THỨC ĂN CHĂN NUÔI - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG AMPROLIUM - PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
Animal feeding stuffs - Determination of amprolium content - High performance liquid chromatographic method
Lời nói đầu
TCVN 10812:2015 được xây dựng dựa theo Commission Regulation (EC) No. 152/2009;
TCVN 10812:2015 do Trung tâm Khảo, kiểm nghiệm và kiểm định giống vật nuôi, thức ăn chăn nuôi biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.
THỨC ĂN CHĂN NUÔI - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG AMPROLIUM - PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
Animal feeding stuffs - Determination of amprolium content - High performance liquid chromatographic method
Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng amprolium (1-[(4-amino-2-propylpyrimidin- 5-yl)methyl]-2-methyl-pyridinium chlorid hydrochlorid) trong thức ăn chăn nuôi bằng sắc kýlỏng hiệunăng cao.
Tiêu chuẩn này cũng có thể áp dụng đối với premix.
Phương pháp này có giới hạn phát hiện là 1 mg/kg và giới hạn định lượng là 5 mg/kg.
Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).
TCVN 6952 (ISO 9498) Thức ăn chăn nuôi - Chuẩn bị mẫu thử
Amprolium được chiết ra khỏi mẫu bằng hỗn hợp nước-metanol. Sau khi pha loãng bằng pha động và lọc qua bộ lọc màng, hàm lượng amprolium được xác định bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) trao đổi cation với detector UV.
Chỉ sử dụng các thuốc thử tinh khiết phân tích và nước cất hoặc nước đã loại khoáng hoặc nước có chất lượng tương đương, trừ khi có quy định khác.
4.1.Metanol.
4.2.Axetonitril, loại dùng cho HPLC.
4.3.Nước, loại dùng cho HPLC.
4.4.Dung dịch natri dihydro phosphat, c = 0,1 mol/l.
Hòa tan 13,80 g natri dihydro phosphat ngậm một phân tử nước trong nước (4.3) đựng trong bình địnhmức 1000 ml, thêm nước (4.3) đến vạch và trộn.
4.5.Dung dịch natri perchlorat, c = 1,6 mol/l.
Hòa tan 224,74 g natri perchlorat ngậm một phân tử nước trong nước (4.3) trong bình định mức1000 ml, thêm nước (4.3) đến vạch và trộn.
4.6.Pha động dùng cho HPLC
Trộn axetonitril (4.2), dung dịch natri dihydro phosphat (4.4) và dung dịch natri perchlorat (4.5) với tỷ lệ 450 : 450 :100 (thể tích). Trước khi sử dụng, lọc hỗn hợp này qua bộ lọc màng cỡ lỗ 0,22 μm (5.3) và loại khí dung dịch (ví dụ: cho vào bể siêu âm (5.4) ít nhất 15 min).
CHÚ THÍCH: Nếu mẫu chứa thiamin thì pic thiamin trong phổ đồ xuất hiện ngay trước pic amprolium, khi đó phải tách thiamin. Nếu không thể tách thiamin trên cột (5.1.1) thì thay 50 % phần thể tích axetonitril trong dung môi pha động bằng metanol.
4.7.Chất chuẩn: amprolium [1-[(4-amino-2-propylpyrimidin-5-yl) methyl-2-methyl-pyridinium chlorid hydrochlorid] tinh khiết, ký hiệu: E 750.
4.7.1.Dung dịch chuẩn gốc amprolium, 500 μg/ml
Cân 50 mg amprolium, chính xác đến 0,1 mg, cho vào bình định mức 100 ml, hòa tan trong 80 ml metanol (4.1) và đặt bình vào bể siêu âm (5.4) trong 10 min. Sau khi siêu âm, làm nguội dung dịch đến nhiệt độ phòng, thêm nước đến vạch và trộn. Khi được bảo quản ở nhiệt độ không lớn hơn 4 °C, dung dịch bền trong 1 tháng.
4.7.2.Dung dịch chuẩn trung gian amprolium, 50 μg/ml
Dùng pipet lấy 5,0 ml dung dịch chuẩn gốc (4.7.1) cho vào bình định mức 50 ml, thêm dung môi chiết (4.8) đến vạch và trộn. Khi được bảo quản ở nhiệt độ không lớn hơn 4 °C, dung dịch bền trong 1 tháng.
