QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH VI KHUẨN, VIRUS, PHYTOPLASMA GÂY BỆNH THỰC VẬT
PHẦN 2-11: YÊU CẦU CỤ THỂ ĐỐI VỚI QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH VIRUS CHÙN NGỌN CHUỐI BANANA BUNCHY TOP VIRUS
Procedure for identification of plant disease caused by bacteria, virus, phytoplasma
Part 2-11: Particular requirements for identification of Banana bunchy top virus
Lời nói đầu
TCVN 12371-2-11:2022 do Cục Bảo vệ thực vật biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.
Bộ TCVN 12371 Quy trình giám định vi khuẩn, virus, phytoplasma gây bệnh thực vật gồm các phần sau:
- TCVN 12371-1:2019: Phần 1: Yêu cầu chung
- TCVN 12371-2-1:2018: Phần 2-1: Yêu cầu cụ thể đối với Plum pox virus
- TCVN 12371-2-2:2018: Phần 2-2: Yêu cầu cụ thể đối với vi khuẩn Xylella fastidiosa Wells et al.
- TCVN 12371-2-3:2019: Phần 2-3: Yêu cầu cụ thể đối với vi khuẩn Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Smith) Davis et al.
- TCVN 12371-2-4:2020: Phần 2-4: Yêu cầu cụ thể đối với Alfalfa mosaic virus
- TCVN 12371-2-5:2020: Phần 2-5: Yêu cầu cụ thể đối với vi khuẩn Pantoeastewartii (Smith) Mergaert
- TCVN 12371-2-6:2020: Phần 2-6: Yêu cầu cụ thể đối với Potato spindle tuber viroid
- TCVN 12371-2-7:2021: Phần 2-7: Yêu cầu cụ thể đối với Coffee ringspot virus
- TCVN 12371-2-8:2021: Phần 2-8: Yêu cầu cụ thể đối với vi khuẩn Pseudomonas syringae pv. garcae
- TCVN 12372-2-9:2021: Phần 2-9: Yêu cầu cụ thể đối với Rice grassy stunt virus và Rice ragged stunt virus
- TCVN 12371-2-10:2021: Phần 2-10: Yêu cầu cụ thể đối với Southern rice black streaked dwarf virus
- TCVN 12371-2-11:2022: Phần 2-11: Yêu cầu cụ thể đối với quy trình giám định virus chùn ngọn chuối Banana bunchy top virus
- TCVN 12371-2-12:2022: Phần 2-12: Yêu cầu cụ thể đối với quy trình giám định virus sọc lá lạc Peanut stripe virus
QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH VI KHUẨN, VIRUS, PHYTOPLASMA GÂY BỆNH THỰC VẬT
PHẦN 2-11: YÊU CẦU CỤ THỂ ĐỐI VỚI QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH VIRUS CHÙN NGỌN CHUỐI BANANA BUNCHY TOP VIRUS
Procedure for identification of plant disease caused by bacteria, virus, phytoplasma
Part 2-11: Particular requirements for identification of Banana bunchy top virus
Tiêu chuẩn này quy định các yêu cầu cụ thể đối với quy trình giám định virus chùn ngọn chuối Banana bunchy top virus.
Tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).
TCVN 12371-1:2019, Quy trình giám định vi khuẩn, virus, phytoplasma gây bệnh thực vật. Phần 1: Yêu cầu chung.
Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm (theo điều 3 của TCVN 12371-1:2019) và các thiết bị, dụng cụ sau:
3.1 Máy chu trình nhiệt (PCR)
3.2 Máy điện di
3.3 Hệ thống đọc bản gel UV
Chỉ sử dụng các hóa chất loại tinh khiết phân tích trừ khi có quy định khác. Hóa chất sử dụng theo điều 4 của TCVN 12371-1:2019 và các hóa chất dưới đây. Phương pháp pha các dung dịch đệm tham khảo phụ lục B.
