Honey- Determination oftylosin, lincomycin residues by liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS)
Lời nói đầu
TCVN 12285:2018 do Trung tâm Kiểm tra vệ sinh thú y Trung ương I - Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.
MẬT ONG - PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG TYLOSIN, LINCOMYCIN BẰNG SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ HAI LẦN (LC-MS/MS)
Honey- Determination oftylosin, lincomycin residues by liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS)
Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định dư lượng tylosin, lincomycin có trong mật ong bằng sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS).
Giới hạn định lượng của phương pháp là 10 μg/kg.
Dư lượng tylosin, lincomycin trong mật ong được chiết ra bằng dung dịch đệm phosphat pH 8, được làm sạch bằng cột chiết pha rắn SPE-HLB. Xác định và định lượng tylosin, lincomycin bằng sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS).
Trong tiêu chuẩn này chỉ sử dụng các thuốc thử tinh khiết phân tích trừ khi có quy định khác và nước cất hai lần khử ion hoặc nước có độ tinh khiết tương đương.
3.1 Natri phosphat ngậm một phân tử nước (NaH2PO4.H2O).
3.2 Natri chlorit (NaCI).
3.3 Natri hydroxit (NaOH).
3.4 Nước (H2O), loại dùng cho LC-MS.
3.5 Axetonitril (CH3CN), loại dùng cho LC-MS.
3.6 Nước (H2O), loại dùng cho HPLC.
3.7 Metanol (CH3OH), loại dùng cho HPLC.
3.8 Khí N2, độ tinh khiết 99,99 %.
3.9 Axít formic (HCOOH).
3.10 Dung dịch axit formic 0,1 %
Lấy 1 ml axit formic cho vào bình định mức 1000 ml. Thêm nước (3.6) đến vạch. Dung dịch này khi được bảo quản ở nhiệt độ phòng có thể bền đến 1 tháng.
3.11 Dung dịch đệm phosphat 0,1 M (pH 8)
Hòa tan 13,8 g natri phosphat ngậm một phân tử nước (3.1) trong 900 ml nước cất vào bình định mức 1000 ml (4.13), chỉnh pH 8 bằng dung dịch NaOH 10 M (3.13) hoặc HCl 1 M (3.14). Thêm nước cất hai lần khử ion đến vạch. Dung dịch này khi được bảo quản ở nhiệt độ phòng có thể bền đến 1 tháng.
3.12 Dung dịch NaCl 2 %
Cân 20 g NaCI (3.2) vào bình định mức 1000 ml (4.13) hòa tan và định mức tới vạch bằng nước cất hai lần khử ion. Dung dịch này khi được bảo quản ở nhiệt độ phòng có thể bền đến 1 tháng.
3.13 Dung dịch NaOH 10 M
Cân 40 g NaOH (3.3) cho vào bình định mức 100 ml (4.13), hòa tan bằng 70 ml nước cất hai lần khử ion và để mát. Thêm nước cất hai lần khử ion đến vạch. Dung dịch này khi được bảo quản ở nhiệt độ phòng có thể bền đến 1 tháng.
3.14 Dung dịch axit HCl 1 M
Lấy 8,33 ml dung dịch axit HCl đặc 37 % cho vào bình định mức 100 ml cho tiếp 50 ml nước (3.6), để nguội sau đó tiếp tục định mức tới vạch bằng nước (3.6).
3.15 Dung dịch axetonitril: nước (3:7)
Lấy 140 ml nước (3.4) pha vào 60 ml axetonitril (3.5) cho vào lọ thủy tinh 250 ml (4.16). Dung dịch này khi được bảo quản ở nhiệt độ phòng có thể bền đến 1 tháng.
3.16 Chất chuẩn lincomycin (LIN), độ tinh khiết 99,0 %.
3.17 Chất chuẩn tylosin (TYL), độ tinh khiết 99,0 %.
3.18 Chất nội chuẩn lincomycin-d3 (LIN-d3), độ tinh khiết 99,0 %.
3.19 Dung dịch chuẩn gốc LIN, TYL, nồng độ 1000 μg/ml trong metanol.
Cân 50 mg ± 0,1 mg mỗi loại vào các bình định mức dung tích 50 ml riêng biệt (4.13). Hòa tan và định mức đến vạch bằng metanol (3.7) để được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 1000 μg/ml. Dung dịch này khi được được bảo quản ở âm 20 °Ccó thể bền đến 6 tháng.
