THỦY SẢN VÀ SẢN PHẨM THỦY SẢN –
XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG FLORFENICOL BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)
Fish and fishey products – Determination of florfenicol content by high performance liquid chromatographic method (HPLC)
Lời nói đầu
TCVN 8374 : 2010 do Cục Quản lý Chất lượng Nông Lâm sản và Thuỷ sản biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.
TCVN 8374 : 2010
THỦY SẢN VÀ SẢN PHẨM THỦY SẢN –
XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG FLORFENICOL BẰNG PHƯƠNG PHÁP
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)
Fish and fishey products – Determination of florfenicol content by high performance liquid chromatographic method (HPLC)
Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng florfenicol (FF) trong thuỷ sản và sản phẩm thủy sản bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
Giới hạn phát hiện của phương pháp là 0,020 mg/kg.
FF được chiết tách ra từ mẫu thủy sản bằng etyl axetat. Dịch chiết được thổi khô và được làm sạch bằng chiết lỏng - lỏng với n-hexan và dung dịch đệm. Hàm lượng FF có trong dịch được đo trên máy HPLC với đầu dò UV-VIS hoặc DAD ở bước sóng 220 nm. Mẫu có hàm lượng vượt quá ngưỡng dư lượng tối đa cho phép (MRL= 1 mg/kg) được khẳng định lại bằng đầu dò DAD đảm bảo phổ hấp thụ phải đạt cực đại ở bước sóng 225 nm.
Chỉ sử dụng các thuốc thử tinh khiết phân tích và sử dụng nước cất loại dùng cho HPLC, trừ khi có quy định khác.
3.1 FF chuẩn, đã biết độ tinh khiết.
3.2 n-Hexan.
3.3 Etyl axetat.
3.4 Amoni axetat.
3.5 Pha động A: dung dịch đệm amoni axetat, pH 4,8 ± 0,05
Cân 1,54 g amoni axetat (3.4) vào cốc thủy tinh 1 000 ml, hòa tan với khoảng 950 ml nước cất, trộn đều và điều chỉnh đến pH 4,8 ± 0,05 bằng axit axetic, lọc bằng màng lọc nylon, đường kính 45 mm, kích thước lỗ lọc 0,2 µm, siêu âm trong 15 min.
Pha mới dung dịch hàng ngày trước khi sử dụng.
3.6 Pha động B: axetonitril
Cho 1 l axetonitril (loại dùng cho HPLC) vào bình đựng dung môi của máy HPLC, siêu âm trong 15 min. Dung dịch được sử dụng trực tiếp, tránh tác động làm đảo trộn dung môi như chiết rót, đổi bình.
3.7 Hỗn hợp pha động
Hút 25 ml axetonitril và 75 ml dung dịch đệm amoni axetat, pH 4,8 ± 0,05 (3.5) cho vào bình định mức 100 ml, lắc đều.
3.8 Dung dịch chuẩn gốc, nồng độ 1 mg/ml
Cân chính xác 50 mg ± 0,1 mg FF chuẩn (3.1) cho vào bình định mức 50 ml, hòa tan bằng axetonitril, lắc đều đến khi tan hoàn toàn và định mức đến vạch.
Dung dịch này bền trong 1 năm khi được bảo quản ở nhiệt độ không lớn hơn 0 oC.
3.9 Dung dịch chuẩn trung gian, nồng độ 100 µg/ml
Hút 1 ml dung dịch chuẩn gốc 1 mg/ml (3.8) cho vào bình định mức 10 ml, định mức đến vạch bằng axetonitril.
Dung dịch này bền trong 6 tháng khi được bảo quản ở nhiệt độ từ 0 oC đến 8 oC.
3.10 Dung dịch chuẩn trung gian, nồng độ 10 µg/ml
Hút 1 ml dung dịch chuẩn trung gian (3.9) cho vào bình định mức 10 ml, định mức đến vạch bằng axetonitril.
