Fruit and vegetable products – Determination of benzoic acid and sorbic acid concentrations – High – performance liquid chromatography method
Lời nói đầu
TCVN 8122:2009 hoàn toàn tương đương với ISO 22855:2008;
TCVN 8122:2009 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F10 Rau quả và sản phẩm rau quả biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.
SẢN PHẨM RAU, QUẢ - XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ AXIT BENZOIC VÀ AXIT SORBIC – PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
Fruit and vegetable products – Determination of benzoic acid and sorbic acid concentrations – High - performance liquid chromatography method
Tiêu chuẩn này quy định phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao để xác định nồng độ axit benzoic và axit sorbic trong nước rau, quả.
CHÚ THÍCH Phương pháp này dựa trên phương pháp IFU 63 [2]
Chiết axit benzoic và/hoặc axit sorbic từ phần mẫu thử bằng hỗn hợp dung dịch đệm amoni axetat và metanol, trong môi trường axit.
Nồng độ của axit benzoic và/hoặc axit sorbic được xác định bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) dùng cột pha đảo và detector cực tím (UV).
Chỉ sử dụng các thuốc thử loại tinh khiết phân tích và nước dùng cho HPLC, trừ khi có qui định khác.
3.1. Axit axetic (CH3COOH), băng.
3.2. Metanol (CH3OH), dùng cho HPLC.
3.3. Amoni axetat (CH3COONH4), dung dịch 0,01 mol/l.
Hòa tan 0,771 g amoni axetat trong 1 l nước.
3.4. Amoni axetat/axit axetic (CH3COONH4/CH3COOH), dung dịch đệm.
Trộn 1 000 phần thể tích dung dịch amoni axetat (3.3) và 1,2 phần thể tích axit axetic (3.1).
3.5. Axit benzoic (C6H5COOH), dung dịch gốc
Hòa tan axit benzoic trong 40 ml metanol (3.2) và pha loãng bằng nước đến vạch trong bình định mức 100 ml để thu được dung dịch gốc [(C6H5COOH) = 100 mg/ml].
3.6. Axit sorbic [CH3(CH:CH)2COOH], dung dịch gốc
Hòa tan axit sorbic trong 40 ml metanol (3.2) và pha loãng bằng nước đến vạch trong bình định mức 100 ml để thu được dung dịch gốc, p[CH3(CH:CH)2COOH] = 100 mg/ml].
3.7. Kali hexaxyanoferat (II), ngậm ba phân tử nước, K4[Fe(CN)6].3H2O.
3.8. Kẽm sulfat, ngậm bảy phân tử nước, (ZnSO4.7H2O), dung dịch 300 g/l.
3.9. Dung dịch chiết
Trộn 60 phần thể tích dung dịch đệm amoni axetat/axit axetic (3.4) với 40 phẩn thể tích metanol (3.2).
3.10. Dung môi dùng cho HPLC
Trộn 50 phần thể tích dung dịch amoni axetat (3.4) với 40 phần thể tích metanol dùng cho HPLC (3.2) và điều chỉnh đến pH 4,5 đến 4,6 bằng axit axetic (3.1). Lọc dung môi qua màng lọc (4.2).
3.11. Dung dịch Carrez I
Hòa tan 150 g kali hexaxyanoferat (II) (3.7) trong nước đựng trong bình định mức 1 000 ml. Pha loãng bằng nước đến vạch và trộn.
3.12. Dung dịch Carrez II
Hòa tan 300 g kẽm sulfat (3.8) trong nước đựng trong bình định mức 100 ml. Pha loãng bằng nước đến vạch và trộn.
3.13. Giấy lọc gấp nếp, cứng.
Sử dụng các thiết bị dụng cụ phòng thử nghiệm và cụ thể như sau:
4.1. Bể siêu âm
4.2. Màng lọc, có cỡ lỗ 0,45 , dùng cho dung dịch lỏng (ví dụ xenlulo axetat); đường kính phụ thuộc vào giá lọc.
4.3. Giá lọc, để giữ màng lọc có bình hút và bình thu nhận thích hợp.
4.4. Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao, có gắn detector UV (có bước sóng biến thiên) và thiết bị đọc và/hoặc máy tích phân hoặc máy tính có cài sẵn chương trình tích phân thích hợp.
4.5. Cột tách pha đảo, ví dụ: pha đảo C8, 250 mm x 4,6 mm, cỡ hạt là 5.
Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải đúng là mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc biến đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.
