ISO 3594 : 1976
CHẤT BÉO SỮA – PHÁT HIỆN CHẤT BÉO THỰC VẬT BẰNG PHÂN TÍCH STEROL TRÊN SẮC KÝ KHÍ (PHƯƠNG PHÁP CHUẨN)
Milk fat – Detection of vegetable fat by gas – liquid chromatography of sterols (Reference method)
Lời nói đầu
TCVN 6840 : 2001 hoàn toàn tương đương với ISO 3594 : 1976;
TCVN 6840 : 2001 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn TCVN/TC/F12 Sữa và sản phẩm sữa biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học, Công nghệ và Môi trường ban hành.
CHẤT BÉO SỮA – PHÁT HIỆN CHẤT BÉO THỰC VẬT BẰNG PHÂN TÍCH STEROL TRÊN SẮC KÝ KHÍ (PHƯƠNG PHÁP CHUẨN)
Milk fat – Detection of vegetable fat by gas – liquid chromatography of sterols (Reference method)
1. Phạm vi và lĩnh vực áp dụng
Tiêu chuẩn này quy định phương pháp chuẩn để phát hiện chất béo thực vật chứa b-sistosterol có trong chất béo sữa bằng phân tích trên sắc ký khí. Giới hạn phát hiện phụ thuộc vào hàm lượng b- sistosterol của chất béo thực vật được thêm vào.
TCVN 6400 : 1998 (ISO 707) Sữa và sản phẩm sữa – Lấy mẫu.
ISO 3595 Chất béo sữa – Phát hiện chất béo thực vật bằng phép thử axetat phytosteryl.
Chuẩn bị digitonit sterol như quy định trong ISO 3595 và hòa tan trong hỗn hợp của focmamit và dimetylfocmamit. Dùng pentan chiết sterol giải phóng. Tách sterol bằng sắc ký khí.
Nếu trên sắc đồ có pic với thời gian lưu b-sictosterol, có nghĩa là trong mẫu có mặt chất béo thực vật. Các pic của những phytosterol khác có thể khẳng định thêm cho kết luận này.
Tất cả các thuốc thử phải là loại tinh khiết phân tích.
4.1. Hỗn hợp của focmamit và dimetylfocmamit, với các thể tích bằng nhau.
4.2. n-Pentan.
4.3. Nhồi cột: nạp từ 2% đến 4% cao su gồm metyl silicon, ổn định ở nhiệt độ ít nhất 300 oC lên diatomit nung chảy, đã rửa axit và silan hóa, có cỡ mesh 80/100 (từ 175 mm đến 150 mm) hoặc 100/120 (từ 150 mm đến 125 mm).
4.4. Dung dịch thử độ nhạy: 1 mg sterol của chất béo sữa mới được chuẩn bị từ chất béo sữa (xem 7.2) trong 1 ml n-pentan.
4.5. Dung dịch thử độ phân giải pic: 0,9 mg sterol của dầu hạt cải và 0,1 mg sterol của chất béo sữa trong 1 mg n-pentan, các sterol này đều mới được chuẩn bị tương ứng từ dầu hạt cải và từ chất béo sữa (xem 7.2).
4.6. Dung dịch thử đối chứng: 1 mg sterol của dầu đậu tương, mới được chuẩn bị từ dầu đậu tương (xem 7.2) trong 1 ml n-pentan.
4.7. Khí mang: nitơ.
4.8. Hidro.
4.9. Oxi hoặc không khí.
Sử dụng thiết bị, dụng cụ phòng thí nghiệm thông thường và:
5.1. Sắc ký khí, được gắn với detector ion hóa ngọn lửa hidro, hệ thống bơm bằng bạc hoặc thủy tinh, hoặc dụng cụ bơm trực tiếp lên cột và máy ghi.
5.2. Cột sắc ký khí, bằng thủy tinh, hình chữ U hoặc uốn khúc, dài từ 100 cm đến 200 cm, đường kính trong từ 2 mm đến 4 mm.
Chú thích – Không nên sử dụng cột bằng thép không gỉ vì có một số loại có thể làm cho kết quả bị sai do sterol bị giảm chất lượng.
5.3. Microxilanh, có thể lấy được 5 ml hoặc 10 ml.
Lấy mẫu theo TCVN 6400 : 1998 (ISO 707).
7.1. Chuẩn bị mẫu thử
Xem ISO 3595.
7.2. Chuẩn bị sterol
Hòa tan khoảng 10 mg sterol digitonit đã được chuẩn bị theo ISO 3595 trong 0,5 ml hỗn hợp focmamit và dimetylfocmamit (4.1) đựng trong một ống nghiệm nhỏ, nếu cần thì đun nóng nhẹ. Thêm 2,5 ml n-pentan (4.2) vào dung dịch đã nguội, đậy nắp ống nghiệm và lắc. Để tách lớp và sử dụng lớp pentan trong suốt nổi ở trên có chứa sterol được giải phóng, dùng để phân tích sắc ký khí. Dung dịch này chứa khoảng 1 mg sterol trên mililit.
