TIÊU CHUẨN NGÀNH

10TCN 834:2006

THỨC ĂN CHĂN NUÔI - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ZINC\r\nBACITRACIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Animal\r\nfeeding stuffs - Determination of Zinc bacitracin content by high - performance liquid\r\nchromatographic method

(Ban hành kèm theo\r\nQuyết định số 4099/QĐ/BNN-KHCN ngày 29 tháng 12 năm 2006 của Bộ trưởng Bộ Nông\r\nnghiệp và Phát triển nông thôn)

1.\r\nPhạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này áp dụng để phân tích hàm lượng kháng sinh\r\nZinc bacitracin (Zn- bacitracin) trong thức ăn chăn nuôi bằng phương pháp sắc\r\nký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Giới hạn phát hiện của phương pháp là 5mg/kg.

2. Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau đây rất cần thiết cho việc áp\r\ndụng tiêu chuẩn. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm ban hành thì áp dụng\r\nphiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm ban hành thì áp\r\ndụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi:

TCVN 4851 (ISO 3696). Nước dùng để phân tích trong phòng\r\nthí nghiệm. Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử.

ISO 6497:2002 (E). Thức ăn chăn nuôi. Lấy mẫu. (Animal\r\nfeeding stuffs - Sampling).

3.\r\nNguyên tắc

Zn-bacitracin trong mẫu thức ăn chăn nuôi được chiết bằng\r\ndung môi axit hóa. Dịch chiết được ly tâm, lọc và phân tích trên hệ thống sắc\r\nký lỏng hiệu năng cao với detector UV ở bước sóng 254nm.

4.\r\nThiết bị, dụng cụ

4.1. Máy nghiền mẫu phòng thí nghiệm.

4.2. Sàng phòng thí nghiệm, có kích thước lỗ sàng 1,00 mm\r\nvà 3,00 mm.

4.3. Cân phân tích có độ chính xác 0,0001 g.

4.4. Cân kỹ thuật có độ chính xác 0,01 g.

4.5. Máy ly tâm lạnh có tốc độ 3000\r\nvòng/phút, sử dụng ống ly tâm dung tích 30 ml.

4.6. ống ly tâm, dung tích 30 ml bằng polypropylen hoặc\r\nbằng thuỷ tinh, có nắp đậy.

4.7. Máy lắc tròn hoặc máy lắc ngang có thể đạt tốc độ\r\n250 vòng/phút.

4.8. Máy đo pH có độ chính xác đến 0,05 đơn vị.

4.9. Bình định mức dung tích 10, 100, 1000 ml.

4.10. Pipet tự động điều chỉnh được từ  1ml đến 10 ml.

4.11. Micropipet dung tích từ 10 ml đến 100 ml và 200ml đến 1000ml.

4.12. Hút dung môi tự động 2 ml, 10 ml, 20 ml.

4.13. Máy lắc ống nghiệm (Vortex mixer).

4.14. ống đong 1000ml.

4.15. Bình nón dung tích 125ml.

4.16. Bể siêu âm.

4.17. Bơm  hút chân không.

4.18. Màng lọc syranh có kích thước 0,45 mm.

4.19. Lọ nhỏ dựng dịch mẫu chuyên dụng cho HPLC, có nắp\r\nvặn PTFE .

4.20. Thiết bị trộn mẫu phòng thí nghiệm loại Hobart\r\nModel C 100 T hoặc tương đương.

4.21. Thiết bị chia mẫu:

Thiết\r\nbị chia đôi hoặc chia tư mẫu: ví dụ như thiết bị chia tư hình nón, thiết bị\r\nchia nhiều ngăn có hệ thống phân hạt hoặc các thiết bị chia khác đảm bảo phân\r\nchia mẫu thí nghiệm thành mẫu thử đồng nhất.

4.22. Hộp đựng mẫu có\r\nnắp kín.

4.23. Hệ thống HPLC gồm có:

4.23.1. Máy sắc kí\r\nlỏng hiệu năng cao, bình chứa dung môi, hệ thống bơm mẫu, detector UV đặt được\r\nở bước sóng 254nm, máy ghi hoặc bộ tích phân.