6.1. Chuẩn bị dung dịch thử
Đồng hóa mẫu thử hoặc trộn kỹ mẫu thử.
Đối với nước rau, quả cô đặc thì cần pha loãng đến nồng độ ban đầu.
6.1.1. Mẫu dạng trong
Pha loãng 5,00 ml đến 10,00 ml mẫu (V1) trong khoảng 75 ml dung dịch chiết (3.9) trong bình định mức 100 ml. Đặt bình trong bể siêu âm (4.1), trộn dung dịch trong ít nhất 10 min và sau đó pha loãng đến vạch bằng dung dịch chiết (3.9) ở 20 oC. Lọc dung dịch qua màng lọc (4.2).
6.1.2. Mẫu dạng đục
Pha loãng 5,00 ml đến 10,00 ml mẫu (V1) trong khoảng 75 ml dung dịch chiết (3.9) trong bình định mức 100 ml. Đặt bình trong bể siêu âm (4.1), trộn dung dịch trong ít nhất 10 min. Sau đó thêm 1,0 ml dung dịch Carrez I (3.11) và 1,0 ml dung dịch Carrez II (3.12). Trộn kỹ dung dịch sau mỗi lần thêm và pha loãng đến vạch bằng dung dịch đệm (3.9) ở 20 oC. Lọc dung dịch qua giấy lọc (3.13), loại vài mililít dịch lọc đầu tiên. Lọc dung dịch qua màng lọc (4.2).
6.2. Dựng đường chuẩn
Pha loãng dung dịch gốc axit benzoic (3.5) và/hoặc dung dịch gốc axit sorbic (3.6) bằng dung dịch chiết (3.9) ở 20 oC để thu được các dung dịch chuẩn I, II và III với nồng độ axit benzoic và/hoặc axit sorbic tương ứng là 10 mg/l, 25 mg/l và 50 mg/l.
Bơm 10 của mỗi dung dịch hiệu chuẩn vào thiết bị sắc ký (4.4), trong các điều kiện sau:
- tốc độ dòng: khoảng 1,2 ml/min;
- bước sóng phát hiện UV: 235 nm (0,08 AUFS-thang chia độ đơn vị hấp thụ).
Dựng đường chuẩn bằng cách vẽ diện tích pic dựa theo nồng độ axit benzoic và/hoặc axit sorbic, tính bằng miligam trên lít.
6.3. Xác định
Bơm 10 dung dịch thử (6.1) vào thiết bị sắc ký, sử dụng cùng điều kiện như trong khi dựng đường chuẩn.
Nhận diện các pic axit benzoic và/hoặc axit sorbic của dung dịch thử bằng cách so sánh với các pic của dung dịch hiệu chuẩn.
CHÚ THÍCH 1 Cần thay đổi một chút thành phần của dung môi để tách tối đa axit benzoic và/hoặc axit sorbic.
CHÚ THÍCH 2 Dưới các điều kiện mô tả trong tiêu chuẩn này, cũng có thể xác định được các este chứa gốc metyl, etyl và propyleste của axit 4-hydroxybenzoic (xem sắc đồ trong Phụ lục A).
CHÚ THÍCH 3 Các pic nền có thể làm nhiễu khi phân tích axit benzoic trong nước cam. Trong trường hợp đó cần có bước làm sạch thích hợp.
CHÚ THÍCH 4 Nhận diện axit benzoic và axit sorbic có trong mẫu bằng cách so sánh với thời gian lưu của các dung dịch chuẩn. Có thể nhận biết các axit trên bằng cách sử dụng phương pháp nhận biết khác như: bổ sung các chất riêng lẻ, quan sát phổ hấp thụ ở bước sóng yêu cầu và đo độ hấp thụ ở các bước sóng khác nhau.
CHÚ THÍCH 5 Tiến hành định lượng bằng phương pháp ngoại chuẩn với sự tích hợp của diện tích pic hoặc đo chiều cao pic. Cần kiểm tra sự tuyến tính của hàm hiệu chuẩn, ví dụ với các dung dịch chuẩn I, II, và III.
Xác định trực tiếp nồng độ axit benzoic và/hoặc axit sorbic trong dung dịch thử từ đường chuẩn (6.2). Tính nồng độ axit benzoic trong mẫu, pA, tính bằng miligam trên lít, theo công thức sau (phương pháp ngoại chuẩn):
pA =
trong đó:
A1là diện tích pic hoặc chiều cao pic của axit benzoic hoặc axit sorbic trong mẫu thử, biểu thị theo diện tích hoặc chiều cao tính được tương ứng;
A2là diện tích pic hoặc chiều cao pic của axit benzoic hoặc axit sorbic trong dung dịch thử chuẩn, biểu thị theo diện tích hoặc chiều cao tính được tương ứng;
pst là nồng độ của dung dịch chuẩn, tính bằng miligam trên lít (mg/l);
V1là thể tích của dung dịch mẫu thử, tính bằng mililít (ml).