4.1 Agarose
4.2 Thuốc nhuộm Loading dye
4.3 Cồn (C2H5OH): 70 %
4.4 Nước cất 1 lần
4.5 2- mercaptoethanol (HOCH2CH2SH)
4.6 Etylenediaminetetraacetic acid (EDTA) (C10H16N2O8)
4.7 Tris-Base (C4H11NO3): tinh thể
4.8 Axit acetic (CH3COOH)
4.9 Natri hydrocarbonat 99 % (NaHCO3): tinh thể
4.10 Natri carbonat 99 % (Na2CO3): tinh thể
4.11 Natri azua 99 % (NaN3): tinh thể
4.12 Natri hidro phosphat 99 % (Na2HPO4): tinh thể
4.13 Kali dihidro phosphate 99 % (K2HPO4.12H2O): tinh thể
4.14 Kali hidro phosphate 99 % (KH2PO4): tinh thể
4.15 Natri clorua 99 % (NaCl): tinh thể
4.16 Kali clorua 99 % (KCl): tinh thể
4.17 Tween 20 (C58H114O26)
4.18 Diethanolamine (DEA)
4.19 Bovine serum albumin (BSA)
4.20 Natri hydroxide (NaOH): tinh thể
4.21 Axit Clohydric 37 % (HCl)
5.1 Lấy mẫu
Lấy mẫu theo điều 5.1 của TCVN 12371-1:2019.
5.2 Bảo quản mẫu
Bảo quản mẫu khi giám định hoặc sau khi giám định theo điều 5.2.2.1 của TCVN 12371-1:2019
Triệu chứng điển hình của bệnh chùn ngọn chuối dễ dàng phân biệt với các bệnh virus khác gây ra trên cây chuối. Chuối có thể bị nhiễm bệnh ở tất cả các giai đoạn phát triển của cây. Sau khi trồng cây chuối bị nhiễm virus do rệp muội chuối truyền thì triệu chứng bệnh có sự khác biệt với triệu chứng bệnh của cây chuối được nhân giống từ khóm chuối bị nhiễm virus.
Đối với cây chuối bị nhiễm bệnh virus do rệp muội chuối (Pentalonia nigronervosa) truyền từ cây bệnh sang cây khỏe, triệu chứng bệnh thường xuất hiện ở lá thứ hai tính từ ngọn. Trên lá xuất hiện những sọc màu xanh đậm hoặc những đốm trên các gân phụ của lá tại phần dưới của phiến lá. Triệu chứng các đốm nhỏ đôi khi cũng có thể được quan sát thấy trên cuống lá. Các lá mọc tiếp theo có những vệt màu trắng chạy dọc theo gân phụ khi lá vẫn đang cuộn lại. Những vệt trắng này biến màu xanh đen khi lá đã bung ra. Lá kế tiếp nhỏ hơn, cả về chiều dài và chiều rộng của phiến lá, và thường có màu úa vàng, mép lá dựng thẳng lên. Lá trở nên khô và giòn, mọc thẳng đứng, tạo ra triệu chứng chùn ngọn.
Đối với cây chuối bị nhiễm bệnh virus từ vật liệu làm giống, triệu chứng điển hình sẽ biểu hiện ngay từ lá đầu tiên tính từ ngọn. Các lá mọc thành chùm và nhỏ, mép lá úa vàng, hoại tử. Các sọc xanh đậm trên lá thường hiện rất rõ. Cây bị nhiễm bệnh virus chùn ngọn chuối ở giai đoạn sớm sẽ không có khả năng tạo buồng và không cho quả. Cây bị nhiễm ở giai đoạn muộn có thể cho đậu quả nhưng quả sẽ nhỏ và méo mó.
Thông tin về phân bố và đặc điểm sinh học của virus chùn ngọn chuối (Banana bunchy top virus) tham khảo phụ lục A.