4.23.2. Cột phân tích HPLC pha đảo có kèm cột bảo vệ

            Chiều dài                         150mm

            Đường kính trong            4,6mm

            Hạt nhồi                           C 18; 5mm hoặc tương đương

5. Hóa chất và thuốc thử

5.1. Hoá chất

Chỉ sử dụng hoá chất được công nhận đạt chất lượng tinh\r\nkhiết phân tích và nước cất cấp hạng 1 theo TCVN 4851 (ISO 3696). Các dung môi\r\nphải đạt chất lượng để dùng cho phân tích HPLC.

5.1.1. Acetonitrile.

5.1.2. Metanol.

5.1.3. Kali dihydrophosphat (KH₂PO₄).

5.1.4. Kali hydrophosphat (K₂HPO₄).

5.1.5. Dinatri ethylen diamin tetraacetic (Na₂EDTA.2H₂O).

5.1.6. Axit\r\nphotphoric (85%).

5.1.7. Chất chuẩn Zn-bacitracin: loại tinh khiết, có kèm\r\ntheo giấy chứng nhận hàm lượng (theo đơn vị hoạt tính, không ít hơn 42 iu\r\nbacitracin/mg) .

5.2. Thuốc thử

5.2.1. Dung dịch đệm phosphat- EDTA- pH 4,5.

Cân 13,6g kali dihydrophosphat và 2,5g dinatri ethylen\r\ndiamin tetraacetic với độ chính xác 0,01mg cho vào bình định mức 1000ml, hòa\r\ntan và định mức đến vạch bằng nước cất. Lắc đều dung dịch.

5.2.2. Dung dịch đệm phosphat- pH 6,0.

Cân 1,5g Kali hydrophosphat và 8,5g kali dihydrophosphat\r\nvới độ chính xác 0,01mg cho vào bình định mức 1000ml, hòa tan và định mức đến\r\nvạch bằng nước cất. Lắc đều dung dịch.

5.2.3. Dung dịch natri hydroxit 0,1mol/l

5.2.4. Các dung môi

5.2.4.1. Chuẩn bị dung môi chiết và các dung môi A, B\r\nbằng cách trộn các hóa chất và thuốc thử theo tỉ lệ phần trăm thể tích (v/v)\r\nnhư bảng 1 sau:

Bảng 1: Tỉ lệ pha các hỗn hợp dung môi

5.2.4.2. Cách pha các dung môi

Lấy một lượng các hóa chất, thuốc thử theo tỉ lệ phần\r\ntrăm thể tích (v/v) như ở bảng 1 cho vào bình định mức 1000ml và thêm nước cất\r\nđến vạch mức. Lắc đều dung dịch.

5.2.5. Pha động

Pha động dùng trong phân tích được\r\nchuẩn bị bằng cách trộn 590ml dung môi B (bảng 1) với 410ml dung môi A vào ống đong\r\n1000ml. Trộn đều và điều chỉnh đến pH 6,8 bằng dung dịch natri hydroxit\r\n0,1mol/l. Nếu cần thiết có thể điều chỉnh thể tích dung môi B để thu được sự\r\nphân giải pic tốt nhất. Sau đó lọc hỗn hợp dung dịch thu được qua phễu hút chân\r\nkhông với màng lọc có kích thước lỗ 0,45 mm,\r\nsiêu âm đuổi khí ở nhiệt độ thường trong 30 phút.

5.2.6. Dung dịch chuẩn

5.2.6.1. Dung dịch chuẩn gốc 1000mg/ml

Tùy theo hàm lượng bacitracin ghi trong giấy chứng nhận\r\n(5.1.7), cân một lượng nhất định chất chuẩn Zn-bacitracin chính xác đến 0,1mg\r\ncho vào bình định mức dung tích 100ml, pha loãng và định mức bằng dung môi\r\nchiết (bảng1) để sao cho thu được dung dịch có nồng độ 1000mg/ml. Dung dịch chuẩn gốc được bảo\r\nquản trong lọ sẫm màu ở 4⁰C, có thể sử dụng được trong vòng 1 tuần.

