THỰC PHẨM - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG FRUCTAN BẰNG PHƯƠNG PHÁP ENZYM-QUANG PHỔ
Foodstuffs - Determination of fructan content by enzymatic-spectrophotometric method
Lời nói đầu
TCVN 13281:2021 được xây dựng trên cơ sở tham khảo AOAC 999.03 Measurement of fructan in food. Enzymatic/spectrophotometric method;
TCVN 13281:2021 do Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia biên soạn, Bộ Y tế đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.
THỰC PHẨM - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG FRUCTAN BẰNG PHƯƠNG PHÁP ENZYM-QUANG PHỔ
Foodstuffs - Determination of fructan content by enzymatic-spectrophotometric method
Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định fructan trong thực phẩm bằng phương pháp enzym- quang phổ.
Tiêu chuẩn này không áp dụng trực tiếp cho fructan đã polyme hoá bằng axit hoặc enzym.
Trong tiêu chuẩn này áp dụng các thuật ngữ và định nghĩa sau:
2.1
Đơn vị hoạt độ sacarase (unit of sacarase activity)
U
Lượng sacarase xúc tác để giải phóng 1 µmol glucose trong thời gian 1 min từ sacarose ở 40 °C, pH 6,5.
2.2
Đơn vị hoạt độ exo-inulinase (unit of exoinulinase activity)
U
Lượng exoinulinase xúc tác để giải phóng 1 pmol đường khử tương đương (như fructose) trong thời gian 1 min từ ketose (10 mg/mL) ở 40 °C, pH 4,5.
2.3
Hàm lượng fructan (fructan content)
Lượng chất xác định được theo quy trình quy định trong tiêu chuẩn này.
CHÚ THÍCH: Hàm lượng fructan được biểu thị bằng phần trăm khối lượng mẫu thử.
Chiết mẫu thử bằng nước nóng để hòa tan fructan. Phần dịch chiết được xử lý bằng sacarase đặc hiệu để thủy phân sacarose thành glucose, fructose và bằng hỗn hợp enzyme để thủy phân tinh bột có trong mẫu thử thành glucose. Tất cả các đường tự do sau đó sẽ bị khử bằng borohydrid kiềm thành đường alcol. Fructan được thủy phân thành fructose và glucose bằng enzyme fructanase (exo-inulinase và endo-inulinase), các loại đường này được xác định bằng phương pháp sử dụng axit hydrazid p-hydroxybenzoic (PAHBAH) (áp dụng cho các loại đường khử).
Sử dụng các thuốc thử tinh khiết phân tích và sử dụng nước cất hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, trừ khi có quy định khác.
4.1 Dung dịch đệm natri maleat, 100 mM, pH 6,5
Hòa tan 11,6 g axit maleic trong 900 ml nước đựng trong bình định mức 1 L (5.14) và chỉnh đến pH 6,5 bằng dung dịch natri hydroxit 2 M (8,0 g NaOH/100 mL), sau đó pha loãng bằng nước đến vạch.
Bảo quản dung dịch ở 4 °C.
4.2 Dung dịch đệm natri axetat, 100 mM, pH 4,5
Cho 5,8 mL axit axetic băng (1,05 g/mL) vào 900 ml nước đựng trong bình định mức 1 L (5.14). Chỉnh đến pH 4,5 bằng dung dịch natri hydroxit 1 M, sau đó pha loãng bằng nước đến vạch.
Bảo quản dung dịch ở 4 °C.
4.3 Thuốc thử axit hydrazld p-hydroxybenzoic (PAHBAH)
4.3.1 Dung dịch A
Cho 10 g PAHBAH vào 60 mL nước đựng trong cốc có mỏ dung tích 250 mL (5.18). Đặt cốc trên máy khuấy từ để khuấy đều hỗn hợp rồi thêm 10 mL axit clohydric (36,5 % đến 38 %). Pha loãng bằng nước đến 200 mL và bảo quản ở nhiệt độ phòng (khoảng 22 °C).
Dung dịch này ổn định trong ít nhất 2 năm.
4.3.2 Dung dịch B
Cho 24,9 g trinatri xitrat ngậm hai phân tử nước vào 500 mL nước đựng trong bình định mức 2 L (5.14). Khuấy đều để hòa tan. Thêm 2,20 g canxi clorua ngậm hai phân tử nước rồi thêm 40 g natri hydroxit và khuấy đều (dung dịch có thể đục như sữa nhưng sẽ trong sau 30 min đến 60 min). Pha loãng bằng nước đến vạch.