Dung dịch này bền trong 3 tháng khi được bảo quản ở nhiệt độ từ 0 oC đến 8 oC.
3.11 Dung dịch chuẩn làm việc, nồng độ 0; 0,1; 0,5; 1; 2,5 và 5 µg/ml
Hút lần lượt 0 µl, 10 µl, 50 µl, 100 µl, 250 µl, 500 µl dung dịch chuẩn trung gian 100 µg/ml (3.9) vào các bình định mức 10 ml, định mức đến vạch bằng hỗn hợp pha động (3.7).
Pha mới dung dịch chuẩn làm việc trước khi dùng.
Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:
4.1Ống ly tâm nắp xoáy, dung tích 15 ml.
4.2Màng lọc mẫu, bằng nylon, PTFE đường kính 13 mm, kính thước lỗ lọc 0,2 µm.
4.3 Bơm tiêm, dung tích 1 ml.
4.4 Pipet pasteur.
4.5 Lọ đựng mẫu, dung tích 1,5 ml.
4.6 Máy lắc vortex.
4.7 Hệ thống thổi khí nitơ có điều nhiệt.
4.8 Máy ly tâm, tốc độ 4 000 r/min.
4.9 Hệ thống HPLC với đầu dò UV-VIS/DAD, sử dụng bước sóng 220 nm, cột tách pha đảo C8, 5 µm, 150 mm x 4,6 mm.
5.1 Chuẩn bị mẫu
5.1.1 Xử lý mẫu
Tách thịt thuỷ sản từ những vị trí khác nhau của mẫu. Cắt phần mẫu vừa lấy thành từng miếng nhỏ từ 5 cm đến 30 cm. Cho phần mẫu vừa cắt (khoảng 100 g) vào máy xay mẫu, xay đến khi mẫu đồng nhất. Giữ mẫu ở 0 oC đến 18 oC hoặc thấp hơn cho đến khi phân tích.
5.1.2 Chuẩn bị mẫu trắng
Mẫu trắng là mẫu của thủy sản, sản phẩm thủy sản được xác định không chứa FF. Cân 3,0 g ± 0,1 g mẫu đã được xay nhuyễn vào ống ly tâm dung tích 15 ml (4.1).
5.1.3 Chuẩn bị mẫu kiểm soát, nồng độ FF 1 mg/kg
Cân 3,0 g ± 0,1 g mẫu trắng đã xay nhuyễn vào ống ly tâm dung tích 15 ml (4.1). Thêm 0,3 ml dung dịch chuẩn 10 µg/ml (3.10). Để yên 20 min trước khi phân tích.
5.1.4 Chuẩn bị mẫu thử
Cân 3,0 g ± 0,1 g mẫu đã được xay nhuyễn vào ống ly tâm dung tích 15 ml (4.1).
5.2 Xác định
Cho 2 ml nước cất vào các ống ly tâm chứa mẫu trắng (5.1.2), mẫu kiểm soát (5.1.3) và mẫu thử (5.1.4), đậy nắp, lắc đều. Thêm tiếp 6 ml etyl axetat (3.3), lắc khoảng 5 min bằng máy lắc (4.6) sau đó ly tâm 7 min ở tốc độ 4 000 r/min. Hút 4 ml lớp trên cho vào ống ly tâm dung tích 15 ml (4.1) và làm khô dung dịch bằng hệ thống thổi khí nitơ ở nhiệt độ 50 oC. Hoà tan phần cặn bằng 1 ml n-hexan, sau đó cho tiếp 1 ml hỗn hợp pha động (3.7) vào, lắc khoảng 2 min trên máy lắc (4.6), ly tâm 5 min ở tốc độ 4 000 r/min. Hút bỏ lớp n-hexan ở trên, lấy lớp dưới lọc qua màng lọc mẫu (4.2) cho vào lọ dung tích 1,5 ml (4.5) và đem phân tích trên thiết bị HPLC.