Hình 1 - Triệu chứng cây chuối nhiễm bệnh chùn ngọn chuối bị thấp lùn, lá mọc xít nhau, dựng thẳng đứng [1] | Hình 2 - Triệu chứng lá xuất hiện những sọc màu xanh đậm chạy dọc theo gân phụ của lá, mép lá úa vàng, hoại tử, khô héo [1] |
7.1 Giám định bằng ELISA
7.1.1 Chuẩn bị dịch mẫu
Nghiền mẫu lá trong đệm Photphat PBS (B.2), ly tâm trong 30 giây thu phần dịch trong.
7.1.2 Quy trình thực hiện ELISA
Thực hiện theo điều 7.1.2.3 của TCVN 12371 -1:2019.
7.2 Giám định bằng PCR
7.2.1 Tách chiết DNA
Thực hiện tách chiết mẫu lá nghi nhiễm bệnh theo điều 7.1.3.2 của TCVN 12371-1:2019
7.1.2 Nhân gen
DNA thu được sau khi tách chiết tiến hành nhân gen trong máy chu trình nhiệt (PCR) (3.1).
Sử dụng cặp mồi đặc hiệu:
CP.F1: 5'-ATG GCT AGG TAT CCG AAG-3'
CP.R1: 5'-CCA GAA CTA CAA TAG AAT GCC-3’
Chu trình nhiệt:
94 °C trong 5 phút 94 °C trong 60 giây 57 °C trong 60 giây 72 °C trong 90 giây 72 °C trong 10 phút | Lặp lại 35 chu kì |
* Nhiệt độ của từng giai đoạn trong chu trình nhiệt có thể thay đổi tùy theo sinh phẩm, thuốc thử sử dụng của từng nhà sản xuất.
7.2.3 Đọc kết quả
Sản phẩm PCR được điện di bằng máy điện di (3.2) sử dụng gel agarose 1,5 % (4.1) trong đệm điện di TAE (B.6).
Đọc kết quả điện di bằng hệ thống đọc bản gel UV (3.3)
Mẫu dương tính cho đoạn gen kích thước 530 bp khi sử dụng cặp mồi đặc hiệu CP.F1/ CP.R1.
7.3 Kết luận
Mẫu giám định được kết luận là virus chùn ngọn chuối Banana bunchy top virus khi:
+ Có kết quả dương tính với phương pháp giám định bằng ELISA Hoặc
+ Có kết quả dương tính với phương pháp giám định bằng PCR
Nội dung phiếu kết quả giám định gồm những thông tin cơ bản sau:
Thông tin về mẫu giám định
Tên loài
Phương pháp giám định
Người giám định/cơ quan giám định
Phiếu kết quả giám định chi tiết tham khảo phụ lục C.
A.1 Tên khoa học và vị trí phân loại
Tên tiếng Việt: Virus chùn ngọn chuối
Tên khoa học: Banana bunchy top virus
Tên khác:
Banana bunchy top nanovirus
Vị trí phân loại:
Bộ: Mulpavirales
Họ: Nanoviridae
Giống: Babuvirus
A.2 Phân bố
Trong nước: Virus là dịch hại ngoại lai xâm hại của Việt Nam, được ghi nhận tại khắp các tỉnh trồng chuối của Việt Nam:
Trên thế giới:
Châu Á: Bangladesh, Campuchia, Trung Quốc; Ấn Độ, Nhật Bản, Malaysia, Myanmar, Nepal, Pakistan, Philippines, Hàn Quốc, Đài Loan, Thái Lan;
Châu Phi: Angola, Benin, Burundi, Cameroon, Cộng hòa Trung Phi, Cộng hòa dân chủ Công-gô, Ai Cập, Gabon, Mozambique, Nigeria, Rwanda, Nam Phi, Zambia;
Châu Mỹ: Hoa Kỳ;
Châu Đại Dương: Samoa, Úc, Fiji.
A.3 Ký chủ chính
Musa (chuối), Musa acuminata (chuối dại), Musa x paradisiaca (Chuối tiêu họa), Musa textilis (chuối sợi).
