TIÊU CHUẨN NGÀNH

10TCN 835 : 2006

THỨC ĂN CHĂN NUÔI -\r\nXÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG MONENSIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Animal\r\nfeeding stuffs - Determination of monensin content by

high - performance liquid chromatographic method

(Ban hành kèm theo Quyết\r\nđịnh số 4099/QĐ/BNN-KHCN ngày       tháng 12 năm 2006 của Bộ trưởng Bộ Nông\r\nnghiệp và Phát triển nông thôn)

1.\r\nPhạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này áp dụng để phân tích hàm lượng kháng sinh\r\nmonensin trong thức ăn chăn nuôi bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao\r\n(HPLC). Giới hạn phát hiện của phương pháp là 40mg/kg.

2. Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau đây rất cần thiết cho việc áp\r\ndụng tiêu chuẩn. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm ban hành thì áp dụng\r\nphiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm ban hành thì áp\r\ndụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi:

TCVN 4851 (ISO 3696). Nước dùng để phân tích trong phòng\r\nthí nghiệm. Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử.

ISO 6497:2002 (E). Animal feeding stuffs - Sampling.

3.\r\nNguyên tắc

Monensin trong mẫu thức ăn chăn nuôi được tách chiết bằng\r\nmetanol, sau đó tạo dẫn xuất bằng 2,4 dinitrophenylhydrazine (DNP) trong môi\r\ntrường axit ở 55^oC, tách và định lượng trên hệ thống sắc ký lỏng\r\nhiệu năng cao với detector UV ở bước sóng 392nm.

4.\r\nThiết bị, dụng cụ

4.1. Máy nghiền mẫu phòng thí nghiệm.

4.2. Sàng phòng thí nghiệm, có kích thước lỗ sàng 1,00 mm\r\nvà 3,00 mm.

4.3. Cân phân tích có độ chính xác 0,0001 g.

4.4. Cân kỹ thuật có độ chính xác 0,01 g.

4.5. Máy ly tâm lạnh có tốc độ 3000 vòng/phút,\r\nsử dụng ống ly tâm dung tích 30 ml.

4.6. ống ly tâm, dung tích 30 ml bằng polypropylen hoặc\r\nbằng thuỷ tinh, có nắp đậy.

4.7. Tủ ấm, có khả năng duy trì nhiệt độ ổn định ở 55^oC\r\n± 1^oC.

4.8. Máy lắc tròn hoặc máy lắc ngang có thể đạt tốc độ\r\n250 vòng/phút.

4.9. ống nghiệm dung tích 10ml có nút xoáy.

4.10. Bình định mức dung tích 10, 100, 1000 ml.

4.11. Pipet tự động điều chỉnh được từ  1ml đến 30 ml.

4.12. Micropipet dung tích từ 10ml đến 100 ml và từ 200ml đến 1000 ml.

4.13. Hút dung môi tự động 2 ml, 10 ml, 20 ml.

4.14. Máy lắc ống nghiệm (Vortex mixer).

4.15. ống đong 1000ml.

4.16. Bể siêu âm.

4.17. Bơm hút chân không.

4.18. Màng lọc syranh có kích thước 0,45 mm.

4.19. Bình nón dung tích 125ml.

4.20. Lọ nhỏ đựng dịch mẫu chuyên dụng cho HPLC, có nắp\r\nvặn PTFE .

4.21. Thiết bị trộn mẫu phòng thí nghiệm loại Hobart\r\nModel C 100 T hoặc tương đương.

4.22. Thiết bị chia mẫu:

Thiết bị chia đôi\r\nhoặc chia tư mẫu: ví dụ như thiết bị chia tư hình nón, thiết bị chia nhiều ngăn\r\ncó hệ thống phân hạt hoặc các thiết bị chia khác đảm bảo phân chia mẫu thí\r\nnghiệm thành mẫu thử đồng nhất.

4.23. Hộp đựng mẫu có\r\nnắp kín.

4.24. Hệ thống HPLC gồm có:

4.24.1. Máy sắc kí lỏng hiệu năng cao, bình chứa dung\r\nmôi, hệ thống bơm mẫu, detector UV đặt được ở bước sóng 392nm, máy ghi hoặc bộ\r\ntích phân.

4.24.2. Cột phân tích HPLC pha đảo có kèm cột bảo vệ

            Chiều dài                         150mm

            Đường kính trong            4,6mm

            Hạt nhồi                           C 18; 5mm hoặc tương đương

5. Hóa chất và thuốc thử

5.1. Hoá chất

Chỉ sử dụng hoá chất được công nhận đạt chất lượng tinh\r\nkhiết phân tích và nước cất cấp hạng 1 theo TCVN 4851 (ISO 3696). Các dung môi\r\nphải đạt chất lượng để dùng cho phân tích HPLC.

