TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 12104:2018

VI SINH VẬT PHÂN GIẢI XENLULO - XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ XENLULAZA

Cellulose microorganism - Determination of cellulase activity

Lời nói đầu

TCVN 12104:2018 do Viện Thổ nhưỡng Nông hóa biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

VI SINH VẬT PHÂN GIẢI XENLULO - XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ XENLULAZA

Cellulose microorganism - Determination of cellulase activity

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hoạt độ xenlulaza của dịch nuôi cấy vi sinh vật phân giải xenlulo dạng hiếu khí.

2  Tài liệu viện dẫn

Tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987), Nước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm.

3  Thuật ngữ, định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này sử dụng các thuật ngữ, định nghĩa sau.

3.1

Xenlulaza (cellulase)

Xenlulaza là một phức hệ enzym xúc tác thủy phân xenlulose thành xenlobio và cuối cùng là glucose.

3.2

Hoạt độ xenlulaza tính theo đơn vị giấy lọc (cellulase activity by filter paper unit - FPU):

Hàm lượng xenlulaza có thể giải phóng 2 mg glucose từ 50 mg giấy lọc trong 60 min.

3.3

Đường khử (reducing sugar):

Là một loại đường có chứa nhóm andehit (R-COH) hoặc xeton (C=O) tự do, có khả năng hoạt động như một chất khử. Ví dụ: Glucose, fructose, galactose.

4  Nguyên tắc

Xác định hoạt độ thủy phân giấy lọc bằng cách xác định lượng đường khử được tạo thành khi cho 0,5 mL dịch nuôi cấy vi sinh vật tác dụng với cơ chất xenlulo (giấy lọc Whatman số 1) ở pH 4,8 và nhiệt độ 50 °C trong thời gian 60 min.

Lượng đường khử sinh ra phản ứng với thuốc thử axit 3,5-Dinitrosalixilic (DNS), cường độ màu (màu lục) của hợp chất tạo thành sau phản ứng được đo quang phổ ở bước sóng 540 nm.

5  Hóa chất, thuốc thử

Sử dụng các loại hóa chất tinh khiết phân tích.

5.1  Nước, đáp ứng các yêu cầu nước loại 3 trong TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987).

5.2  Dung dịch đệm xitrat 0,05 M, pH 4,8

Cân 210 g axit xitric ngậm một phân tử nước (C₆H₈O₇.H₂O) cho vào bình định mức dung tích 1000 mL đã chứa 900 mL nước (5.1), lắc đều. Thêm từ từ natri hiđroxit (NaOH) (khoảng từ 50 g đến 60 g) để pH dung dịch đạt 4,5. Thêm nước (5.1) đến vạch 1000 mL. Thu được đệm xitrat 1 M, pH 4,5.

Lấy 50 mL đệm xitrat 1 M, pH 4,5 cho vào bình định mức dung tích 1000 mL. Thêm nước cất đến vạch định mức. Lắc kỹ, thu được đệm xitrat 0,05 M, pH 4,8.

5.3  Giấy lọc

Cắt miếng giấy lọc Whatman số 1, hình chữ nhật, kích thước 1,0 cm x 6,0 cm; Khối lượng miếng giấy lọc tương đương 50 mg.

- Kiểm tra lại khối lượng miếng giấy lọc để đảm bảo khối lượng miếng giấy lọc là 50 ± 1 mg.

- Sử dụng kẹp hoặc đeo găng tay khi thực hiện các thao tác trên.

5.4  Dung dịch thuốc thử axit 3, 5 dinitrosalixilic (DNS)

5.4.1  Thành phần

5.4.2  Chuẩn bị

Hòa tan lần lượt 10,6 g axit 3,5-dinitrosalixilic (DNS) và 19,8 g natri hiđroxit (NaOH) vào 1416 mL nước (5.1), đun nóng nhẹ ở nhiệt độ không quá 50 °C để hòa tan hoàn toàn các chất. Thêm 306,0 g muối Rochelle (C₄H₄KNaO₆), 7,6 mL phenol (C₆H₆O) và 8,3 g natri metabisulfite (Na₂O₅S₂), lắc kỹ. Để nguội về nhiệt độ phòng, thu được thuốc thử DNS.