7.3. Các điều kiện chạy sắc ký khí
Nhiệt độ cột: 220 oC đến 250 oC
Nhiệt độ hệ thống bơm mẫu, nếu có thể nên làm nóng riêng rẽ: cao hơn nhiệt độ cột từ 20oC đến 40oC.
Tốc độ dòng nitơ: từ 30 ml/min đến 60 ml/min.
Tháo đầu cột phía detector và vận hành các cột mới dưới các điều kiện này trong 16 h đến 24 h để đạt được sự cân bằng. Nối detector, đốt ngọn lửa và điều chỉnh tốc độ của dòng hidro và dòng oxit hoặc của không khí sao cho thu được độ cao thích hợp của ngọn lửa và đạt được độ nhạy thích hợp của detector. Mở máy tự ghi đặt tốc độ ghi đồ thị thích hợp và xoay núm chỉnh về vị trí zero. Nếu đường nền đã ổn định thì thiết bị đã sẵn sàng để sử dụng.
7.4. Thử độ nhạy
Bơm từ 3 ml đến 5 ml dung dịch thử độ nhạy (4.4). Chỉ có một pic của cholesterol xuất hiện rõ trên sắc đồ. Điều chỉnh núm giảm sao để có được độ chênh lệch tự nhiên trên toàn thang đo của máy ghi (xem hình 1).
7.5. Thử độ phân giải pic
Bơm từ 3 ml đến 5 ml dung dịch thử độ phân giải pic (4.5). Các pic của cholesterol, brassicasterol, campesterol và stigmasterol sẽ xuất hiện trên sắc đồ (xem hình 2). Đo khoảng cách lưu (khoảng cách từ thời điểm bơm mẫu đến điểm cao cực đại của pic) của các pic, dCH đối với cholesterol, dB đối với brassicasterol, dC đối với campesterol và dS đối với b-sitosterol, và đo chiều rộng đáy của pic (kích thước lưu giữa các điểm giao nhau của đường nền với các tiếp tuyến đến các điểm uốn của sườn trước và sau của pic), wCH đối với cholesterol wB đối với brassicasterol. Độ phân giải của pic PR = 2 (dB - dCH)/(wB + wCH), ít nhất phải bằng 1.
Chú thích – Để dễ dàng đo được các chiều rộng đáy, kéo dài đoạn thẳng dài nhất của cả hai sườn của pic cho đến khi nó cắt với đường nền; chiều rộng đáy là khoảng cách giữa các điểm giao nhau của đường nền với đường của hai sườn.
Tính thời gian lưu tương đối (cholesterol = 1,00) đối với brassicasterol, campesterol và b-sitosterol.
7.6. Thử đối chứng
Bơm từ 3 ml đến 5 ml dung dịch thử đối chứng (4.6). Các pic của campesterol, stigmasterol và b-sitosterol sẽ xuất hiện trên sắc đồ (xem hình 3). Đo khoảng cách lưu của các pic, dC đối với campesterol, dST đối với stigmasterol và dS đối với b-sitosterol.
Tính các thời gian lưu tương đối, sẽ có các giá trị xấp xỉ như sau:
cholesterol 1,00 (khoảng 15 min)
brassicasterol 1,13 đến 1,15
campesterol 1,32 đến 1,34
stigmasterol 1,44 đến 1,46
b-sitosterol 1,66 đến 1,68
7.7. Phân tích
Xoay núm chỉnh đến hệ số giảm thấp hơn bốn lần (thường làm theo 2 bước) và bơm cùng một thể tích dung dịch sterol (7.2) giống như đã sử dụng trong 7.4. Ghi sắc đồ khí.
Nếu quan sát thấy trên sắc đồ có pic với thời gian lưu tương đối của b-sitosterol và quan sát thấy chiều cao ít nhất bằng 2% của toàn thang đo, điều đó chứng tỏ có mặt b-sitosterol và mẫu thí nghiệm khi đã tách bỏ sterol được coi là mẫu có chứa chất béo thực vật.
Việc có mặt các pic phytosterol khác như campesterol hoặc stigmasterol trên sắc đồ cũng khẳng định thêm cho kết luận trên.
Phương pháp quy định trong tiêu chuẩn này có thể phát hiện được b-sitosterol với hàm lượng đến 0,5%. Không thể đưa ra được giới hạn phát hiện chất béo thực vật trong chất béo sữa vì điều này phụ thuộc vào hàm lượng b-sitosterol của chất béo được sử dụng để trộn lẫn, nghĩa là phụ thuộc vào bản chất của chất béo hay của hỗn hợp chất béo được bổ sung vào chất béo sữa.
Báo cáo thử nghiệm phải chỉ ra phương pháp đã sử dụng và kết quả thu được. Cũng phải đề cập đến tất cả các chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, cùng với các chi tiết bất thường nào khác có thể ảnh hưởng tới kết quả.
Báo cáo thử nghiệm cũng bao gồm tất cả các thông tin cần thiết về việc nhận biết hoàn toàn mẫu thử và phải kèm theo sắc đồ đã ghi được.
Hình 1 – Sắc đồ khí của sterol chất béo sữa
Hình 2 – Sắc đồ khí của sterol dầu hạt cải và sterol chất béo sữa
Hình 3 – Sắc đồ khí của sterol dầu đậu tương