5.1.1. Metanol.

5.1.2. Axit acetic (100%).

5.1.3. Acetonitrile

5.1.4. Chất chuẩn monensin, dạng muối natri monensin,\r\nloại tinh khiết, có kèm theo giấy chứng nhận hàm lượng.

5.2. Thuốc thử

5.2.1. Tricloacetic axit (TCA), dung dịch 500mg/ml.

Cân 50g TCA chính xác đến 0,01g cho vào bình định mức\r\n100ml, hòa tan và định mức bằng nước cất. Lắc kỹ dung dịch.

5.2.2. Thuốc thử DNP, dung dịch 1mg/ml trong metanol.

Cân 100mg DNP chính xác đến 1mg vào bình định mức 100ml,\r\nhòa tan và định mức đến vạch bằng metanol. Lắc kỹ dung dịch.

5.2.3. Pha động cho HPLC.

Hỗn hợp metanol: dung dịch axit acetic 1,5% tỉ lệ 90:10\r\ntheo thể tích (v/v).

5.2.3.1. Dung dịch axit acetic 1,5% trong nước, theo tỉ\r\nlệ thể tích (v/v).

Cho 15ml axit acetic (5.1.2) vào bình định mức 1000ml.\r\nThêm nước cất đến vạch định mức. Lắc đều dung dịch.

5.2.3.2. Hỗn hợp pha động.

Cho 900ml metanol vào ống đong dung\r\ntích 1000ml. Thêm tiếp 100ml dung dịch axit acetic 1,5% (5.2.3.1). Sau đó lọc hỗn hợp\r\ndung môi thu được qua phễu hút chân không với màng lọc có kích thước lỗ 0,45 mm, siêu âm đuổi khí ở nhiệt độ thường\r\ntrong 30 phút.

5.2.4. Dung dịch chuẩn

5.2.4.1. Dung dịch chuẩn gốc 1000mg/ml

Tùy theo hàm lượng monensin ghi trong giấy chứng nhận\r\n(5.1.4), cân một lượng nhất định chất chuẩn natri monensin chính xác đến 0,1mg\r\ncho vào bình định mức dung tích 100ml, pha loãng và định mức bằng metanol để\r\nsao cho thu được dung dịch gốc có nồng độ 1000mg/ml. Dung dịch chuẩn gốc được bảo quản trong lọ nâu ở 4⁰C,\r\ncó thể sử dụng được trong vòng 2 tuần.

5.2.4.2. Dung dịch chuẩn làm việc 100mg/ml.

Hút chính xác 10ml dung dịch chuẩn gốc(5.2.4.1) vào bình\r\nđịnh mức 100ml, pha loãng và định mức đến vạch bằng metanol. Lắc đều.

6. Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu

6.1. Lấy mẫu

Phương pháp lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này,\r\nnên lấy mẫu theo ISO 6497:2002. Điều quan trọng là mẫu gửi đến phòng thí nghiệm\r\nphải là mẫu trung thực và có tính đại diện, không bị hư hại hoặc bị biến đổi\r\nthành phần trong quá trình vận chuyển và bảo quản. Khối lượng mẫu phân tích\r\nphải không được ít hơn 500 gam.

6.2. Chuẩn bị mẫu

6.2.1. Mẫu ở dạng bột mịn

Nếu mẫu thí nghiệm ở dạng bột lọt hoàn toàn qua sàng có\r\nkích thước lỗ sàng 1,00 mm thì trộn thật đều mẫu (500 gam) bằng máy trộn phòng\r\nthí nghiệm loại Hobart (hoặc tương đương) trong vòng 10 phút. Sau đó chia hỗn\r\nhợp bằng thiết bị chia đôi hoặc thiết bị chia tư cho đến khi thu được lượng mẫu\r\nthử không dưới 100 gam.

6.2.2. Mẫu có kích thước hạt vừa

6.2.2.1. Nếu mẫu thí nghiệm không lọt hết qua sàng có\r\nkích thước lỗ sàng 1,00 mm nhưng lọt hoàn toàn qua sàng có kích thước lỗ 3,00\r\nmm thì trộn thật đều mẫu (không ít hơn 500 gam)  bằng máy trộn phòng thí nghiệm\r\nloại Hobart (hoặc tương đương) trong vòng 10 phút.

6.2.2.2. Dùng thiết bị chia đôi hoặc thiết bị chia tư mẫu\r\nđã trộn đều (6.2.2.1) cho đến khi thu được lượng mẫu thử không dưới 100 gam.\r\nNghiền lượng mẫu này cẩn thận trong máy\r\nnghiền (4.1) cho dến khi mẫu lọt hoàn toàn qua sàng có kích thước lỗ sàng 1,00\r\nmm.