CHÚ THÍCH: Lượng cân trên phải được điều chỉnh hợp lý để đạt nồng độ chuẩn gốc 1000 μg/ml sau khi đã tính toán và hiệu chỉnh khối lượng theo giấy chứng nhận độ tinh khiết của nhà sản xuất.
3.20 Dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian (S1) LIN, TYL, nồng độ 10 μg/ml trong metanol
Lấy 100 μl từ mỗi dung dịch gốc LIN, TYL (3.19) cho vào bình định mức 10 ml (4.13), định mức đến vạch bằng metanol (3.7). Dung dịch này khi được bảo quản ở âm 20 °C có thể bền đến 1 tháng.
3.21 Dung dịch chuẩn trung gian (S2) LIN, TYL, nồng độ 1 μg/ml trong axetonitril: nước
Lấy 1 ml từ dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian S1 (3,20) cho vào bình định mức 10 ml, định mức đến vạch với axetonitril: nước (3.15). Dung dịch này khi được bảo quản ở âm 20 °C có thể bền đến 1 tuần.
3.22 Dung dịch nội chuẩn gốc lincomycin d3, nồng độ 1000 μg/ml trong metanol
Cho 1 ml metanol (3.7) vào từng lọ có chứa 1 mg chất nội chuẩn thu được dung dịch nội chuẩn gốc có nồng độ 1000 μg/ml. Dung dịch này khi được bảo quản ở âm 20 °Ccó thể bền đến 6 tháng.
3.23 Dung dịch nội chuẩn trung gian (IS1) lincomycin d3, nồng độ 10 μg/ml trong metanol
Lấy 100 μl từ mỗi dung dịch nội chuẩn gốc lincomycin d3 (3.22) cho vào bình định mức 10 ml, định mức đến vạch với metanol (3.7). Dung dịch này khi được bảo quản ở âm 20 °C có thể bền đến 3 tháng.
3.24 Dung dịch nội chuẩn (IS2) lincomycln d3, 1 μg/ml trong axetonitril: nước
Lấy 1 ml dung dịch nội chuẩn trung gian (3.23) cho vào bình định mức 10 ml, định mức đến vạch với axetonitril: nước (3.15). Dung dịch này khi được bảo quản ở âm 20 °C có thể bền đến 1 tháng.
CHÚ THÍCH: Có thể sử dụng nội chuẩn đồng vị của tylosin.
3.25 Dung môi pha động kênh B, axetonitril + 0,01 % axit formic
Lấy 100 μl axít formic (3.9) cho vào 1000 ml axetonitril (3.5), khuấy đều. Dung dịch này khi được bảo quản ở nhiệt độ phòng có thể bền đến 1 tuần.
3.26 Dung môi pha động kênh A, nước + 0,01 % axít formic
Lấy 100 μl axit formic (3.9) cho vào 1000 ml nước (3.4), khuấy đều. Dung dịch này khi được bảo quản ở nhiệt độ phòng có thể bền đến tuần.
Sử dụng thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:
4.1 Hệ thống máy sắc ký lỏng phổ khối lượng LC-MS/MS
- Bơm 2 kênh dung môi gradient;
- Detector 2 tứ cực MS/MS;
- Máy tính và phần mềm phân tích;
- Cột sắc ký RP C18, đường kính trong 2,1 mm, chiều dài cột 150 mm, kích thước hạt 5 μm;
- Hệ thống bơm mẫu tự động.
4.2 Cân phân tích, có độ chính xác đến 0,01 mg.
4.3 Máy ly tâm lạnh, tốc độ 200 r/min đến 15000 r/min.
4.4 Máy vortex, tốc độ tối đa 2000 r/min.
4.5 Tủ sấy, dải nhiệt độ đến 250 °C, sai số ± 0,1 °C.
4.6 Bộ bay hơi nitơ, có điều chỉnh nhiệt độ.
4.7 Máy đo pH.
4.8 Máy lắc ngang.
4.9 Bộ chiết pha rắn kết nối bơm chân không
4.10 Tủ âm sâu, dải nhiệt độ từ âm 20 °C đến âm 30 °C.
4.11 Micropipet, dung tích 5 μl đến 50 μl, 10 μl đến 100 μl, 20 μl đến 200 μl và 100 μl đến 1000 μl.
4.12 Ống nghiệm thủy tinh, dung tích 8 ml.
4.13 Bình định mức, dung tích 10 ml, 50 ml, 100 ml và 1000 ml.
4.14 Ống ly tâm, dung tích 50 ml.
