VI SINH VẬT - XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP AXIT 3-INDOL-ACETIC (IAA)
Microorganisms - Determination of indole-3-acetic acid (IAA) synthesis capability
Lời nói đầu
TCVN 10784:2015 do Viện Thổ nhưỡng Nông hóa biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.
VI SINH VẬT - XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP AXIT 3-INDOL- AXETIE (IAA)
Microorganisms - Determination of inclole-3-acetic acid (IAA) synthesis capability
Tiêu chuẩn này quy định phương pháp định tính và định lượng khả năng sinh tổng hợp axit 3-indol- axetic (IAA) của vi sinh vật.
Các tài liệu viện dẫn sau đây là cần thiết để áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).
TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987), Nước dùng cho phân tích trong phòng thí nghiệm - Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử.
Trong tiêu chuẩn này sử dụng các thuật ngữ, định nghĩa sau.
3.1. Axit 3-indol-axetic (lndole-3-acetic acid (IAA))
Một loại hoocmôn thực vật, thuộc nhóm auxin, công thức phân tử là C10H9O2N, khối lượng phân tử tương đối 175, 184.
3.2. Vi sinh vật sinh tổng hợp axit 3-indol-axetic (lndole-3-acetic acid synthesis microorganisms)
Các vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp axit 3-indol-axetic.
4.1.Nguyên tắc định tính
Vi sinh vật dùng để xác định khả năng sinh tổng hợp axit 3-indol-axetic (IAA) là vi sinh vật thuần.
IAA được sinh tổng hợp trong quá trình sinh trưởng của vi sinh vật tiết ra môi trường bao quanh khuẩnlạc/cụm khuẩn lạc. Khi có mặt của thuốc thử Salkowski, dưới tác dụng của tia UV, sẽ xuất hiện vòngmàu đỏ bao quanh khuẩn lạc/cụm khuẩn lạc.
4.2.Nguyên tắc định lượng
Lượng IAA trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật được xác định bằng phương pháp đo độ hấp thụquang (OD) ở bước sóng 530 nm trên máy quang phổ với thuốc thử Salkowski.
5. Thuốc thử, dịch pha loãng và môi trường nuôi cấy
Hóa chất sử dụng để pha các chất chuẩn đạt loại tinh khiết hóa học, hóa chất sử dụng để phân tích đạt loại tinh khiết phân tích.
5.1.Nước cất, đáp ứng các yêu cầu nước loại 3 trong TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987).
5.2.Thuốc thử Salkowski
5.2.1.Thành phần
Sắt (III) clorua (FeCI3) 0,5 M | 15 ml |
|
Axit sunfuric (H2SO4) 98% | 300 ml |
|
Nước cất | 500 ml |
|
5.2.2.Cách chuẩn bị
Đổ từ từ 300 ml dung dịch axit sunfuric 98% vào 500 ml nước cất (không đổ ngược lại). Sau đó dùng pipet hút 15 ml dung dịch sắt (III) clorua 0,5 M bổ sung vào dung dịch trên.
Bảo quản trong chai có màu sẫm và đặt trong tối.
5.3.Dung dịch chuẩn IAA
5.3.1. Dung dịch chuẩn gốc IAA (IAA stock)
Sử dụng axit 3-indol-axetic (IAA) có độ tinh khiết ≥99%, độ ẩm <0,1%.
Cân 10 mg IAA, cho vào bình định mức dung tích 10 ml. Thêm nước cất đến vạch định mức, trộn đều. Dung dịch thu được là dung dịch chuẩn gốc IAA gốc (IAA stock), có nồng độ 1000 µg/ml.
5.3.2. Dung dịch chuẩn làm việc IAA
Chuẩn bị 10 bình định mức dung tích 10 ml, đánh số thứ tự từ 1 đến 10. Dùng pipet lần lượt hút dung dịch chuẩn gốc IAA (IAA stock), có nồng độ 1000 µg/ml (5.3.1) vào các bình định mức theo thể tích ghi trong bảng 1. Thêm nước cất đến vạch định mức, trộn đều.