5.2.6.2. Dãy dung dịch chuẩn phân tích sắc ký: 10, 20, 50\r\nvà 100 mg/ml

Các\r\ndung dịch xây dựng đường chuẩn được chuẩn bị trong ngày bằng cách hút chính xác\r\nlần lượt 100, 200, 500 và 1000ml\r\ndung dịch chuẩn gốc 1000mg/ml (5.2.6.1) cho\r\nvào các bình định mức dung tích 10ml, pha loãng và định mức đến vạch bằng dung\r\nmôi chiết (bảng 1).

Chú ý: Nếu sau khi pha 3 giờ mà chưa sử dụng, cần bảo\r\nquản các dung dịch chuẩn trên ở 4^oC. Nhưng tốt nhất là pha các dung\r\ndịch chuẩn này, sau đó bảo quản trong tủ lạnh ít nhất 30 phút trước khi phân\r\ntích và chỉ đưa ra ngay trước khi chạy sắc kí.

6. Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu

6.1. Lấy mẫu

Phương\r\npháp lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này, nên lấy mẫu theo ISO 6497:\r\n2002. Điều quan trọng là mẫu gửi đến phòng thí nghiệm phải là mẫu trung thực và\r\ncó tính đại diện, không bị hư hại hoặc bị biến đổi thành phần trong quá trình\r\nvận chuyển và bảo quản. Khối lượng mẫu phân tích phải không được ít hơn 500\r\ngam.

6.2. Chuẩn bị mẫu

6.2.1. Mẫu ở dạng bột mịn

Nếu\r\nmẫu thí nghiệm ở dạng bột lọt hoàn toàn qua sàng có kích thước lỗ sàng 1,00 mm\r\nthì trộn thật đều mẫu (500 gam) bằng máy trộn phòng thí nghiệm loại Hobart (hoặc tương đương) trong vòng 10 phút. Sau đó chia hỗn hợp bằng thiết bị chia đôi\r\nhoặc thiết bị chia tư cho đến khi thu được lượng mẫu thử không dưới 100 gam.

6.2.2. Mẫu có kích thước hạt vừa

6.2.2.1. Nếu mẫu thí nghiệm không lọt hết qua sàng có\r\nkích thước lỗ sàng 1,00 mm nhưng lọt hoàn toàn qua sàng có kích thước lỗ 3,00\r\nmm thì trộn thật đều mẫu (không ít hơn 500 gam)  bằng máy trộn phòng thí nghiệm\r\nloại Hobart (hoặc tương đương) trong vòng 10 phút.

6.2.2.2. Dùng thiết bị chia đôi hoặc thiết bị chia tư mẫu\r\nđã trộn đều (6.2.2.1) cho đến khi thu được lượng mẫu thử không dưới 100 gam.\r\nNghiền lượng mẫu này cẩn thận trong máy\r\nnghiền (4.1) cho dến khi mẫu lọt hoàn toàn qua sàng có kích thước lỗ sàng 1,00\r\nmm.

6.2.3. Mẫu có kích thước hạt to.

6.2.3.1. Nếu mẫu không lọt qua sàng có kích thước lỗ sàng\r\n3,00 mm thì cần nghiền mẫu (không ít hơn 500 gam) trên máy nghiền (4.1) cho đến\r\nkhi mẫu lọt hoàn toàn qua sàng có kích thước lỗ sàng 3,00 mm, sau đó trộn thật\r\nđều mẫu bằng máy trộn phòng thí nghiệm loại Hobart (hoặc tương đương) trong\r\nvòng 10 phút.