Dung dịch này ổn định ít nhất 2 năm ở nhiệt độ phòng (khoảng 22 °C).
4.3.3 Thuốc thử làm việc PAHBAH
Ngay trước khi sử dụng, cho 20 mL dung dịch A (4.3.1) vào 180 mL dung dịch B (4.3.2) và trộn kỹ. Dung dịch này được bảo quản trên đá lạnh và ổn định trong khoảng 4 h.
4.4 Natri hydroxit, 50 mM
Hòa tan 2,0 g natri hydroxit trong 900 ml nước đựng trong bình định mức 1 L (5.14). Pha loãng bằng nước đến vạch.
Bảo quản dung dịch ở nhiệt độ phòng (khoảng 22 °C).
4.5 Borohydrid kiềm
Dùng cân (5.17), cân chính xác 50 mg natri borohydrid cho vào các ống polypropylen (5.15). Ghi lại khối lượng các ống (khoảng 10 ống), đậy kín ống và bảo quản trong bình kín hút ẩm.
Ngay trước khi sử dụng, hòa tan natri borohydrid (ở 10 mg/mL) trong dung dịch natri hydroxit 50 mM (4.4). Dung dịch này ổn định trong 4 h đến 5 h ở nhiệt độ phòng (khoảng 22 °C).
4.6 Axit axetic, 100 mM
Cho 5,8 mL axit axetic băng vào bình định mức 1 L (5.14) và pha loãng bằng nước đến vạch.
Bảo quản dung dịch ở nhiệt độ phòng (khoảng 22 °C).
4.7 Chế phẩm sacarase/amylase, 2,27 đơn vị (U) sacarase/mL
Hòa tan lọ chứa hỗn hợp dạng bột đông khô gồm sacarase (50 U) cùng β-amylase (Bacillus cereus, 500 U), pullulanase (Bacillus licheniforms, 100 U) và maltase (nấm men, 1000 U) trong 22 mL đệm natri maleat (4.1). Chia dung dịch enzym này vào các ống polypropylen (5.15), mỗi ống 5 mL và bảo quản ở nhiệt độ - 20 °C để tránh nhiễm bẩn vi sinh vật. Nếu không pha loãng trong đệm, enzym đông khô ổn định trong 5 năm khi bảo quản ở - 20 °C.
4.8 Dung dịch fructanase, 450 U/mL exo-inulinase và 4,5 U/mL endo-inulinase
Hòa tan lọ chứa 10 000 U exo-inulinase và 100 U endo-inulinase trong 22 mL đệm natri axetat (4.2). Chia dung dịch enzym này vào các ống polypropylen (5.15), mỗi ống 5 mL và bảo quản lạnh đông để tránh nhiễm vi sinh vật. Nếu không pha loãng trong đệm, enzym đông khô ổn định trong 5 năm khi bảo quản ở -20 °C.
4.9 Mẫu bột kiểm soát fructan
Mẫu có chứa một lượng đã biết fructan, ví dụ cây thược dược dạng đông khô có mặt α-cellulose. Bột này ổn định khi bảo quản khô ở nhiệt độ phòng.
4.10 Mẫu bột kiểm soát sacarose
Sacarose dạng đông khô có mặt α-cellulose. Bột này ổn định khi bảo quản khô ở nhiệt độ phòng (khoảng 22 °C).
4.11 Dung dịch chuẩn gốc D-fructose, 1,5 mg/mL trong dung dịch axit benzoic 0,2 %
Trước khi chuẩn bị dung dịch, sấy khô fructose tinh thể dạng bột (độ tinh khiết > 97 %) 16 h ở 60 °C trong tủ sấy (5.9), dưới điều kiện chân không. Tính lại nồng độ chính xác của dung dịch chuẩn gốc dựa trên độ tinh khiết và lượng cân thực tế.
4.12 Dung dịch chuẩn làm việc D-fructose
Dùng pipet (5.11) lấy 0,2 mL dung dịch chuẩn gốc D-fructose (4.11) cho vào 0,9 mL dung dịch đệm axetat (4.2), trộn kỹ trên máy trộn Vortex (5.5). Chia hỗn hợp vào 4 ống nghiệm (5.13), mỗi ống 0,2 mL dung dịch (chứa 54,5 μg fructose). Thêm 0,1 mL đệm axetat (4.2) vào từng ống. Thêm tiếp vào 4 ống nghiệm mỗi ống 5,0 mL thuốc thử PAHBAH làm việc (4.3.3) ngay trước khi ủ trong nồi cách thủy đun sôi (5.4).
Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:
5.1 Máy nghiền ly tâm, có rotor 12 răng và sàng cỡ lỗ 0,5 mm.
5.2 Bếp điện, có khuấy từ.
5.3 Nồi cách thủy, có thể duy trì nhiệt độ ở 40 °C ± 0,1 °C.
5.4 Nồi cách thủy đun sôi,ở nhiệt độ từ 95 °C đến 100 °C.
5.5 Máy trộn Vortex.
5.6 Máy đo pH.
5.7 Đồng hồ bấm giờ.
5.8 Giấy lọc nhanh, ví dụ: Whatman No.1 hoặc loại tương đương.
5.9 Tủ sấy chân không, dùng để sấy chất chuẩn fructose.
5.10 Máy đo quang phổ, đo được ở bước sóng 410 nm.
5.11 Pipet, có các đầu tip dùng một lần, có thể phân phối các thể tích 100 µL và 200 µL.
CHÚ THÍCH: Có thể sử dụng bộ phân phối dung môi bằng tay được kiểm soát.
5.12 Pipet có khoảng trống dương, có các đầu tip có thể phân phối chính xác các thể tích 100 µL, 200 µL và 5 mL.
5.13 Ống nghiệm thủy tinh, đáy tròn kích thước 16 mm x 120 mm, dung tích 17 mL.
5.14 Bình định mức, dung tích 50 mL, 100 mL, 1 L và 2 L.
5.15 Ống nghiệm polypropylen, dung tích 10 mL, có nắp vặn.
5.16 Cân, có thể cân chính xác đến 0,1 g.
5.17 Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,1 mg.
5.18 Cốc có mỏ, bằng thủy tinh chịu nhiệt, dung tích 100 mL, 200 mL và 250 mL.
Tiêu chuẩn này không quy định việc lấy mẫu. Tham khảo các tiêu chuẩn cụ thể về lấy mẫu sản phẩm. Trong trường hợp chưa có tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm, việc lấy mẫu theo thỏa thuận giữa các bên liên quan.
Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải là mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc biến đổi trong suốt quá trình vận chuyển và bảo quản.
7.1 Yêu cầu chung
Tất cả các sản phẩm phải đưa về nhiệt độ phòng (khoảng 22 °C) trước khi cân.
7.2 Mẫu thử
Đối với mẫu thực phẩm khô, nghiền khoảng 50 g mẫu thử trong máy nghiền (5.1) sao cho lọt qua sàng cỡ lỗ 0,5 mm. Chuyển tất cả mẫu đã nghiền sang một bình chất dẻo miệng rộng và trộn đều bằng cách lắc và đảo chiều.
Đối với mẫu sản phẩm rắn ẩm, ví dụ: sô cô la: cân bằng về nhiệt độ phòng (khoảng 22 °C) và nghiền thành bột.
Đối với mẫu thực phẩm mềm có độ ẩm rất cao, ví dụ: chất béo dạng phết, làm ấm mẫu cho đến mềm, trộn đều sau đó lấy một phần nhỏ để đại diện cho khối lượng lớn mẫu.
Đối với mẫu sản phẩm dạng lỏng hoặc dạng sệt, ví dụ: nước quả, sữa chua: chỉnh đến pH 6,5 trước khi gia nhiệt. Các mẫu này có thể pha loãng trực tiếp được trong dung dịch đệm natri maleat (4.1).
7.3 Mẫu trắng thuốc thử
Chuyển 0,3 mL dung dịch đệm natri axetat (4.2) vào các ống nghiệm (5.13) và tiến hành phân tích tương tự như quy trình chuẩn từ bước thêm thuốc thử PAHBAH ở 8.4.
7.4 Mẫu bột kiểm soát sacarose, chứa khoảng 10 % sacarose
Tiến hành phân tích 1,0 g bột này theo quy trình dùng cho mẫu thử có chứa từ 0 % đến 12 % fructan. Mẫu bột này không chứa fructan và được sử dụng để kiểm tra hiệu quả của việc xử lý sacarase bằng borohydrid. Lượng fructan trong mẫu tính được không vượt quá 0,3 %.