Kết quả được biểu thị bằng miligam trên lít đến một chữ số thập phân.
Độ chụm của phương pháp được thiết lập bởi phép thử liên phòng thử nghiệm do Ủy ban phân tích của Hiệp hội Quả Quốc tế (IFU) tổ chức. Trong phép thử này, tiến hành kiểm tra mẫu nước cam và nước nho. Viện Max von Pettenkofer của Bộ Y tế Cộng hòa liên bang Đức đã tiến hành xử lý thống kê. Xem tóm tắt kết quả thống kê của phép thử này trong Phụ lục B.
Các thông số thống kê được biểu thị phù hợp với TCVN 6910-2 (ISO 5725-2)[1].
8.1. Độ lặp lại
Axit benzoic
Nước cam | r = 3,5 | sr = 1,25 |
Nước nho | r = 3,5 | sr = 1,25 |
Axit sorbic
Nước cam | r = 2,8 | sr = 1,00 |
Nước nho | r = 2,3 | sr = 0,88 |
Este axit metyl-4-hydroxybenzoic
Nước cam | r = 4,5 | sr = 1,60 |
Nước nho | r = 3,8 | sr = 1,37 |
Este axit etyl-4-hydroxybenzoic
Nước cam | r = 4,5 | sr = 1,59 |
Nước nho | r = 4,8 | sr = 1,70 |
Este axit propyl-4-hydroxybenzoic
Nước cam | r = 5,3 | sr = 1,88 |
Nước nho | r = 5,4 | sr = 1,93 |
trong đó:
r là giới hạn lặp lại;
sr độ lệch chuẩn lặp lại.
8.2. Độ tái lập
Axit benzoic
Nước cam | R = 13,9 | sR = 4,96 |
Nước nho | R = 8,9 | sR = 3,18 |
Axit sorbic
Nước cam | R = 11,0 | sR = 3,93 |
Nước nho | R = 7,3 | sR = 2,61 |
Este axit metyl-4-hydroxybenzoic
Nước cam | R = 19,0 | sR = 6,79 |
Nước nho | R = 11,7 | sR = 4,17 |
Este axit etyl-4-hydroxybenzoic
Nước cam | R = 9,8 | sR = 3,5 |
Nước nho | R = 8,8 | sR = 3,14 |
Este axit propyl-4-hydroxybenzoic
Nước cam | R = 16,8 | sR = 6,00 |
Nước nho | R = 17,7 | sR = 6,32 |
trong đó:
R là giới hạn tái lập;
sR độ lệch chuẩn tái lập.
Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:
a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;
b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;
c) phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;
d) mọi chi tiết thao tác không được quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc những điều được coi là tùy ý cũng như bất kỳ sực cố nào có thể ảnh hưởng đến kết quả thử;
e) kết quả thử thu được, hoặc nếu thỏa mãn yêu cầu về độ lặp lại thì nêu kết quả cuối cùng thu được.
(tham khảo)
Cột | Đường kính 4,6 mm, chiều cao 250 mm | |
| Ultrasphere-octyl (RP 8), cỡ hạt 5 | |
Dung môi | Dung dịch amoni axetat/metanol loại dùng cho HPLC (các phần cột 50+40) + axit axetic (pH = 4,5) | |
Tốc độ dòng | 1,2ml/min | |
Phát hiện UV | 235 nm (0,08 AUFS) | |
Tốc độ đọc | 3 mm/min | |
Thể tích bơm | 10 | |
Các chất chuẩn | 1. Axit benzoic | (RT; 8,13)a |
| 2. Axit sorbic | (RT: 9,33) |
| 3. Este axit metyl-4-hydroxybenzoic | (RT: 10,86) |
| 4. Este axit etyl-4-hydroxybenzoic | (RT: 20,34) |
| 5.Este axit propyl-4-hydroxybenzoic | (RT: 42,36) |
a RT = Thời gian lưu, min
b Bơm
p(chuẩn) = 25 mg/l trong từng trường hợp.