4.7.3.Dung dịch hiệu chuẩn
Chuyển 0,5 ml, 1,0 ml và 2,0 ml dung dịch chuẩn trung gian (4.7.2) vào một dãy các bình định mức 50 ml. Thêm pha động (4.6) đến vạch và trộn. Các dung dịch này chứa nồng độ amprolium tương ứng 0,5 μg/ml, 1,0 μg/ml và 2,0 μg/ml. Các dung dịch này cần được chuẩn bị mới trước khi sử dụng.
CHÚ THÍCH: Phổ đồ của dung dịch amprolium (nồng độ 0,02 mol/l) trong axit clohydric cho thấy độ hấp thụ cực đại ở các bước sóng 246 nm và 262 nm. Độhấp thụ phải bằng 0,84 ở 246 nm và bằng 0,80 ở 262 nm.
4.8. Dung môi chiết
Hỗn hợp của metanol (4.1) và nước: tỷ lệ 2:1 (thể tích).
Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm và các thiết bị, dụng cụ sau:
5.1.Thiết bị HPLC có hệ thống bơm, thích hợp để bơm các thể tích 100 μl.
5.1.1.Cột sắc kí lỏng, kích thước 125 mm x 4 mm, Nucleosil 10 SA trao đổi cation, cỡ hạt nhồi 5 μm hoặc 10 μm hoặc loại tương đương.
5.1.2.Detector UV, có thể thay đổi bước sóng hoặc detector mảng diot.
5.2.Bộ lọc màng, cỡ lỗ 0,45 μm
5.3.Bộ lọc màng, cỡ lỗ 0,22 μm.
5.4.Bể siêu âm
5.5.Máy lắc cơ học hoặc bộ khuấy từ
5.6.Bình định mức, dung tích 50 ml, 100 ml và 1000 ml.
5.7.Bình nón, dung tích 250 ml và 500 ml.
5.8.Cân, có thể cân được 50 mg, chính xác đến 0,1 mg.
5.9.Cân, có thể cân được 5 g, chính xác đến 0,001 g.
5.10.Cân, có thể cân được 50 g, chính xác đến 0,01 g.
5.11.Cân, có thể cân được 500 g, chính xác đến 0,1 g.
5.12.Pipet, có thể phân phối các thể tích thích hợp.
Mẫu phải đại diện và không bị hư hỏng hoặc bị biến đổi chất lượng trong suốt quátrình vận chuyển và bảo quản.
Tiêu chuẩn này không quy định việc lấy mẫu. Nên lấy mẫu theo TCVN 4325:2007 (ISO 6497:2002) Thức ăn chăn nuôi - Lấy mẫu.
Chuẩn bị mẫu thử theo TCVN 6952 (ISO 6498).
8.1.Yêu cầu chung
8.1.1. Mẫu trắng
Để kiểm tra độ thu hồi (8.1.2), cần phân tích mẫu trắng để chắc chắn rằng không có mặt amprolium hoặc chất gây nhiễu. Mẫu trắng phải cùng loại với mẫu thử nhưng không phát hiện được amprolium hoặc chất gây nhiễu.
8.1.2.Kiểm tra độ thu hồi
Kiểm tra độ thu hồi bằng cách phân tích mẫu trắng được bổ sung một lượng amprolium tương tự lượng dự kiến đó có mặt trong mẫu. Để bổ sung ở mức 100 mg/kg, chuyển 10,0 ml dung dịch chuẩn gốc (4.7.1) vào bình nón 250 ml (5.7) và cho bay hơi dung dịch đến khoảng 0,5 ml. Thêm 50 g mẫu trắng, trộn kỹ và để 10 min, trộn lại vài lần trước khi tiếp tục chiết (8.2).
Nếu không sẵn có mẫu trắng cùng loại với mẫu thử (xem 8.1.1) thì có thể kiểm tra độ thu hồi bằngphương pháp thêm chuẩn. Trong trường hợp này, mẫu phân tích được bổ sung một lượng amprolium tương tự với lượng dự kiến có trong mẫu. Mẫu này được phân tích cùng với mẫu không thêm chuẩn và từkết quả thu được tính độ thu hồi.
8.2.Chiết
8.2.1.Thức ăn chăn nuôi và premix (chứa hàm lượng amprolium < 1 %)
Cân từ 5 g đến 40 g mẫu, chính xác đến 0,01 g, tùy thuộc vào hàm lượng amprolium cho vào bình nón500 ml và thêm 200 ml dung môi chiết (4.8). Đặt bình vào bể siêu âm (5.4) và để 15 min. Lấy bình ra khỏi bể siêu âm và lắc bình trên máy lắc hoặc khuấy bằng máy khuấy từ (5.5) trong 1 h. Pha loãng phần nước của dịch chiết bằng pha động (4.6) đến khi thu được hàm lượng amprolium từ 0,5 μg/mlđến 2 μg/ml và trộn. Lọc khoảng 5 ml đến 10 ml dung dịch đã pha loãng bằng bộ lọc màng (5.2). Tiếp tục xác định bằng HPLC (8.3).