A.4 Đặc điểm sinh học
Virus gây bệnh chùn ngọn chuối (BBTV) lan truyền trong tự nhiên từ cây bệnh sang cây khỏe nhờ loài rệp muội chuối (Pentalonia nigronervosa), qua vật liệu làm giống bị nhiễm virus nhưng không truyền được qua lây nhiễm bằng cơ giới.
Bệnh virus chùn ngọn chuối truyền rất hiệu quả qua vật liệu làm giống như thân, củ, chồi. Tất cả những chồi lấy từ cây bị nhiễm virus thì sẽ bị nhiễm bệnh 100 % sau khi trồng. BBTV còn có thể truyền qua cây chuối nuôi cấy mô với tỷ lệ lên đến 100 %.
BBTV lan truyền qua loài rệp muội chuối (Pentalonia nigronervosa) theo kiểu bền vững tuần hoàn. Thời gian chích nạp virus tối thiểu của rệp là từ 4 - 17 giờ; thời gian chích truyền tối thiểu từ 15 phút - 2 giờ; thời gian tiềm ẩn của virus trong cơ thể rệp là từ 20 - 28 giờ, thời gian tồn tại của virus trong cơ thể rệp là từ 13 - 20 ngày. Virus không truyền từ rệp cái nhiễm virus cho thế hệ sau và không nhân lên trong cơ thể rệp. Hiệu quả truyền virus của cá thể rệp chuối (Pentalonia nigronervosa) khá cao, dao động từ 46 - 67 %. Ấu trùng rệp chích nạp virus và truyền virus hiệu quả hơn so với trưởng thành rệp.
BBTV lan truyền trong tự nhiên chỉ được khoảng cách tương đối ngắn từ nguồn bệnh ban đầu thông qua vector là rệp chuối. Khoảng cách trung bình của sự lây nhiễm thứ cấp của virus chỉ là 15,5-17,7 mét.
B.1 Dung dịch đệm phủ Coating (Dung dịch đệm Carbonate)
NaHCO3(4.9) | 2,93 g |
Na2CO3 (4.10) | 1,59 g |
NaN3 (4.11) | 0,2 g |
Nước cất (4.4) | 1000 ml |
Hoà tan các thành phần trên trong 800 ml nước cất trước, khuấy đều và chỉnh pH 9,6 bằng dung dịch NaOH 10 M (B.8). Thêm lượng nước cất cho đủ 1000 ml. Bảo quản ở 4 °C. Thời hạn sử dụng:03 tháng.
B.2 Dung dịch đệm Photphat PBS
NaCl (4.15) | 8,0 g |
KH2PO4 (4.14) | 0,2 g |
NaN3 (4.11) | 0,2 g |
Na2HPO412H2O (4.13) | 2,9 g |
KCl (4.16) | 0,2 g |
Nước cất (4.4) | 1000ml |
Hoà tan các thành phần trên trong 800 ml nước cất trước, khuấy đều và chỉnh pH 7,4 bằng dung dịch NaOH 10 M (B.8). Thêm lượng nước cất cho đủ 1000 ml. Bảo quản ở 4 °C. Thời hạn sử dụng: 03 tháng.
B.3 Dung dịch đệm rửa PBS-T
Đệm photphat PBS (B.2) | 1000ml |
Tween 20 (4.17) | 0,5 ml |
Hoà Tween 20 trong đệm photphat PBS. Bảo quản ở điều kiện phòng thí nghiệm. Thời hạn sử dụng: 03 tháng.
B.4 Dung dịch đệm pha kháng thể (Dung dịch đệm conjugate)
Đệm rửa PBS-T (B3) | 1000 ml |
Bovine serum albumin (4.19) | 0,2 g |
Hoà Bovine serum albumin trong đệm rửa PBS-T. Bảo quản ở 4 °C. Thời hạn sử dụng: 03 tháng.