8.1 Yêu cầu chung
Đối với mỗi bộ các phép thử, tiến hành phân tích dung dịch chuẩn làm việc D-fructose (lặp lại 4 lần), mẫu trắng thuốc thử (lặp lại 2 lần), mẫu bột kiểm soát fructan và mẫu bột kiểm soát sacarose.
Sử dụng mẫu trắng thuốc thử để chỉnh máy đo quang phổ (5.10) về 0.
8.2 Chiết fructan
8.2.1 Các mẫu có hàm lượng từ 0 % đến dưới 12 % fructan
Dùng cân (5.16) cân chính xác 1,0 g phần mẫu thử đồng nhất (7.2) vào cốc có mỏ 200 mL (5.18) khô. Thêm 80 mL nước nóng (xấp xỉ 80 °C), khuấy đều và đun cốc cùng lượng chứa trên bếp điện có khuấy từ (5.2) ở xấp xỉ 80 °C, khoảng 15 min cho đến khi mẫu thử hoà tan hoặc phân tán hoàn toàn. pH của dung dịch hoặc huyền phù lớn hơn 5,5 hoặc fructan đã khử polyme một phần.
Để dung dịch nguội đến nhiệt độ phòng rồi chuyển định lượng sang bình định mức 100 mL (5.14). Pha loãng bằng nước đến vạch và trộn kỹ.
Lọc dung dịch qua giấy lọc (5.8) và phân tích ngay. Dịch lọc có thể hơi đục.
CHÚ THÍCH: Nếu dịch lọc được bảo quản trong vài giờ ở nhiệt độ thấp trước khi phân tích, thì fructan có thể bị kết tủa.
Trong trường hợp này, đun nóng dung dịch đến xấp xỉ 80 °C và để nguội đến nhiệt độ phòng trước khi phân tích.
8.2.2 Các mẫu có hàm lượng fructan từ 12 % đến dưới 50 %
Dùng cân (5.17) cân khoảng 90 mg đến 100 mg phần mẫu thử đã nghiền cho vào cốc có mỏ 100 mL (5.18) khô. Thêm 40 mL nước nóng (xấp xỉ 80 °C), khuấy đều và đun cốc cùng lượng chứa trên bếp điện có khuấy từ (5.2) ở xấp xỉ 80 °C trong khoảng 15 min cho đến khi chất rắn được phân tán hoàn toàn. pH của dung dịch hoặc huyền phù lớn hơn 5,5 hoặc fructan đã khử polyme một phần.
Để nguội dung dịch đến nhiệt độ phòng rồi chuyển định lượng sang bình định mức 50 mL (5.14). Pha loãng bằng nước đến vạch và trộn kỹ.
Lọc dung dịch qua giấy lọc (5.8) và phân tích ngay.
8.2.3 Các mẫu có hàm lượng fructan từ 50 % đến 100 %
Tiến hành theo 8.2.2 nhưng chuyển toàn bộ dung dịch vào bình định mức 100 mL (5.14) và pha loãng bằng nước đến vạch.
Lọc dung dịch qua giấy lọc (5.8) và phân tích ngay.
8.3 Loại bỏ sacarose, tinh bột và đường khử
Chuyển 0,2 mL phần dịch lọc (chứa fructan khoảng 0,1 mg/mL đến 1,0 mg/mL) vào đáy các ống nghiệm (5.13).
Thêm 0,2 mL dung dịch sacarose/amylase đã pha loãng (4.7) vào từng ống, ủ ở 40 °C trong 30 min trong nồi cách thủy (5.3).
Thêm 0,2 mL dung dịch borohydrid kiềm (4.5) vào từng ống. Trộn đều trên máy trộn Vortex (5.5) và ủ ở 40 °C trong 30 min trong nồi cách thủy (5.3) để khử hoàn toàn đường khử thành đường alcol.
Thêm 0,5 mL axit axetic (4.6) vào từng ống, trộn đều trên máy trộn Vortex (5.5) (việc này giúp loại bỏ borohydrid dư và chỉnh pH về 4,5). Đây là dung dịch A.
8.4 Thủy phân và xác định fructan
Chuyển 0,2 mL dung dịch A (làm lặp lại 3 lần) vào đáy các ống nghiệm (5.13).
Thêm 0,1 mL dung dịch fructanase (4.8) vào 2 ống, trộn đều trên máy trộn Vortex (5.5) và ủ ở 40 °C trong 20 min trong nồi cách thủy (5.3) để thủy phân hoàn toàn fructan thành fructose và glucose. Đối với mẫu thử trắng, thêm 0,1 mL dung dịch đệm natri axetat (4.2).