4.15 Lọ đựng mẫu, dung tích 1,5 ml.
4.18 Lọ thủy tinh, dung tích 250 ml.
4.17 Màng lọc nylon, kích thước lỗ 0,2 μm, đường kính 13 mm.
4.18 Cột Oasis HLB, 200 mg, dung tích 6 ml.
Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Điều quan trọng là phòng thử nghiệm nhận được đúng mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc bị biến đổi trong quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.
Mẫu khi chưa phân tích ngay phải được bảo quản ở âm 20 °C và có thể ổn định được trong 6 tháng.
6.1 Chuẩn bị mẫu thử
Cân 2 g ± 0,01 g mẫu đã đồng nhất bằng cách khuấy hoặc lắc đều vào ống ly tâm 50 ml (4.14). Cho vào 40 μl dung dịch nội chuẩn (3.24). Lắc đều bằng máy vortex (4.4) sau đó để yên 15 min trước khi tiến hành các bước tiếp theo.
6.2 Chuẩn bị mẫu trắng
Mẫu trắng là mẫu mật ong không nhiễm tylosin, lincomycin, chuẩn bị tối thiểu một mẫu trắng cho mỗi lô.
6.3 Chuẩn bị mẫu kiểm soát
Mẫu kiểm soát được chuẩn bị từ mẫu trắng có bổ sung 40 μl hỗn hợp chuẩn tylosin, lincomycin (3.21) và 40 μl dung dịch nội chuẩn (3.24) để thu được nồng độ chuẩn của mẫu kiểm soát là 20 ng/g và nồng độ nội chuẩn là 20 ng/g. Lắc đều bằng máy vortex (4.4) sau đó để yên 15 min trước khi tiến hành các bước tiếp theo.
6.4 Chuẩn bị mẫu và dựng đường chuẩn
Đường chuẩn được lập dựng trên mẫu trắng (6.2) được thêm chuẩn ở các nồng độ khác nhau.
Cho lần lượt các dung dịch chuẩn hỗn hợp tylosin, lincomycin (3.20), (3.21) và dung dịch nội chuẩn (3.24) vào các ống ly tâm có chứa mẫu trắng theo Bảng 1, lắc 15 s bằng máy vortex (4.4), sau đó để yên 15 min trước khi tiến hành các bước tiếp theo như đối với mẫu thử.
Bảng 1 - Nồng độ các dung dịch nội chuẩn dùng để dựng đường chuẩn
Nồng độ chuẩn trong mẫu (μg/kg) | Thể tích chuẩn (3.21) thêm vào (μl) | Thể tích chuẩn (3.20) thêm vào (μl) | Thể tích nội chuẩn (3.24) thêm vào (μl) |
0 | 0 |
| 40 |
10 | 20 |
| 40 |
20 | 40 |
| 40 |
50 | 100 |
| 40 |
100 |
| 20 | 40 |
200 |
| 40 | 40 |
7.1 Chiết mẫu và làm sạch mẫu
Thêm vào mẫu thử (6.1) 20 ml dung dịch đệm phosphat 0,1 M (3.11);
Lắc 30 min bằng máy lắc ngang (4.8) cho tan hoàn toàn;
Hoạt hóa cột HLB bằng 5 ml metanol (3.7), 5 ml nước cất, 5 ml NaCI 2 % (3.12) và 5 ml dung dịch đệm phosphat 0,1 M (3.11);
Ly tâm mẫu (4.3) ở 4000 r/min trong 5 min;
Chuyển dung dịch qua cột chảy chậm, không quá 2 giọt/s;
Rửa cột bằng 5 ml nước cất, để khô cột 10 min;
Rửa giải bằng 5 ml metanol (3.7) thu vào ống nghiệm 8 ml (4.12);
Bay hơi tới khô bằng bộ bay hơi nitơ ở 40 °C đến 50 °C (4.6);
Hòa tan cặn bằng 2 ml dung dịch 0,1 % axit formic (3:10):metanol (3:7) theo tỷ lệ 3:1;
Lọc bằng màng lọc nylon (4.17), đưa dịch chiết vào lọ đựng mẫu 1,5 ml (4.15);
Tiến hành phân tích trên hệ thống LC-MS/MS (4.1).
7.2 Tiến hành thử nghiệm trên LC-MS/MS
7.2.1 Yêu cầu chung
Chuẩn hóa các điều kiện của sắc ký lỏng như tốc độ dòng, thành phần pha động, nhiệt độ cột và các điều kiện của đầu dò MS/MS như điện thế mao quản, điện thế đầu cone, năng lượng va chạm, tốc độ khi va chạm...để mỗi chất phân tích thu được tỉ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N) lớn hơn 3 cho các phân mảnh ion và luôn tồn tại 4 điểm nhận dạng (IP) bao gồm 1 ion mẹ, 2 ion con; không có píc nhiễu tại vị trí của píc phân tích.