B.5 Dung dịch đệm chất nền
Diethanolamine (4.18) | 97 ml |
NaN3 (4.11) | 0,2 g |
Nước cất (4.4) | 1000 ml |
Hoà tan các thành phần trên trong 800 ml nước cất trước, khuấy đều và chỉnh pH 9,8 bằng axit clohydric 37 % (HCl) (4.21). Thêm lượng nước cất cho đủ 1000 ml. Bảo quản ở 4 °C. Thời hạn sử dụng:03 tháng.
B.6 Dung dịch đệm điện di TAE
0,5 M EDTA (B2) | 2 ml |
Tris-Base (4.7) | 4,84 gram |
Axit acetic (4.8) | 1,15ml |
Nước cất (4.4) | 1000 ml |
Hoà tan các thành phần trên trong 800 ml nước cất trước, khuấy đều. Thêm lượng nước cất cho đủ 1000 ml. Bảo quản ở nhiệt độ phòng thí nghiệm. Thời hạn sử dụng: 03 tháng.
B.7 Dung dịch 0,5 M EDTA (pH 8)
EDTA (4.6) | 18,61 g |
Nước cất (4.4) | 100 ml |
Hoà tan lượng EDTA trong 80 ml nước cất trước, khuấy đều và chỉnh pH 8,0 bằng dung dịch NaOH 10 M (B.8). Thêm lượng nước cất cho đủ 100 ml. Bảo quản ở 4 °C. Thời hạn sử dụng: 03 tháng.
B.8 Dung dịch NaOH 10 M
NaOH (4.20) | 40 gram |
Nước cất (4.4) | 100 ml |
Hoà tan lượng NaOH trên trong 80 ml nước cất trước, khuấy đều. Thêm lượng nước cất cho đủ 100 ml. Bảo quản ở nhiệt độ phòng thí nghiệm. Thời hạn sử dụng: 03 tháng.
Cơ quan giám định …………………………. | CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM |
| …… ngày ... tháng ... năm 20….. |
PHIẾU KẾT QUẢ GIÁM ĐỊNH
1. Đơn vị gửi mẫu:
2. Tên mẫu:
3. Số lượng mẫu:
4. Tình trạng mẫu:
5. Địa điểm lấy mẫu:
6. Ngày lấy mẫu:
7. Người lấy mẫu:
8. Ngày nhận mẫu:
9. Ký hiệu mẫu:
10. Người giám định:
11. Phương pháp giám định: Theo TCVN 12371-2-11: 2022 về “Quy trình giám định vi khuẩn,virus, phytoplasma gây bệnh thực vật. Phần 2-11: Yêu cầu cụ thể đối với quy trình giám định virus chùn ngọn chuối Banana bunchy top virus”.
12. Kết quả giám định:
Tên tiếng Việt: Virus chùn ngọn chuối
Tên khoa học: Banana bunchy top virus
Vị trí phân loại:
Bộ: Mulpavirales
Họ: Nanoviridae
Giống: Babuvirus
TRƯỞNG PHÒNG KỸ THUẬT | THỦ TRƯỞNG ĐƠN VỊ |
Thư mục tài liệu tham khảo
[1] Ngô Bích Hảo, 1998. Nghiên cứu một số bệnh chính hại chuối vùng Hà Nội và phụ cận. Luận án Tiến sỹ Nông nghiệp, Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội.
[2] CABI, 2021. Crop Protection Compendium.
[3] Lava Kumar, 2010. Virus Detection in Banana. A Laboratory Manual.
[4] Shahid Mansoor, Javaria Qazi, Imran Amin, Abdullah Khatri, Imtiaz A. Khan, Saboohi Raza, Yusuf Zafar, and Rob w. Briddon., 2005. A PCR-Based Method, With Internal Control, for the Detection of Banana bunchy top vims in Banana. Molecular Biotechnology Vol 30,167-169.
[5] Shelake Rahul Mahadev, Senthil Kumar Thamilarasan and Angappan Kathithachalam, 2013. PCR Detection of Banana bunchy top virus (BBTV) at Tissue Culture Level for the Production of Virus-free Planting Materials. Int. Res. J. Biological Sci. Vol. 2(6), 22-26.