Bảng 1 - Hướng dẫn pha dung dịch chuẩn làm việc IAA
STT | Nồng độ dung dịch chuẩn làm việc IAA (µg/ml) | Thể tích dung dịch chuẩn gốc IAA (IAA stock) 1000 µg/ml (ml) cho vào mỗi bình định mức dung tích 10 ml |
1 | 00,0 | 0,0 |
2 | 10,0 | 0,1 |
3 | 20,0 | 0,2 |
4 | 30,0 | 0,3 |
5 | 40,0 | 0,4 |
6 | 50,0 | 0,5 |
7 | 60,0 | 0,6 |
8 | 70,0 | 0,7 |
9 | 80,0 | 0,8 |
10 | 90,0 | 0,9 |
5.3.3.Thang chuẩn IAA
Chuẩn bị 10 bình định mức dung tích 10 ml, đánh số thứ tự từ 1 đến 10. Lấy 2 ml dung dịch chuẩn làm việc IAA (5.3.2) có các nồng độ 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 pg/ml cho vào các bình định mức. Thêm thuốc thử Salkowski đã chuẩn bị sẵn (5.2) đến vạch định mức, trộn đều.
CHÚ THÍCH 1: Tùy theo hàm lượng IAA do vi sinh vật tổng hợp được, có thể pha dung dịch chuẩn làm việc và thang chuẩn có nồng độ IAA thấp hơn hoặc cao hơn.
5.3.4.Đường chuẩn IAA
Đo thang chuẩn IAA trên máy quang phổ,ở bước sóng 530 nm, hiệu chỉnh máy sao cho đường chuẩn có dạng y=ax + b (với R2 lớn hơn 0,95);
Lập đồ thị đường chuẩn (hoặc phương trình tương đương) biểu diễn tương quan giữa số đo trên máyvà nồng độ dung dịch chuẩn IAA.
5.4.Dịch pha loãng
Dùng dịch pha loãng là nước muối sinh lý (NaCl 0,85 %), vô trùng, pH = 7, không chứa các hợp chất có axit 3-indol-axetic (IAA);
Lấy 9 ml dịch pha loãng cho vào các ống nghiệm (6.2.5), đậy nút bông và khử trùng ở 121 °C không ít hơn 20 min trong nồi hấp áp lực (6.1.2).
5.5.Môi trường nuôi cấy
5.5.1.Thành phần
Môi trường Luria Bertani có bổ sung L - Tryptophan
Bacto -Trypton | 10,0 g |
|
Cao nấm men | 5,0 g |
|
Natri clorua (NaCl) | 5,0 g |
|
L -Tryptophan (C11H12N2O2) | 1,0g |
|
Nước cất | 1000 ml |
|
pH | 1,0 g |
|
CHÚ THÍCH 2: - pH được điều chỉnh bằng dung dịch NaOH 1N, HCl 1N trước khi khử trùng môi trường
- Nếu môi trường thạch đĩa thì bổ sung 20,0 g thạch
5.5.2.Cách chuẩn bị
Cân và hòa tan các thành phần môi trường trong nước cất theo thứ tự đã cho (5.5.1).
5.5.2.1.Môi trường dịch thể
Phân phối 100 ml môi trường Luria Bertani (5,5.1) vào bình tam giác dung tích 250 ml (6.2.1), đậy nút bông, khử trùng 30 min ở 121 °C trong nồi hấp áp lực (6.1.2).
5.5.2.2.Môi trường thạch đĩa
Phân phối 200 ml môi trường Luria Bertani (5.5.1) vào bình tam giác dung tích 500 ml (6.2.1), đậy nút bông, khử trùng 30 min ở 121 °C trong nồi hấp áp lực (6.1.2), làm nguội đến 50 °C, phân phối lượng từ 20 ml đến 25 ml môi trường vào các đĩa Petri (6.2.4) đã chuẩn bị sẵn (6.4); mọi thao tác tiến hành trong tủ cấy vô trùng (6.1.1).
Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường trong phòng thí nghiệm và cụ thể như sau:
6.1.Thiết bị
6.1.1.Tủ cấy vô trùng (Box cấy), vận tốc dòng khí trung bình 0,79 m/s, lưu lượng khí 1204 m3/h, màng lọc ULPA với kích thước hạt từ 0,1 µm đến 0,3 µm.
6.1.2.Nồi hấp áp lực, áp suất tối thiểu 101,3 kPa, có khả năng duy trì nhiệt độ ở 121 °C.
6.1.3.Tủ sấy, có khả năng duy trì nhiệt độ từ 40 °C đến 260 °C.
6.1.4.Tủ ấm, có khả năng duy trì nhiệt độ từ 20 °C đến 60°C.
6.1.5.Máy lắc ổn nhiệt, tốc độ 150 r/min, có khả năng duy trì nhiệt độ từ 20 °C đến 40 °C.
6.1.6.Cân phân tích, có độ chính xác đến 0,0001 g.
6.1.7.Cân kỹ thuật, có độ chính xác đến 0,01 g.