7.2.2 Điều kiện trên LC (tham khảo)
Cột sắc ký: RP C18, đường kính trong 2,1 mm, chiều dài cột 150 mm, kích thước hạt 5 μm
Nhiệt độ cột: (40 ± 5) °C
Tốc độ dòng: 0,2 ml/min
Thể tích bơm mẫu: 5 μl
Thời gian phân tích: 16 min
Pha động: Chạy theo chương trình gradient thể hiện theo Bảng 2.
Bảng 2 - Điều kiện gradient cho hệ thống LC
Thời gian (min) | KênhB Nước + 0,01 % axit formic | Kênh A Axetonitril + 0,01 % axit formic |
0 | 95 | 5 |
1 | 95 | 5 |
10 | 5 | 95 |
11 | 5 | 95 |
12 | 95 | 5 |
16 | 95 | 5 |
7.2.3 Điều kiện trên MS (tham khảo)
Kiểu ion hóa:ESI (+)/MRM
Nhiệt độ nguồn ion hóa:150 °C
Nhiệt độ hóa hơi dung môi:400 °C
Tốc độ dòng khí làm bay hơi dung môi:600 l/h
Tốc độ dòng khí qua khối nón:20 l/h
Áp suất khí va chạm:Argon, p = 2,93x10-3 mbar
Điện thế mao quản: 2,0 kV
Bảng 3 - Điều kiện phân mảnh MS/MS
Kháng sinh | lon mẹ (m/z) | lon con(m/z) | Năng lượng va chạm CE (eV) | Năng lượng (Sample Cone) (V) |
Lincomycin | 407,2 | 126,1* 359,2 | 26 18 | 32 |
Tylosin | 916,6 | 174,0* 772,5 | 35 30 | 48 |
Lincomycin-d3 | 410,0 | 129,1 | 26 | 36 |
* dùng để định lượng. | ||||
7.3 Trình tự bơm mẫu (tham khảo)
- Bom dung môi kiểm tra máy: axetonitril (3.5);
- Bơm các dung dịch để dựng đường chuẩn;
- Bơm mẫu trắng;
- Bơm mẫu kiểm soát;
- Bơm mẫu thử;
8 Tính toán và biểu thị kết quả
8.1 Hệ số tín hiệu, RF, tính theo công thức:
Trong đó:
Sản phẩm là diện tích pic của ion định lượng chất cần phân tích;
SpIS là diện tích pic của ion thứ cấp của chất nội chuẩn.
8.2 Xây dựng đường chuẩn
Xây dựng phương trình bậc nhất giữa hệ số tín hiệu RF với nồng độ chất chuẩn bổ sung vào mẫu x theo phương trình đường chuẩn:
RF = ax + b.
Trong đó:
x lànồng độ chất chuẩn, tính theo đơn vị microgam trên lít (μg/l);
b là điểm cắt của đường chuẩn với trục tung;
a là hệ số góc của đường chuẩn.
8.3 Tính kết quả
Hàm lượng chất phân tích trong mẫu, C, microgam trên kilogam (μg/kg) được tính theo công thức sau:
Trong đó:
Cx là nồng độ chất phân tích được suy ra từ đường chuẩn, tính bằng microgam trên lít (μg/l);
V là thể tích cuối cùng của mẫu thử, tính bằng mililit (ml);
F là hệ số pha loãng mẫu khi đo (nếu không pha loãng, F = 1);
m là khối lượng mẫu thử, tính bằng gam (g).
8.4 Biểu thị kết quả
Kết quả được biểu thị bằng đơn vị μg/kg (ppb) được làm tròn đến hai chữ số sau dấu phẩy.
Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:
- Thông tin cần thiết về việc nhận biết đầy đủ mẫu thử;
- Phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu có;
- Phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;
- Các chi tiết bất thường khác có thể ảnh hưởng tới kết quả thử nghiệm;
- Kết quả thử nghiệm thu được.
Thư mục tài liệu tham khảo
[1] Quy trình nội bộ VS1/QT/119/TD “Mật ong - Xác định dư lượng tylosin, lincomycin bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép hai lần khối phổ”
[2] Phương pháp phân tích dư lượng macrolid trong mật ong bằng sắc ký lỏng hai lần khối phổ, mã # M-H239, 2007- JT laboratories Inc.