6.2.3. Mẫu có kích thước hạt to.

6.2.3.1. Nếu mẫu không lọt qua sàng có kích thước lỗ sàng\r\n3,00 mm thì cần nghiền mẫu (không ít hơn 500 gam) trên máy nghiền (4.1) cho đến\r\nkhi mẫu lọt hoàn toàn qua sàng có kích thước lỗ sàng 3,00 mm, sau đó trộn thật\r\nđều mẫu bằng máy trộn phòng thí nghiệm loại Hobart (hoặc tương đương) trong\r\nvòng 10 phút.

6.2.3.2. Dùng thiết bị chia đôi hoặc thiết bị chia tư mẫu\r\nđã trộn đều (6.2.3.1) cho đến khi thu được lượng mẫu thử không dưới 100 gam.\r\nNghiền lượng mẫu này cẩn thận trong máy\r\nnghiền (4.1) cho đến khi mẫu lọt hoàn toàn qua sàng có kích thước lỗ sàng 1,00\r\nmm.

Các mẫu thử được bảo quản trong các lọ đựng mẫu (4.20) ở\r\nđiều kiện nhiệt độ 2 – 25⁰C, nơi khô ráo.

Chú ý: Nên nghiền, trộn mẫu trong các phòng có thông gió,\r\nnên đeo kính, khẩu trang và găng tay bảo vệ.

7. Cách tiến hành

7.1. Đường chuẩn

Hút chính xác lần\r\nlượt 10, 20, 50, 100, 200 và 400ml\r\ntừ dung dịch chuẩn làm việc (100mg/ml)\r\ncho vào ống nghiệm (4.9), pha loãng đến 700ml\r\nbằng metanol và tạo dẫn xuất như các bước tiến hành ở mục 7.2. Các dung dịch\r\ntrên sẽ có nồng độ từ 1mg/ml đến 40mg/ml tương ứng trên đồ thị chuẩn.

7.2. Chiết mẫu và tạo\r\ndẫn xuất

Cân chính xác đến\r\n0,1mg từ 5,0g-10,0g mẫu thử đã được nghiền mịn theo mục 6 (tuỳ theo hàm lượng\r\nkháng sinh có trong mẫu) cho vào bình nón 125ml, thêm tiếp 50ml metanol. Tiến\r\nhành chiết monensin bằng cách lắc trên máy lắc ngang (4.8) trong thời gian 1\r\ngiờ với tốc độ 250vòng /phút. Lấy 10ml phần dịch trong ở phía trên cho vào ống\r\nly tâm (4.6) và ly tâm trong 10 phút ở tốc độ 3000 vòng/phút. Hút 700ml dịch ở phía trên ống ly tâm cho vào\r\nống nghiệm (4.9). Thêm tiếp 100ml\r\ndung dịch TCA (500mg/ml). Lắc ống nghiệm trong 20 giây trên máy lắc (4.8), sau\r\nđó để ống nghiệm ở nhiệt độ phòng trong 10 phút. Thêm tiếp 200ml thuốc thử DNP (1mg/ml) vào ống\r\nnghiệm, và lắc 20 giây trên máy lắc (4.8). Đặt ống nghiệm vào tủ ấm có nhiệt độ\r\nổn định 55^oC (4.7) trong 20 phút. Làm nguội ống nghiệm và dùng 10ml dung dịch này để bơm vào hệ thống\r\nHPLC.

7.3. Chuẩn bị mẫu trắng

Mẫu trắng là mẫu thức ăn chăn nuôi được xác định là không\r\ncó monensin. Mẫu trắng được chuẩn bị tương tự như mẫu thử theo mục 7.2.

7.4. Chuẩn bị mẫu để xác định độ thu hồi

Việc xác định độ thu hồi được chuẩn bị bằng cách cho một\r\nlượng dung dịch chuẩn có nồng độ thích hợp được pha từ dung dịch gốc vào 5g mẫu\r\ntrắng (7.3) để đảm bảo mẫu có hàm lượng monensin nằm trong dãy đồ thị chuẩn,\r\nmẫu được để yên trong 30 phút trước khi tiến hành chiết xuất. Sau đó tiếp tục\r\nquá trình chiết mẫu và tạo dẫn xuất tương tự như đối với mẫu thử theo mục 7.2.