5.3 Điều kiện phân tích trên HPLC
thứ tự tiêm: tiêm dãy chuẩn, mẫu trắng, mẫu kiểm soát, mẫu thử.
thể tích tiêm: 100 µl.
tốc độ dòng: 1,0 ml/min
thời gian chạy: 10 min
tỷ lệ pha động: axetonitril : đệm amoni axetat = 25 : 75 (thể tích)
CHÚ THÍCH 1 Cân bằng cột sắc ký với pha động 30 min trước khi tiêm mẫu và chuẩn.
CHÚ THÍCH 2 Sau khi hoàn thành việc chạy mẫu, rửa cột và hệ thống HPLC với pha động nước cất và pha động axetonitril với lưu lượng 1 ml/min theo tỉ lệ 35 : 65 trong 60 min.
6 Tính kết quả
Hàm lượng FF trong mẫu thử, C, được tính bằng miligam trên kilogam sản phẩm (mg/kg) theo công thức:
C = Cxx(V3x V1) / (m x V2)
C = Cxx f
trong đó:
Cx là hàm lượng của FF tính từ đường chuẩn, tính bằng microgam trên mililit (µg/ml);
V1 là thể tích etyl axetat ban đầu cho vào để chiết tách mẫu, tính bằng mililit (ml);
V2 là dung dịch chiết tách mẫu lấy đem làm khô, tính bằng mililit (ml);
V3 là thể tích pha động cho vào để hoà tan cặn, tính bằng mililit (ml);
m là khối lượng mẫu, tính bằng gam (g);
f là hệ số pha loãng mẫu, được xác định theo công thức F = (V3x V1) / (m x V2).
Trong trường hợp này f = 0,5 (ml/g).
7. Độ chụm
7.1 Độ tuyến tính:R2 > 0,99 trong khoảng 0,1 mg/kg đến 5 mg/kg.
7.2 Độ lặp lại:sr = 0,049 mg/kg; CV % = 4,9 %.
7.3 Độ thu hồi
- mẫu tôm thêm chuẩn FF 1 mg/kg: `Rm = 75 %.
- mẫu cá thêm chuẩn FF 1 mg/kg: `Rm = 71 %.
CHÚ THÍCH Có thể dựng đường chuẩn trên nền mẫu trắng để tăng độ thu hồi.
8. Báo cáo thử nghiệm
Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:
- mọi thông tin cần thiết về việc nhận biết đầy đủ mẫu thử;
- phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;
- phương pháp thử đã sử dụng và viện dẫn tiêu chuẩn này;
- mọi thao tác không được quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc những điều được coi là tự chọn, và bất kỳ chi tiết nào có ảnh hưởng đến kết quả;
- kết quả thử nghiệm thu được.
(tham khảo)
A.1 Sắc ký đồ của mẫu trắng
đáp ứng
Thời gian
Hình A.1 – Sắc ký đồ của mẫu trắng (mẫu tôm), thời gian lưu 6,9 min
A.2 Sắc ký đồ của mẫu cá thêm chuẩn FF 1 mg/kg
đáp ứng
Thời gian
Hình A.2 – Sắc ký đồ của mẫu cá thêm chuẩn 1 mg/kg, thời gian lưu 6,875 min
A.3 Sắc ký đồ của mẫu tôm thêm chuẩn FF 1 mg/kg
đáp ứng
Thời gian
Hình A.3 – Sắc ký đồ của mẫu tôm thêm chuẩn 1 mg/kg, thời gian lưu 6,920 min
[1] United States Department of Agriculture Food Safety and Inspection Service, Office of Public Health Science - Determination of Florfenicol by HPLC - CLG-FLOR1.02 – 24/07/2006
[2] United States Department of Agriculture Food Safety and Inspection Service, Office of Public Health Science - Confirmation of Florfenicol by GC/MS CLG-FLOR2.02 – 08/07/2006