CHÚ THÍCH: Dịch chiết phải được pha loãng bằng dung môi pha động, nếu không thì thời gian lưu của pic amprolium có thể bị thay đổi đáng kể do sự thay đổi nồng độ ion.
8.2.2.Premix (chứa hàm lượng amprolium ³ 1 %)
Cân từ 1 g đến 4 g premix, chính xác đến 0,001 g, tùy thuộc vào hàm lượng amprolium, cho vào bình nón 500 ml và thêm 200 ml dung môi chiết (4.8). Đặt bình vào bể siêu âm (5.4) và để 15 min. Lấy bình ra khỏi bể siêu âm và lắc trên máy lắc hoặc khuấy bằng máy khuấy từ (5.5) trong 1 h. Pha loãng phần nước của dịch chiết bằng pha động (4.6) để thu được hàm lượng amprolium từ 0,5μg/ml đến 2 μg/ml và trộn. Lọc khoảng 5 ml đến 10 ml dung dịch đã pha loãng trên bộ lọc màng(5.2). Tiếp tục xác định bằng HPLC (8.3).
8.3.Xác định bằng HPLC
8.3.1.Thông số
Nên sử dụng các điều kiện sau đây, có thể sử dụng các điều kiện khác nếu cho kết quả tương đương:
- Cột sắc kí lỏng (5.1.1): kích thước 125 mm x 4 mm, Nucleosil 10 SA trao đổi cation, cỡ hạt nhồi 5 μm hoặc 10 μm, hoặc loại tương đương;
- Pha động (4.6): Hỗn hợp của axetonitril (4.2), dung dịch natri dihydro phosphat (4.4) và dung dịch natri perchlorat (4.5), tỷ lệ 450:450:100 (thể tích).
- Tốc độ dòng: 0,7 ml/min đến 1 ml/min;
- Thể tích bơm: 100 μl;
- Bước sóng phát hiện: 264 nm.
Kiểm tra sự ổn định của hệ thống sắc kí bằng cách bơm vài lần dung dịch hiệu chuẩn (4.7.3) có nồng độ 1,0 μg/ml, cho đến khi đạt được chiều cao (diện tích) pic và thời gian lưu ổn định.
8.3.2.Dựng đường chuẩn
Bơm mỗi dung dịch hiệu chuẩn (4.7.3) vài lần và xác định chiều cao (diện tích) pic trung bình đối với mỗi nồng độ. Dựng đường chuẩn bằng cách sử dụng chiều cao (diện tích) pic trung bình trên trục tung và nồng độ tương ứng tính bằng μg/ml trên trục hoành.
8.3.3.Dung dịch mẫu
Bơm vài lần dịch chiết mẫu thu được trong 8.2, sử dụng cùng một thể tích như đã dùng đối với dung dịch hiệu chuẩn và xác định chiều cao (diện tích) trung bình của pic amprolium.
Xác định nồng độ amprolium có trong dung dịch mẫu từ chiều cao (diện tích) pic trung bình có trong dung dịch mẫu, tính bằng microgam trên mililit, sử dụng đường chuẩn (8.3.2).
Tính hàm lượng amprolium trong mẫu, w (mg/kg), theo công thức sau:
Trong đó:
V là thể tích dung môi chiết (4.8), tương ứng với 8.2, tính bằng mililit (trường hợp này là 200 ml);
c là nồng độ amprolium trong dịch chiết mẫu (8.2) tính bằng microgam trên mililit (μg/ml);
m là khối lượng phần mẫu thử (8.2) tính bằng gam (g);
f là hệ số pha loãng theo 8.2.
10.1.Nhậnbiết
Việc nhận biết chất phân tích có thể được khẳng định bằng đồng sắc ký hoặc sử dụng detector mảng diot để so sánh phổ đồ của dịch chiết mẫu (8.2) và của dung dịch hiệu chuẩn (4.7.3) có nồng độ 2,0 μg/ml.
10.1.1.Đồng sắc ký
Bổ sung một thể tích thích hợp dung dịch hiệu chuẩn (4.7.3) vào dịch chiết mẫu (8.2). Lượng amprolium bổ sung phải xấp xỉ lượng amprolium dự kiến tìm thấy trong dịch chiết mẫu.