Lấy 3 mL dung dịch thuốc thử DNS, chuẩn độ bằng dung dịch HCI 0,1 N với chất chỉ thị là phenolphtalein (C₂₀H₁₄O₄) 1% (5.10). Nếu lượng HCI sử dụng từ 5 mL đến 6 mL trong chuẩn độ dung dịch DNS để dung dịch chuyển từ màu đỏ sang không màu là đạt yêu cầu. Nếu lượng HCI sử dụng nằm ngoài phạm vi trên, cần pha lại dung dịch thuốc thử DNS.

- Cẩn thận khi sử dụng phenol (C₆H₆O).

- Dung dịch thuốc thử axit 3,5 dinitrosalixilic (DNS) cần được lưu giữ trong chai sẫm màu, bọc bằng giấy nhôm; chuẩn bị dung dịch thuốc thử ngay trước khi sử dụng.

5.5  Dung dịch chuẩn gốc glucose, nồng độ 10 mg/mL

Cân 2,0 g glucose khan, cho vào bình định mức dung tích 200 mL (6.2.3). Thêm đệm xitrat, pH 4,8 đến vạch định mức, lắc đều. Dung dịch chuẩn gốc glucose được sử dụng ngay sau khi pha hoặc đậy chặt nắp và giữ trong tủ đông (6.1.12) (dung dịch cần lắc kỹ sau khi rã đông).

5.6  Dung dịch chuẩn làm việc glucose

Chuẩn bị 4 ống eppendorf, dung tích 10,0 mL, đánh số thứ tự từ 1 đến 4. Dùng micropipet hút lần lượt dung dịch chuẩn gốc glucose (5.5) và dung dịch đệm xitrat 0,05 M, pH 4,8 (5.2) vào mỗi ống eppendorf theo Bảng 1.

Bảng 1 - Hướng dẫn pha dung dịch chuẩn làm việc glucose

Tùy theo hàm lượng glucose do vi sinh vật giải phóng ra trong dung dịch mẫu, có thể pha loãng dung dịch mẫu sao cho nồng độ glucose trong mẫu nằm trong khoảng nồng độ dung dịch làm việc glucose.

5.7  Thang chuẩn glucose

5.7.1  Chuẩn bị thang chuẩn glucose

Lấy 0,5 mL dung dịch chuẩn làm việc glucose có các nồng độ glucose lần lượt là 6,7; 5,0; 3,3; 2,0 mg glucose/mL (5.6) cho vào ống nghiệm có nắp chứa 1,0 mL đệm xitrat 0,05 M, pH 4,8. Ủ trong bể cách thủy (6.1.10) ở 50 °C trong 60 min;

Lấy các ống nghiệm ở trên khỏi bể cách thủy (6.1.10), thêm 3 mL dung dịch thuốc thử DNS (5.4) vào mỗi ống nghiệm và trộn đều.

Mẫu trắng: Lấy 0,5 mL nước cất cho vào ống nghiệm chứa 3 mL dung dịch thuốc thử DNS (5.4).

Đun sôi cách thủy trong 5 min, làm lạnh đến nhiệt độ phòng.

5.7.2  Dựng đường chuẩn glucose

Sau 20 min, đo độ hấp thụ quang của thang chuẩn bằng máy quang phổ (6.1.9), ở bước sóng 540 nm. Hiệu chỉnh máy sao cho đường chuẩn có dạng y = ax + b (với R² lớn hơn 0,95);

Lập đồ thị đường chuẩn (hoặc phương trình tương đương) biểu thị tương quan giữa độ hấp thụ (A) và nồng độ C (mg/0,5 mL) của dung dịch chuẩn glucose.

5.8  Dịch pha loãng

Dung dịch pha loãng là nước muối sinh lý (NaCI 0,85 %), vô trùng, pH 7, không chứa các hợp chất glucose;

Lấy 9 mL dịch pha loãng cho vào các ống nghiệm (6.2.5), đậy nút bông và khử trùng ở 121 °C không ít hơn 20 min trong nồi hấp áp lực (6.1.2).

Để tránh làm ảnh hưởng đến các vi sinh vật do thay đổi nhiệt độ đột ngột, điều chỉnh nhiệt độ của dịch pha loãng đến nhiệt độ phòng thử nghiệm trước khi sử dụng.

