BIA - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG FLAVANOID - PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ
Beer - Determination of flavanoids content- Spectrophotometric method
Lời nói đầu
TCVN 12322:2018 được xây dựng trên cơ sở tham khảo tiêu chuẩn của Hiệp hội Đồ uống châu Âu EBC Method 9.12 (1997) Flavanoids in beer by spectrophotometry;
TCVN 12322:2018 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F9 Đồ uống biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.
BIA - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG FLAVANOID - PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ
Beer - Determination of flavanoids content- Spectrophotometric method
Tiêu chuẩn này quy định phương pháp quang phổ để xác định hàm lượng flavanoid của bia.
Phương pháp này có thể áp dụng đối với các loại bia vàng, có hàm lượng flavanoid từ 3,0 mg/L đến 200 mg/L tính theo đương lượng (+)-catechin.
Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).
TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987), Nước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm - Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử
Trong môi trường axit, hợp chất p-dimethyl aminocinnamaldehyd phản ứng với các flavanoid trong mẫu thử như (+)-catechin để tạo thành các hợp chất tạo màu. Phương pháp này cho phép định lượng catechin và các hợp chất proanthocyanidin gây đục trong bia nhưng không ước tính được các flavanol và các flavanol glycosid.
Phẩn mẫu thử đã pha loãng được trộn với dung dịch axit của p-dimethyl aminocinnamaldehyd, chất màu thu được sẽ được xác định bằng cách đo độ hấp thụ.
Nồng độ của các flavanoid được xác định trực tiếp từ công thức hồi quy. Phương pháp này được hiệu chuẩn bằng (+)-catechin nên kết quả tính theo đương lượng (+)-catechin.
Sử dụng thuốc thử tinh khiết phân tích và nước được sử dụng ít nhất đạt loại 3 theo TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987), trừ khi có quy định khác.
4.1 Axit clohydric đặc, d = 1,19
4.2 Metanol.
4.3 Thuốc thử màu, dung dịch p-dimethylaminocinnamaldehyd, 1 g/L
Hòa tan 500 mg p-dimethyl aminocinnamaldehyd 98 % trong hỗn hợp đã làm nguội trước gồm 125 ml axit clohydric đặc (4.1) và 350 ml metanol (4.2) đựng trong bình định mức dung tích 500 ml, thêm metanol đến vạch.
Chuẩn bị thuốc thử hàng tuần và bảo quản thuốc thử nơi tối.
Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm và cụ thể như sau:
5.1 Thiết bị đo quang phổ, có thể đo độ hấp thụ ở bước sóng 640 nm.
5.2 Cuvet thủy tinh, chiều dài đường quang 10 mm.
5.3 Bình định mức, dung tích 100 ml và 500 ml.
5.4 Pipet định mức, có thể phân phối các thể tích 1,0; 5,0 và 10,0 ml.
5.5 Bình nón, dung tích 1 000 ml.
Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải đúng là mẫu đại diện. Mẫu không bị hư hỏng hoặc không bị thay đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.
Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Nên lấy mẫu theo TCVN 5519 (ST SEV 5808)[1].
7.1 Chuẩn bị mẫu thử
Ổn định mẫu thử ở nhiệt độ khoảng 20 °C. Khử khí bằng cách chuyển mẫu vào bình nón (5.5), ban đầu lắc nhẹ sau đó lắc mạnh hơn cho đến khi không còn bọt khí thoát ra. Không khử khí bằng cách lọc vì giấy lọc sẽ hấp phụ các flavanoid.
7.2 Pha loãng mẫu
Dùng pipet (5.4) lấy 10,0 ml phần mẫu thử đã khử khí (7.1), cho vào bình định mức 100 ml (5.3). Thêm nước đến vạch.
7.3 Xác định
Dùng pipet (5.4) lấy 1,00 ml mẫu thử đã pha loãng (7.2) cho vào ống nghiệm. Thêm 5,00 ml thuốc thử màu (4.3) và trộn. Sau 10 min, chuyển hỗn hợp vào cuvet 10 mm (5.2) và đọc độ hấp thụ ở bước sóng 640 nm (A640s).
7.4 Mẫu trắng
Trộn 1,00 ml nước với 5,00 thuốc thử màu (4.3). Chuyển hỗn hợp vào cuvet 10 mm (5.2) và đọc độ hấp thụ ở bước sóng 640 nm (A640b). Thực hiện hai phép xác định đồng thời.
Hàm lượng flavanoid của mẫu thử, X, biểu thị bằng miligam đương lượng (+)-catechin trên lít (mg/L), được tính theo Công thức:
X= 335 x (A640s- A640b)
Trong đó:
A640s là giá trị độ hấp thụ trung bình đối với mẫu thử;
A640b là giá trị độ hấp thụ trung bình đối với mẫu trắng.
Biểu thị kết quả đến một chữ số thập phân.
Các giá trị độ chụm dưới đây được xác định từ dữ liệu thử nghiệm liên phòng. Các giá trị độ chụm này có thể không áp dụng được cho các dải nồng độ và nền mẫu khác với dải nồng độ và nền mẫu đã nêu.
9.1 Độ lặp lại
Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm độc lập, đơn lẻ về hàm lượng flavanoid, thu được khi sử dụng cùng một phương pháp, trên vật liệu thử giống hệt nhau, trong cùng một phòng thử nghiệm, do cùng một người thực hiện, sử dụng cùng thiết bị, trong cùng một khoảng thời gian ngắn, không được quá 5 % các trường hợp lớn hơn giá trị giới hạn lặp lại r = 0,13 m.
Trong đó m là giá trị trung bình của hàm lượng flavanoid, biểu thị bằng miligam đương lượng (+)-catechin trên lít (mg/L).
9.2 Độ tái lập
Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm đơn lẻ về hàm lượng flavanoid, thu được khi sử dụng cùng một phương pháp, trên vật liệu thử giống hệt nhau, trong các phòng thử nghiệm khác nhau, do những người khác nhau thực hiện, sử dụng thiết bị khác nhau, không được quá 5 % các trường hợp lớn hơn giá trị giới hạn tái lập R = 0,21 m.
Trong đó m là giá trị trung bình của hàm lượng flavanoid, biểu thị bằng miligam đương lượng (+)-catechin trên lít (mg/L).
Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:
a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;
b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;
c) phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;
d) mọi chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc tùy chọn, cùng với mọi tình huống bất thường khác có thể ảnh hưởng đến kết quả;
e) kết quả thử nghiệm thu được.
Thư mục tài liệu tham khảo
[1] TCVN 5519 (ST SEV 5808), Bia - Quy tắc nghiệm thu và phương pháp lấy mẫu
[2] Delcour, J. A. and D. J. Janssens De Varebeke. 1985. “A new colourimetric assay for flavanoids in pilsner beers”. Journal of the Institute of Brewing 91(1): 37-40.