6.2.3.2. Dùng thiết bị chia đôi hoặc thiết bị chia tư mẫu\r\nđã trộn đều (6.2.3.1) cho đến khi thu được lượng mẫu thử không dưới 100 gam.\r\nNghiền lượng mẫu này cẩn thận trong máy\r\nnghiền (4.1) cho đến khi mẫu lọt hoàn toàn qua sàng có kích thước lỗ sàng 1,00\r\nmm.

Các mẫu thử được bảo quản trong các lọ đựng mẫu (4.19) ở\r\nđiều kiện nhiệt độ 2 - 25⁰C, nơi khô ráo.

Chú ý: Nên nghiền, trộn mẫu trong các phòng có thông gió,\r\nnên đeo kính, khẩu trang và găng tay bảo vệ.

7. Cách tiến hành

7.1. Chiết xuất mẫu

Cân chính xác đến\r\n0,1mg từ 1,0g - 5,0g mẫu thử đã được nghiền mịn theo mục 6 (tuỳ theo hàm lượng\r\nkháng sinh có trong mẫu) cho vào bình nón 125ml, thêm 50ml dung môi chiết (bảng\r\n1). Tiến hành chiết Zn-bacitracin bằng cách lắc trên máy lắc trong thời gian 20\r\nphút ở tốc độ 250 vòng/phút. Lấy 10ml phần dịch chiết chuyển vào ống ly tâm\r\n(4.6) và ly tâm trong 10 phút ở tốc độ 3000 vòng/phút. Thu lấy dịch trong và\r\ncho qua màng lọc 0,45mm vào lọ nhỏ chuyên\r\ndụng cho HPLC (4.19) để phân tích trên hệ thống sắc kí.

Chú ý: Nếu sau khi pha 3 giờ mà chưa sử dụng, cần bảo\r\nquản dịch trong thu được sau khi lọc ở 4^oC. Nhưng tốt nhất nên chiết\r\nmẫu và bảo quản trong tủ lạnh ít nhất 30 phút trước khi phân tích và chỉ đưa ra\r\nngay trước khi chạy sắc kí.

7.2. Chuẩn bị mẫu trắng

Mẫu trắng là mẫu thức ăn chăn nuôi được xác định là không\r\ncó Zn-bacitracin. Mẫu trắng được chuẩn bị tương tự như mẫu thử theo mục 7.1.

7.3. Chuẩn bị mẫu để xác định độ thu hồi

Việc xác định độ thu hồi được chuẩn bị bằng cách cho một\r\nlượng dung dịch chuẩn có nồng độ thích hợp được pha từ dung dịch gốc vào 5g mẫu\r\ntrắng (7.2) để đảm bảo mẫu có hàm lượng Zn-bacitracin nằm trong dãy đồ thị\r\nchuẩn, mẫu được để yên trong 30 phút trước khi tiến hành chiết xuất. Sau đó\r\ntiếp tục quá trình chiết mẫu tương tự như đối với mẫu thử theo mục 7.1.

7.4. Phân tích trên HPLC

7.4.1. Điều kiện sắc ký:

            Nhiệt độ cột                                          nhiệt\r\nđộ phòng

            Detector                                               detector\r\nUV bước sóng 254 nm

Tốc độ dòng                                        1\r\nml/phút

            Thể tích bơm mẫu                                 20\r\nml

7.4.2. Tiến hành

7.4.2.1. Nên sử dụng\r\nbảo vệ cột, việc sử dụng bảo vệ cột không có bất cứ ảnh hưởng nào đến kết quả\r\nphân tích.

7.4.2.2. Cân bằng hệ\r\nthống sắc ký bằng pha động (5.2.5) 30 phút trước khi bơm mẫu.

7.4.2.3. Quy trình\r\nbơm mẫu theo thứ tự như sau: dịch mẫu trắng, các dung dịch chuẩn, dịch mẫu thu\r\nhồi, dịch mẫu thử, các dung dịch chuẩn.