Hình A.1 – Dung dịch chuẩn II (6.2) tách trong HPLC
(Tham khảo)
KẾT QUẢ THỐNG KÊ CỦA PHÉP THỬ LIÊN PHÒNG THỬ NGHIỆM
Bảng B.1 – Axit benzoic
Thông số | Mẫu | |
Nước cam | Nước nho | |
Nồng độ axit benzoic trung bình (mg/l) | 72,8 | 57,0 |
Độ lệch chuẩn lặp lại, sr (mg/l) | 1,25 | 1,25 |
Hệ số biến thiên lặp lại CVr (%) | 1,71 | 2,19 |
Giới hạn lặp lại r = 2,8 x sr (mg/l) | 3,5 | 3,5 |
Độ lệch chuẩn tái lập sR (mg/l) | 4,96 | 3,18 |
Hệ số biến thiên tái lập CVR (%) | 6,81 | 5,57 |
Giới hạn tái lập R = 2,8 x sR (mg/l) | 13,9 | 8,9 |
Bảng B.2 – Axit sorbic
Thông số | Mẫu | |
Nước cam | Nước nho | |
Nồng độ axit sorbic trung bình (mg/l) | 91,1 | 65,7 |
Độ lệch chuẩn lặp lại, sr (mg/l) | 1,0 | 0,88 |
Hệ số biến thiên lặp lại CVr (%) | 1,10 | 1,34 |
Giới hạn lặp lại r = 2,8 x sr (mg/l) | 2,8 | 2,3 |
Độ lệch chuẩn tái lập sR (mg/l) | 6,79 | 2,61 |
Hệ số biến thiên tái lập CVR (%) | 7,45 | 3,97 |
Giới hạn tái lập R = 2,8 x sR (mg/l) | 11,0 | 7,3 |
Bảng B.3 – Este axit metyl-4-hydroxybenzoic
Thông số | Mẫu | |
Nước cam | Nước nho | |
Nồng độ este axit metyl-4-hydroxybenzoic trung bình (mg/l) | 83,4 | 75,5 |
Độ lệch chuẩn lặp lại, sr (mg/l) | 1,60 | 1,37 |
Hệ số biến thiên lặp lại CVr (%) | 1,92 | 1,81 |
Giới hạn lặp lại r = 2,8 x sr (mg/l) | 4,5 | 3,8 |
Độ lệch chuẩn tái lập sR (mg/l) | 6,79 | 4,17 |
Hệ số biến thiên tái lập CVR (%) | 8,141 | 5,52 |
Giới hạn tái lập R = 2,8 x sR (mg/l) | 19,0 | 11,7 |
Bảng B.4 – Este axit etyl-4-hydroxybenzoic
Thông số | Mẫu | |
Nước cam | Nước nho | |
Nồng độ este axit etyl-4-hydroxybenzoic trung bình (mg/l) | 57,4 | 81,5 |
Độ lệch chuẩn lặp lại, sr (mg/l) | 1,59 | 1,70 |
Hệ số biến thiên lặp lại CVr (%) | 2,77 | 2,09 |
Giới hạn lặp lại r = 2,8 x sr (mg/l) | 4,5 | 4,8 |
Độ lệch chuẩn tái lập sR (mg/l) | 3,5 | 3,14 |
Hệ số biến thiên tái lập CVR (%) | 6,10 | 3,85 |
Giới hạn tái lập R = 2,8 x sR (mg/l) | 9,8 | 8,8 |
Bảng B.4 – Este axit propyl-4-hydroxybenzoic
Thông số | Mẫu | |
Nước cam | Nước nho | |
Nồng độ este axit propyl-4-hydroxybenzoic trung bình (mg/l) | 51,0 | 87,6 |
Độ lệch chuẩn lặp lại, sr (mg/l) | 1,88 | 1,93 |
Hệ số biến thiên lặp lại CVr (%) | 3,69 | 2,20 |
Giới hạn lặp lại r = 2,8 x sr (mg/l) | 5,3 | 5,4 |
Độ lệch chuẩn tái lập sR (mg/l) | 6,00 | 6,32 |
Hệ số biến thiên tái lập CVR (%) | 11,76 | 7,21 |
Giới hạn tái lập R = 2,8 x sR (mg/l) | 16,8 | 17,7 |
[1] TCVN 6910-2:2001 (ISO 5725-2:1994) Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo. Phần 2: Phương pháp cơ bản xác định độ lặp lại và độ tái lập của phương pháp đo tiêu chuẩn.
[2] Phương pháp IFU 63:1995, Preservatives (HPLC). International Federation of Fruit Juice Producers.