5.9  Môi trường nuôi cấy

5.9.1  Thành phần

Có thể sử dụng các môi trường có bán sẵn trên thị trường hoặc môi trường có thành phần dưới đây:

5.9.1.1  Môi trường nuôi cấy nấm sợi phân giải xenlulose (môi trường Asparagine)

Xem A.1 Phụ lục A.

5.9.1.2  Môi trường nuôi cấy vi khuẩn phân giải xenlulose (Môi trường Hans)

Xem A.2 Phụ lục A.

5.9.1.3  Môi trường nuôi cấy xạ khuẩn phân giải xenlulose

- Môi trường Ken Knight

Xem A 3.1 Phụ lục A.

- Môi trường Gauze

Xem A 3.2 Phụ lục A.

- Môi trường ISP4

Xem A 3.3 Phụ lục A.

5.9.2  Cách chuẩn bị

Cân và hòa tan lần lượt các hóa chất trong thành phần môi trường (Phụ lục A) vào 800 mL nước cất (5.1). Thêm nước cất (5.1) đến 1000 mL. Kiểm tra pH bằng máy đo pH, điều chỉnh pH bằng natri hidroxit 1 M hoặc axit clohidric 1 N đến pH thích hợp.

5.9.2.1  Môi trường thạch nghiêng

Bổ sung 12 g thạch bột vào môi trường đã chuẩn bị (5.9.2), đun cho tan thạch, phân phối lượng từ 4 mL đến 6 mL môi trường vào các ống nghiệm (6.2.5), đậy nút bông, khử trùng 30 min ở 121 °C trong nồi hấp áp lực (6.1.2), để nguội đến 50 °C, đặt nghiêng ống nghiệm khoảng 45°, để yên cho đông đặc, đợi bề mặt thạch khô tiến hành cấy giống.

5.9.2.2  Môi trường nuôi cấy

Phân phối lượng từ 100 mL đến 120 mL môi trường đã chuẩn bị (5.9.2) vào bình tam giác dung tích 250 mL (6.2.1), đậy nút bông, khử trùng 30 min ở 121 °C trong nồi hấp áp lực (6.1.2), để nguội trước khi sử dụng.

5.10  Dung dịch phenolphtalein 1 %

Cân 0,01 g phenolphtalein, pha trong 10 mL alcol 95 %, khuấy tan. Bảo quản trong chai nhựa hoặc thủy tinh sẫm màu, đậy kín nắp.

6  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường trong phòng thí nghiệm và cụ thể như sau:

6.1  Thiết bị

6.1.1  Tủ cấy vô trùng (Box cấy), vận tốc dòng khí trung bình 0,79 m/s, lưu lượng khí 1204 m³/h, màng lọc ULPA với kích thước hạt từ 0,1 µm đến 0,3 µm.

6.1.2  Nồi hấp áp lực, có thể duy trì ở áp suất 101,3 kPa, nhiệt độ 121 °C.

6.1.3  Tủ sấy, duy trì nhiệt độ 40 °C đến 260 °C.

6.1.4  Tủ ấm, duy trì nhiệt độ từ 20 °C đến 60 °C.

6.1.5  Máy lắc ổn nhiệt, tốc độ đạt 150 r/min, duy trì nhiệt độ từ 40 °C đến 60 °C.

6.1.6  Cân phân tích, có độ chính xác đến 0,001 mg.

6.1.7  Máy trộn Voltex, tốc độ lắc đạt 1000 r/min, quỹ đạo lắc tròn.

6.1.8.  Máy ly tâm, ly tâm được tốc độ từ 5000 r/min đến 6 000, nhiệt độ 4 °C.

6.1.9.  Máy quang phổ, có bước sóng 540 nm.

6.1.10  Bể cách thủy, có thể ổn định ở nhiệt độ 50 °C.

6.1.11  Tủ lạnh, có thể duy trì ở khoảng nhiệt độ từ 4 °C đến 8 °C.

6.1.12  Tủ đông, có thể duy trì ở nhiệt độ -20 °C.

6.1.13  Máy đo pH, có thể đo từ 2 đến 16 pH, độ phân giải 0,01 pH.

6.2  Dụng cụ

6.2.1  Bình tam giác, dung tích 250 mL.

6.2.2  Cốc thủy tinh, dung tích 100; 1000; 2000 mL.

6.2.3  Bình định mức, dung tích 200; 1000 mL.

6.2.4  Ống eppendorf, dung tích 1,0 mL.