CHÚ Ý: Cần bơm các\r\ndịch chuẩn trước và sau mỗi đợt phân tích, không nên để quá 20 lần bơm mẫu cho\r\nmỗi đợt phân tích. Nếu quá 20 lần thì phải bơm các dung dịch chuẩn thêm lần nữa\r\nvào khoảng giữa đợt bơm mẫu.

7.4.2.4. Xác định\r\nchiều cao tổng cộng của 4 pic tương ứng với thành phần zn- bacitracin của dung\r\ndịch thang chuẩn và của mẫu thử tương ứng.

7.4.2.5. Sau khi chạy\r\nmáy phải làm sạch hệ thống HPLC bằng hỗn hợp gồm nước cất : axetonnitril theo\r\ntỷ lệ thể tích 40:60 trong 30 phút để loại hết đệm trong hệ thống trước khi tắt\r\nmáy.

8.\r\nTính toán kết quả

8.1. Đường chuẩn

8.1.1. Phải đảm bảo\r\nrằng các chiều cao pic của mẫu thử đều nằm trong phạm vi của đường chuẩn. Nếu\r\nmẫu thử nào có chiều cao pic vượt quá chiều cao của đường chuẩn ở nồng độ cao\r\nnhất thì sẽ bị loại và phải tiến hành thử lại với sự pha loãng.

8.1.2.\r\nXây dựng đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa chiều cao pic thu được của dung\r\ndịch chuẩn với nồng độ của Zn-bacitracin theo quan hệ tuyến tính bậc 1:

y\r\n= ax + b

Trong đó:

                        y\r\nlà chiều cao pic

                        x\r\nlà nồng độ của kháng sinh

                        a\r\nlà hệ số góc

                        b\r\nlà hằng số

8.2. Tính toán

8.2.1. Hàm lượng\r\nZn-bacitracin có trong mẫu thử được tính toán dựa vào đường chuẩn hồi qui tuyến\r\ntính (8.1.2) theo công thức sau:

Trong đó:          X\r\nlà hàm lượng Zn-bacitracin có trong mẫu thử, tính bằng mg/kg

Y là hiệu số giữa chiều cao pic của dịch chiết mẫu thử và\r\nchiều cao pic của mẫu trắng

                        a,\r\nb là các thông số của đường chuẩn y = ax + b

                        V\r\nlà thể tích dịch chiết mẫu (7.1), tính bằng ml

                        m\r\nlà khối lượng mẫu thử, tính bằng gam

8.2.2. Kết quả cuối\r\ncùng là giá trung bình của hai lần phân tích nhắc lại. Trong quá trình tính\r\ntoán luôn phải lấy hai số sau dấu phẩy. Giá trị trung bình được làm tròn đến\r\nmột chữ số thập phân.

8.2.3. Xác định độ\r\nthu hồi (R) theo công thức sau:

Trong đó:

C₁\r\nlà hàm lượng Zn-bacitracin xác định được theo quy trình phân tích (tính bằng\r\nmg/kg).

C là hàm\r\nlượng Zn-bacitracin được nạp thêm vào mẫu (tính bằng mg/kg).

Độ thu hồi được xác\r\nđịnh cho mỗi lần chạy mẫu ít nhất phải đạt 80%.

9.\r\nBáo cáo thử nghiệm

Báo cáo kết quả phải\r\nbao gồm ít nhất các thông tin dưới đây:

- Mọi thông tin cần\r\nthiết để nhận biết mẫu thử.

- Viện dẫn của tiêu\r\nchuẩn này hoặc phương pháp thử.

- Kết quả và đơn vị\r\nbiểu thị kết quả.

- Ngày tháng lấy mẫu\r\nvà kiểu loại lấy mẫu (nếu có).

- Ngày tháng thử\r\nnghiệm.

- Các điểm đặc biệt\r\nquan sát được trong quá trình thử nghiệm.

- Mọi thao tác không\r\nqui định trong tiêu chuẩn này, hoặc được coi là tuỳ chọn, cùng với các chi tiết\r\ncủa sự cố bất kỳ mà có thể ảnh hưởng đến kết quả.