Chỉ có chiều cao pic amprolium tăng sau khi tính cả lượng bổ sung và độ pha loãng của dịch chiết. Sai khác về chiều rộng pic tại điểm giữa chiều cao phải nằm trong phạm vi ± 10 % chiều rộng gốc của pic amprolium trong dịch chiết mẫu không thêm chuẩn.
10.1.2. Detector mảng diot
Các kết quả được đánh giá theo các tiêu chí sau:
a) tại bước sóng tương ứng với độ hấp thụ cực đại, phổ đồ của mẫu và của chất chuẩn, được ghi lại ở đỉnh cao nhất trên sắc ký đồ, phải giống nhau trong một biên độ được xác định bằng khả năng phân giải của hệ thống detector. Đối với detector mảng diot, biên độ đặc trưng là ± 2 nm;
b) tại bước sóng từ 210 nm đến 320 nm, phổ đồ của mẫu và của chất chuẩn được ghi lại ở đỉnh cao nhất trên sắc kí đồ không được khác với các phần phổ đồ trong khoảng từ 10 % đến 100 % độ hấp thụ tương đối. Tiêu chí này đáp ứng khi có cùng phổ cực đại và độ lệch giữa hai phổ không vượt quá 15 % độ hấp thụ của chất phân tích chuẩn;
c) tại bước sóng từ 210 nm đến 320 nm, phổ đồ của điểm uốn lên, đỉnh cao nhất và điểm uốn xuống của pic chất phân tích không được khác với các phần phổ đồ trong khoảng từ 10 % đến 100 % độ hấp thụ tương đối. Tiêu chí này đáp ứng khi có cùng phổ cực đại và độ lệch giữa hai phổ không vượt quá 15 % độ hấp thụ tương ứng với phổ đồ của đỉnh cao nhất.
Nếu một trong các tiêu chí này không đáp ứng thì không xác nhận được sự có mặtcủa chất phân tích trong mẫu.
11.1.Độ lặp lại
Chênh lệch giữa kết quả của hai phép xác định song song, thực hiện trên cùng một mẫu không được vượt quá:
- 15 % giá trị cao hơn, khi hàm lượng amprolium từ 25 mg/kg đến 500 mg/kg;
- 75 mg/kg, khi hàm lượng amprolium từ 500 mg/kg đến 1000 mg/kg;
- 7,5 % giá trị cao hơn, khi hàm lượng amprolium lớn hơn 1000 mg/kg.
11.2.Độ thu hồi
Đối với các mẫu thức ăn chăn nuôi (mẫu trắng) được thêm chuẩn, độ thu hồi ít nhất là 90 %.
Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:
a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;
b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;
c) phương pháp thử đã dùng, viện dẫn tiêu chuẩn này;
d) mọi điều kiện thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc được coi làtùy chọn, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả;
e) kết quả thử nghiệm thu được hoặc nếu đáp ứng yêu cầu về độ lặp lại thì ghi kết quả cuối cùng thu được.
(Tham khảo)
Kết quả của phép thử nghiệm cộng tác
Một nghiên cứu cộng tác đã được tổ chức thực hiện trên ba mẫu thức ăn gia cầm (mẫu 1 đến mẫu 3), một mẫu khoáng (mẫu 4) và một mẫu premix (mẫu 5).
Kết quả của phép thử nghiệm cộng tác được nêu trong Bảng A.1.
Bảng A.1 - Kết quả của phép thử nghiệm cộng tác
| Mẫu 1 (mẫu trắng) | Mẫu 2 | Mẫu 3 | Mẫu 4 | Mẫu 5 |
Số lượng phòng thử nghiệm | 14 | 14 | 14 | 14 | 15 |
Số lượng kết quả đơn lẻ | 56 | 56 | 56 | 56 | 60 |
Giá trị trung bình [mg/kg] | - | 45,5 | 188 | 5129 | 25140 |
Độ lệch chuẩn lặp lại, sr [mg/kg] | - | 2,26 | 3,57 | 178 | 550 |
Hệ số biến thiên lặp lại,CVr [%] | - | 4,95 | 1,90 | 3,46 | 2,20 |
Độ lệch chuẩn tái lập, sR [mg/kg] | - | 2,95 | 11,8 | 266 | 760 |
Hệ số biến thiên tái lập,CVR [%] | - | 6,47 | 6,27 | 5,19 | 3,00 |
Hàm lượng danh định [mg/kg] | - | 50 | 200 | 5000 | 25000 |