6.2.5  Ống nghiệm, kích thước 13 mm x 100 mm.

6.2.6  Ống phancon có nắp, dung tích 25 mL.

6.2.7  Que cấy vòng, đầu que cấy chất liệu volfram.

6.2.8  Pipet (micropipet), từ 50 µl đến 200 µL, từ 200 µL đến 1000 µL.

6.2.9  Ống ly tâm, kích thước 10 mm x 100 mm.

7  Cách tiến hành

7.1  Chuẩn bị

7.1.1  Dụng cụ

Các dụng cụ sử dụng trong nuôi cấy vi sinh vật phải được khử trùng bằng 1 trong 2 cách sau:

- giữ ở nhiệt độ 180 °C không ít hơn 2 h trong tủ sấy (6.1.3) hoặc;

- giữ ở nhiệt độ 121 °C không ít hơn 30 min trong nồi hấp áp lực (6.1.2).

7.1.2  Dịch nuôi cấy vi sinh vật

Chủng giống vi sinh vật được hoạt hóa bằng cách cấy truyền trên ống thạch nghiêng chứa môi trường thạch nghiêng (5.9.2.1) phù hợp với từng nhóm vi sinh vật đã chuẩn bị sẵn. Nuôi cấy trong thời gian từ 1 ngày đến 3 ngày ở nhiệt độ thích hợp với từng giống vi sinh vật cho đến khi vi sinh vật mọc đầy trên bề mặt ống thạch nghiêng. Dùng que cấy vô trùng lấy một vòng sinh khối vi sinh vật đưa vào dịch pha loãng đã chuẩn bị sẵn (5.8), trộn kỹ bằng máy trộn Vortex (6.1.7), thu được dịch huyền phù vi sinh vật;

Dùng micropipet hút 1,0 mL dịch huyền phù vi sinh vật cấy vào bình tam giác (6.2.1) chứa 100 mL môi trường nuôi cấy (5.9.2.2) phù hợp với từng nhóm vi sinh vật đã chuẩn bị sẵn;

Nuôi cấy trên máy lắc (6.1.5), tốc độ 150 r/min trong thời gian từ 3 ngày đến 5 ngày, nhiệt độ từ 28 °C đến 30 °C (mật độ vi sinh vật đạt 10⁸ CFU/ml);

Mỗi mẫu lặp lại không ít hơn 2 lần.

7.2  Xác định hoạt độ xenlulaza

Lấy 0,5 mL dịch nuôi cấy vi sinh vật cho vào ống ly tâm (6.2.9) ly tâm trên máy ly tâm (6.1.8) trong 15 min, với tốc độ từ 5 000 r/min đến 6 000 r/min, nhiệt độ 4 °C; Tách phần dịch trong phía trên bề mặt ống sau khi ly tâm, thu được dịch xenlulaza thô, giữ ở nhiệt độ 4 °C.

Cuộn tròn miếng giấy lọc (5.3), cho vào ống phancon có nắp đã chuẩn bị sẵn (6.2.6);

Thêm 1,0 mL dung dịch đệm xitrat 0,05 M, pH 4,8 (5.2) vào ống nghiệm sao cho dung dịch đệm phải ngập miếng giấy lọc;

Đối với xenlulaza sinh ra trong quá trình nuôi cấy nấm sợi nên sử dụng đệm xitrat 0,05 M với pH 4,8 để tách xenlulaza ra khỏi môi trường nuôi cấy. Tỷ lệ giữa dịch nuôi cấy và đệm là 1:5, khuấy trộn và lắc ở tốc độ 150 r/min trong 1 h; Ly tâm, thu dịch trong;

Chỉ sử dụng các mẫu đang được bảo quản ở nhiệt độ 4 °C;

Trường hợp đặc biệt, theo khuyến cáo của từng chủng vi sinh vật, có thể sử dụng đệm với pH khác để tách enzym xenlulaza. Tuy nhiên cần được ghi rõ trong báo cáo kết quả;