6.1.8.Máy trộn Vortex, tốc độ 1000 r/min.
6.1.9.Máy ly tâm, tốc độ 6000 r/min.
6.1.10.Máy quang phổ, đo được ở bước sóng 530 nm.
6.1.11.Đèn soi UV, soi được hai bước sóng 254 nm và 366 nm, tấm lọc bước sóng trung tâm: 50 mm x 200 mm.
6.1.12.Mặt nạ chống UV.
6.1.13.Máy đo pH, có độ chính xác đến 0,1 đơn vị pH ở 25 °C.
6.2.Dụng cụ
6.2.1.Bình tam giác, dung tích 250 ml, 500 ml.
6.2.2.Cốc thủy tinh,dung tích 100 ml, 500 ml, 1000 ml.
6.2.3.Bình định mức, dung tích 10 ml.
6.2.4.Đĩa Petri, đường kính 90 mm.
6.2.5.Ống nghiệm, kích thước 18 mm x 180 mm.
6.2.6.Que cấy vòng
6.2.7.Que gạt mẫu (bàn trang)
6.2.8.Kẹp (panh)
6.2.9.Pipet (Micropipet), có thể lấy các thể tích 0,1 ml và 1 ml.
6.3.Mảng thẩm thấu nitrôxenlulô, 100% nitrôxenlulô tinh khiết, kích thước lỗ 0,2 µm 6.4. Chuẩn bị dụng cụ
- Dụng cụ sử dụng trong nuôi cấy vi sinh vật được phải rửa sạch, tiệt trùng bằng một trong các phương pháp dưới đây:
+ Khử trùng khô: Giữ ở nhiệt độ 180 °C không ít hơn 1 h trong tủ sấy (6.1.3) hoặc;
+ Khử trùng ướt: Giữ ở nhiệt độ 121 °C không ít hơn 30 min trong nồi hấp áp lực (6.1.2).
- Dụng cụ sử dụng trong xác định nồng độ IAA phải được rửa sạch, tráng lại bằng nước cất.
7.1.Lấy mẫu
Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Điều quan trọng là mẫu gửi đến phòng thínghiệm phải là đại diện và mẫu không bị hư hỏng hoặc suy giảm chất lượng trong quá trình bảoquản và vận chuyển.
7.2.Chuẩn bị mẫu
Lấy một vòng que cấy sinh khối vi sinh vật cấy vào bình tam giác chứa 100 ml môi trường dịch thể Luria Bertani đã chuẩn bị sẵn (5.5.2.1). Nuôi lắc trong máy lắc ổn nhiệt (6.1.5) ở tốc độ 150 r/min, trong thời gian từ 2 ngày đến 3 ngày, nhiệt độ từ 28 °C đến 30 °C; đảm bảo mật độ tế bào vi sinh vật không nhỏ hơn 108CFU/ml (dung dịch mẫu ban đầu).
8. Định tính khả năng sinh tổng hợp IAA của vi sinh vật
8.1.Cách tiến hành
Dùng pipet đã vô trùng hút 1 ml dung dịch mẫu ban đầu (7.2) cho vào ống nghiệm có chứa 9 ml dung dịch pha loãng đã chuẩn bị sẵn (5.4), tránh chạm pipet vào dịch pha loãng, trộn đều bằng máy trộn Vortex (6.1.8) trong thời gian 1 min để có dung dịch mẫu có nồng độ pha loãng là 10-1. Tiếp tục pha loãng để đạt được độ pha loãng 10-5, 10-6;
Dùng pipet vô trùng hút 0,1 ml dung dịch mẫu pha loãng cấy vào đĩa Petri chứa môi trường thạch đĩa Luria Bertani đã chuẩn bị sẵn (5.5.2.2). Mỗi nồng độ pha loãng được cấy lặp lại không ít hơn 2 đĩa Petri;
Dùng que gạt vô trùng gạt đều cho đến khi dung dịch mẫu thấm đều trên bề mặt thạch, úp ngược đĩa Petri, nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ từ 28 °C đến 30 °C trong thời gian 24 h;
Dùng kẹp vô trùng đặt màng thẩm thấu nitrôxenlulô (6.3) lên trên bề mặt đĩa Petri; giữ nguyên đĩa Petri, tiếp tục nuôi trong tủ ấm (6.1.4) ở nhiệt độ từ 28 °C đến 30 °C trong thời gian từ 24 h đến 48 h;
Dùng kẹp vô trùng nhấc màng thẩm thấu nitrôxenlulô ra khỏi đĩa Petri và ngâm trực tiếp trong thuốc thử Salkowski (5.2) hoặc đặt lên trên một miếng giấy lọc đã được thấm thuốc thử Salkowski (5.2). Thời gian thẩm thấu không ít hơn 30 min;
Sau đó soi màng thẩm thấu nitrôxenlulô dưới đèn UV.