7.5. Phân tích trên HPLC

7.5.1. Điều kiện sắc ký:

            Nhiệt độ cột                                          30^oC

            Detector                                               detector\r\nUV bước sóng 392 nm

Tốc độ dòng                                        1\r\nml/phút

            Thể tích bơm mẫu                                 10\r\nml

7.5.2. Tiến hành

7.5.2.1. Nên sử dụng\r\nbảo vệ cột, việc sử dụng bảo vệ cột không có bất cứ ảnh hưởng nào đến kết quả\r\nphân tích.

7.5.2.2. Cân bằng hệ\r\nthống sắc ký bằng pha động (5.2.3) 30 phút trước khi bơm mẫu.

7.5.2.3. Quy trình\r\nbơm mẫu theo thứ tự như sau: dịch mẫu trắng, các dung dịch chuẩn, dịch mẫu thu\r\nhồi, dịch mẫu thử, các dung dịch chuẩn.

Chú ý: Cần bơm các\r\ndịch chuẩn trước và sau mỗi đợt phân tích, không nên để quá 20 lần bơm mẫu cho\r\nmỗi đợt phân tích. Nếu quá 20 lần thì phải bơm các dung dịch chuẩn thêm lần nữa\r\nvào khoảng giữa đợt bơm mẫu.

7.5.2.4. Xác định\r\ndiện tích pic đối với các dung dịch chuẩn và dung dịch mẫu thử tương ứng

7.5.2.5. Sau khi chạy\r\nmáy phải làm sạch hệ thống HPLC bằng hỗn hợp gồm nước cất : acetonitrile theo\r\ntỷ lệ thể tích 40:60 trong 30 phút đến 1 giờ để loại hết đệm trong hệ thống\r\ntrước khi tắt máy.

8.\r\nTính toán kết quả

8.1. Đường chuẩn

8.1.1. Phải đảm bảo\r\nrằng các diện tích pic của mẫu thử đều nằm trong phạm vi của đường chuẩn. Nếu\r\nmẫu thử nào có diện tích pic vượt quá chiều cao của đường chuẩn ở nồng độ cao\r\nnhất thì sẽ bị loại và phải tiến hành thử lại với sự pha loãng.

8.1.2. Xây dựng đường\r\nchuẩn biểu thị mối quan hệ giữa diện tích pic thu được của dung dịch chuẩn với\r\nnồng độ của monensin  theo quan hệ tuyến tính bậc1:

y= ax + b

Trong đó:                      y\r\nlà diện tích pic

                                    x\r\nlà nồng độ của kháng sinh

                                    a\r\nlà hệ số góc

                                    b\r\nlà hằng số

8.2. Tính toán

8.2.1. Hàm lượng\r\nmonensin có trong mẫu thử được tính toán dựa vào đường chuẩn hồi qui tuyến tính\r\n(8.1.2) theo công thức sau:

Trong đó:          X\r\nlà hàm lượng monensin có trong mẫu thử, tính bằng mg/kg

Y là hiệu số giữa diện tích pic của dịch chiết mẫu thử và\r\ndiện tích pic của mẫu trắng

                        a,\r\nb là các thông số của đường chuẩn y = ax + b

                        V\r\nlà thể tích dịch chiết mẫu (7.2), tính bằng ml

                        m\r\nlà khối lượng mẫu thử, tính bằng gam

8.2.2. Kết quả cuối\r\ncùng là giá trung bình của hai lần phân tích nhắc lại. Trong quá trình tính\r\ntoán luôn phải lấy hai số sau dấu phẩy. Giá trị trung bình được làm tròn đến\r\nmột chữ số thập phân.

8.2.3. Xác định độ\r\nthu hồi (R) tính theo phần trăm theo công thức sau:

Trong đó:

C₁ là hàm\r\nlượng monensin xác định được theo quy trình phân tích (tính bằng mg/kg)

C là hàm lượng\r\nmonensin được nạp thêm vào mẫu (tính bằng mg/kg).

Độ thu hồi được xác\r\nđịnh cho mỗi lần chạy mẫu ít nhất phải đạt 80%.

9.\r\nBáo cáo thử nghiệm

Báo cáo kết quả phải\r\nbao gồm ít nhất các thông tin dưới đây:

- Mọi thông tin cần\r\nthiết để nhận biết mẫu thử.

- Viện dẫn của tiêu\r\nchuẩn này hoặc phương pháp thử.

- Kết quả và đơn vị\r\nbiểu thị kết quả.

- Ngày tháng lấy mẫu\r\nvà kiểu loại lấy mẫu (nếu có).

- Ngày tháng thử\r\nnghiệm.

- Các điểm đặc biệt\r\nquan sát được trong quá trình thử nghiệm.

- Mọi thao tác không\r\nqui định trong tiêu chuẩn này, hoặc được coi là tuỳ chọn, cùng với các chi tiết\r\ncủa sự cố bất kỳ mà có thể ảnh hưởng đến kết quả.