Bổ sung 0,5 mL dịch xenlulaza thô, lắc nhẹ. Ủ trong bể cách thủy (6.1.10) ở 50 °C trong 60 min;

Thêm 3,0 mL dung dịch thuốc thử DNS (5.4), trộn đều, đun sôi cách thủy trong 5 min;

Làm lạnh nhanh, sau đó bổ sung 20 mL nước cất (5.1), trộn đều bằng cách đảo ngược ống nghiệm nhiều lần;

Sau ít nhất 20 min, dung dịch xuất hiện màu lục, tiến hành đo độ hấp thụ trên máy quang phổ (6.1.9), ở bước sóng 540 nm.

Mẫu trắng được thực hiện như cách trên nhưng thay 0,5 mL dịch enzym thô bằng 0,5 mL dung dịch đệm xitrat 0,05 M (5.2). Mẫu trắng được sử dụng để chỉnh mật độ quang về giá trị 0.

Dựa vào đường chuẩn để tính nồng độ đường glucose và nồng độ xenlulaza có trong dung dịch.

- Mẫu trắng, mẫu thử và dung dịch glucose chuẩn làm việc cần được đun sôi cách thủy và làm lạnh cùng một lúc;

- Tất cả các ống nghiệm cần được làm lạnh về nhiệt độ phòng trước khi đo bởi vì độ hấp thu rất nhạy với nhiệt độ;

- Dịch xenlulaza thô ban đầu cần pha loãng đến nồng độ thích hợp đủ để giải phóng 2 mg glucose trong 60 min từ miếng giấy lọc bằng dung dịch đệm xitrat 0,05 M, pH 4,8 (5.2). Nên đo ở ít nhất ở 2 nồng độ liên tiếp. Kết quả đo chỉ dừng lại khi đã xác định được ít nhất 2 nồng độ xenlulaza sau khi pha loãng phù hợp để giải phóng >2mg glucose và

7.3  Tính kết quả

Từ đồ thị của đường chuẩn, xác định được nồng độ xenlulaza thích hợp để giải phóng 2 mg đường glucose trong thời gian 60 min.

Hoạt độ xenlulaza tính theo đơn vị giấy lọc (FPA) được tính theo công thức sau:

Trong đó:

FPA  Hoạt độ xenlulaza, tính bằng đơn vị giấy lọc trên mililit (FPU/mL);

C  Nồng độ xenlulaza thích hợp để giải phóng 2 mg glucose, tính bằng miligram trên mililit (mg/mL);

d  Hệ số pha loãng xenlulaza thích hợp để giải phóng 2 mg glulose;

0,37  Nồng độ xenlulaza giải phóng 2 mg glucose ở điều kiện tiêu chuẩn.

Kết quả phép thử là giá trị trung bình các kết quả của ít nhất hai lần thử được tiến hành song song. Nếu sai lệch giữa các lần thử lớn hơn 5 % so với giá trị trung bình của phép thử thì phải tiến hành lại.

8  Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm ít nhất các thông tin sau:

- Mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

- Phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

- Tất cả các thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, cùng với các chi tiết bất thường nào khác có thể ảnh hưởng đến kết quả;

- Các kết quả thử nghiệm thu được;

- Nếu độ lặp lại được kiểm tra, thì nêu kết quả cuối cùng thu được.

Phụ lục A

(Quy định)

Môi trường nuôi cấy vi sinh vật phân giải xenlulo

A.1  Môi trường nuôi cấy nấm sợi phân giải xenlulo (môi trường Asparagine)

A.2  Môi trường nuôi cấy vi khuẩn phân giải xenlulo (Môi trường Hans)

A.3  Môi trường nuôi cấy xạ khuẩn phân giải xenlulo

A.3.1  Môi trường Ken Knight

A.3.2  Môi trường Gauze

A.3.3  Môi trường ISP4 (Inorganic Salts Starch)

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1]  B. Adney and I. Baker.1996. Measurement of cellulase activities. Laboratory Analytical Procedure. National Renewable Energy Future.

[2]  Ghose. T. K. 1987. Measurement of cellulase activities. Inernational union of pure and applied chemistry.