8.2.Khẳng định
Vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp IAA là vi sinh vật tạo được vòng màu đỏ bao quanh khuẩn lạc/cụm khuẩn lạc.
CHÚ THÍCH 3: Các khuẩn lạc tạo được vòng màu hồng nhạt, màu hồng, màu đỏ nhạt, màu đỏ, màu đỏ đậm bao quanh đều được tính là có khả năng sinh tổng hợp IAA.
9. Định lượng khả năng sinh tổng hợp IAA của vi sinh vật
9.1.Cách tiến hành
9.1.1.Mẫu thử
Dùng một pipet vô trùng lấy 1 ml dung dịch mẫu ban đầu (7.2) cho vào bình tam giác chứa 100 ml môi trường dịch thể Luria Bertani đã chuẩn bị sẵn (5.5.2.1). Nuôi lắc ở tốc độ 150 r/min, trong tốihoàn toàn, thời gian từ 3 ngày đến 5 ngày, nhiệt độ từ 28 °C đến 30 °C; đảm bảo mật độ tế bào vi sinh vật không nhỏ hơn 108 CFU/ml (dung dịch mẫu thử). Mỗi mẫu được cấy lặp lại không ít hơn2 lần;
Ly tâm không ít hơn 3 ml dung dịch mẫu thử bằng máy ly tâm (6.1.9) với tốc độ 6000 r/min, trong thời gian 10 min. Lấy 2 ml phần dung dịch trên bề mặt (phần nước trong) cho vào bình định mức dung tích 10 ml. Thêm thuốc thử Salkowski đã chuẩn bị sẵn (5.2) đến vạch định mức, trộn đều;
Giữ yên trong thời gian 25 min. Xác định hàm lượng IAA trong mẫu thử bằng máy quang phổ ở bước sóng 530 nm.
9.1.2.Mẫu trắng
Ly tâm không ít hơn 3 ml môi trường dịch thể Luria Bertani đã chuẩn bị sẵn (5.5.2.1) bằng máy ly tâm (6.1.9) với tốc độ 6000 r/min, trong thời gian 10 min;
Lấy 2 ml phần dung dịch trên bề mặt (phần nước trong) cho vào bình định mức dung tích 10 ml. Thêm thuốc thử Salkowski đã chuẩn bị sẵn (5.2) đến vạch định mức, trộn đều;
Giữ yên trong thời gian 25 min. Xác định hàm lượng IAA trong mẫu trắng bằng máy quang phổ ở bước sóng 530 nm.
CHÚ THÍCH 4: Tiến hành đo dung dịch mẫu thử và mẫu trắng đồng nhất với điều kiện đo dung dịch chuẩn. Sau khi đo khoảng 10 mẫu phải kiểm tra lại thang chuẩn. Nếu sai lệch phải hiệu chỉnh máy, lặp lại đường chuẩn và đo lại mẫu.
9.2.Tính và biểu thị kết quả
Hàm lượng IAA do vi sinh vật sinh tổng hợp được tính theo công thức:
M = a - ao
Trong đó:
M Hàm lượng IAA do vi sinh vật sinh tổng hợp, tính bằng microgam/mililít (µg/ml);
a Hàm lượng IAA sinh tổng hợp được trong 1 ml mẫu thử, tính bằng microgam/mililít (µg/ml);
ao Hàm lượng IAA sinh tổng hợp được trong 1 ml mẫu trắng, tính bằng microgam/mililít (µg/ml).
Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm ít nhất các thông tin sau:
- Mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;
- Phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;
- Tất cả các thao tác không qui định trong tiêu chuẩn này, cùng với các chi tiết bất thường nào khác có thể ảnh hưởng đến kết quả;
- Các kết quả thử nghiệm thu được;
- Nếu độ lặp lại được kiểm tra, thì nêu kết quả cuối cùng thu được.
[1] Bric, J. M., Bostock, R. M. and Silverstone, S. E. 1991. Rapid in situ assay for indol acetic acid production by bacteria immobilized on a nitro celluloso membrane. Appl Environ Microbiol. Feb; 57(2):535-538
[2] Gordon, S. A., and R. P. Weber. 1951. Colorimetric estimation of indoleacetic acid. Plant Physiol. 26:192-195.