan giám định ……………………….. | CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM |
| …… ngày ... tháng ... năm 20 … |
PHIẾU KẾT QUẢ GIÁM ĐỊNH
1. Đơn vị gửi mẫu:
2. Tên mẫu:
3. Số lượng mẫu:
4. Tình trạng mẫu:
5. Địa điểm lấy mẫu:
6. Ngày lấy mẫu:
7. Người lấy mẫu:
8. Ngày nhận mẫu:
9. Ký hiệu mẫu:
10. Người giám định:
11. Phương pháp giám định: Theo TCVN 12371-2-12: 2022 về “Quy trình giám định vi khuẩn,virus, phytoplasma gây bệnh thực vật. Phần 2-12: Yêu cầu cụ thể đối với quy trình giám định virus sọc lá lạc Peanut stripe virus”.
12. Kết quả giám định:
Tên tiếng Việt: Virus sọc lá lạc
Tên khoa học: Peanut stripe virus
Vị trí phân loại:
Bộ: Patatavirales
Họ: Potyviridae
Giống: Potyvirus
TRƯỞNG PHÒNG KỸ THUẬT | THỦ TRƯỞNG ĐƠN VỊ |
Thư mục tài liệu tham khảo
[1] Anthony Simiyu Mabele, Fredrick Wotia. First Report of Peanut stripe Virus Infecting Groundnut (Arachis hypogaea L.) in Western Kenya. Biochemistry and Molecular Biology. Vol. 6, No. 1, 2021, pp.11-18.
[2] CABI, 2021. Crop Protection Compendium.
[3] Cassidy, B., Sherwood, J. L, and Nelson, R. S. 1993. Cloning of the capsid protein gene from a blotch isolate of Peanut stripe virus. Arch. Virol. 128:287-297.
[4] Gillaspie, A. G., Jr., Pittman, R. N., Pinnow, D. L, and Cassidy, B. G., 2000. Sensitive Method for Testing Peanut Seed Lots for Peanut stripe and Peanut mottle viruses by Immunocapture-Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction. Plant Dis. 84:559-561.