Dùng pipet (5.12) thêm 5,0 mL thuốc thử làm việc PAHBAH (4.3.3) vào tất cả các ống bao gồm dung dịch chuẩn làm việc fructose (4.12), mẫu trắng thuốc thử (7.3), các dịch chiết của mẫu bột kiểm soát fructan (4.9) và mẫu bột kiểm soát sacarose (4.10).
Ủ các ống trong nồi cách thủy đun sôi (5.4) chính xác 6 min, sau đó lấy các ống ra và đặt ngay trong nước nguội (từ 18 °C đến 20 °C) trong 5 min.
Đo độ hấp thụ của tất cả các dung dịch trong máy đo quang phổ (5.10) ở bước sóng 410 nm so với mẫu trắng thuốc thử ngay sau khi làm nguội. Phức màu PAHBAH có thể thay đổi theo thời gian, ở nhiệt độ phòng, có thể thấy sự thay đổi nhỏ (< 5 %) trong khoảng từ 10 min đến 15 min. Có thể thấy sự thay đổi tương tự trong các dung dịch chuẩn.
Hàm lượng fructan tổng số trong mẫu thử, X, tính bằng phần trăm khối lượng (%) theo Công thức (1):
(1) |
Trong đó:
A | là chênh lệch độ hấp thụ của 0,2 mL dung dịch mẫu thử so với mẫu thử trắng; |
F | là hệ số chuyển đổi giá trị độ hấp thụ sang µg fructose (= 54,5 µg fructose/độ hấp thụ của 54,5 µg fructose); |
5 | là hệ số chuyển đổi từ 0,2 mL dung dịch mẫu thử đã phân tích thành 1,0 mL; |
V | là thể tích của dịch chiết đã sử dụng (100 mL hoặc 50 mL); |
1,1/0,2 = 0,2 mL được lấy ra từ 1,1 mL dịch thủy phân enzym để phân tích; | |
W | là khối lượng phần mẫu thử, tính bằng miligam (mg); |
100/W | là hệ số biểu thị fructan theo phần trăm khối lượng của bột; |
1/1000 | là hệ số chuyển đổi từ microgam sang miligam; |
162/180 | là hệ số chuyển đổi từ fructose tự do sang fructose/glucose khan |
Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm ít nhất các thông tin sau đây:
a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;
b) phương pháp lấy mẫu, nếu biết;
c) phương pháp thử, viện dẫn tiêu chuẩn này;
d) mọi điều kiện thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này hoặc được xem là tùy chọn, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả;
e) kết quả thử nghiệm;
f) nếu kiểm tra độ lặp lại thì nêu kết quả cuối cùng thu được.
Kết quả nghiên cứu liên phòng thử nghiệm
Bảng A.1 - Các kết quả nghiên cứu liên phòng thử nghiệm tổng hàm lượng fructan trong thực phẩm và trong nguyên liệu thực vật (g/100 g nguyên liệu)
Mẫu | Sôcôla | Sữabột | Vitamindạngviên | Hành | Bộtkiểmsoát fructan | Fructantinhkhiết | Bông lúa mì | Cúc vu (atisô Jerusa- lem) | Chấtbéodạngphết |
Số lượng phòng thử nghiệm tham gia | 13 | 13 | 13 | 10 | 13 | 10 | 13 | 11 | 13 |
Số lượng phòng thử nghiệm còn lại sau khi trừ ngoại lệ | 0 | 0 | 0 | 3 | 0 | 2 | 0 | 2 | 0 |
Giá trị trung bình | 13,52 | 10,64 | 4,60 | 51,43 | 28,47 | 95,87 | 4,72 | 51,63 | 8,19 |
Giới hạn lặp lại, r | 2,4 | 2,0 | 0,9 | 6,8 | 5,3 | 7,4 | 0,3 | 6,8 | 1,7 |
Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, RSDr, % | 6,4 | 6,7 | 7,1 | 4,7 | 6,6 | 2,8 | 2,3 | 4,7 | 7,3 |
Giới hạn tái lập, R | 3,7 | 3,1 | 1,3 | 8,9 | 7,0 | 13,3 | 1,1 | 8,3 | 2,5 |
Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, RSDr, % | 9,9 | 10,4 | 9,9 | 6,2 | 8,7 | 5,0 | 8,6 | 5,7 | 10,8 |