TIÊU CHUẨN QUỐC\r\nGIA

TCVN\r\n8710-5:2011

BỆNH\r\nTHỦY SẢN - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 5: BỆNH TAURA Ở TÔM HE

Aquatic animal\r\ndisease - Diagnostic procedure - Part 5: Taura syndrome in Penaeus vannamei

Lời nói đầu

TCVN 8710-5:2011 do Cục Thú y biên soạn, Bộ\r\nNông nghiệp và Pháttriển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất\r\nlượngthẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

TCVN 8710-5:2011

BỆNH THỦY SẢN - QUY\r\nTRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 5: BỆNH TAURA Ở TÔM HE

Aquatic animal\r\ndisease - Diagnostic procedure - Part 5: Taura syndrome in Penaeus vannamei

CẢNH BÁO - Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể\r\nliên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu\r\nchuẩn này không thể đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến\r\nviệc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác\r\nan toàn sức khỏe thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định\r\ntrước khi sử dụng tiêu chuẩn.

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh\r\ntaura trên tôm he chân trắng.

2. Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết\r\ncho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫnghi năm công bố\r\nthì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm\r\ncông bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu\r\ncó).

TCVN 8376:2010, Tôm và sản phẩm tôm -\r\nPhát hiện virut gây hội chứng taura (TSV) bằng kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp-phiên\r\nmã ngược (RT-PCR).

3. Thuật ngữ và định\r\nnghĩa

Trong tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ và định\r\nnghĩa nêu trong TCVN 8376:2010.

4. Phương pháp chẩn\r\nđoán

4.1 Chẩn đoán lâm sàng

4.1.1 Dịch tễ học

Virut gây hội chứng taura (TSV) cảm nhiễm\r\nchủ yếu trên các loài tôm thuộc họ Tôm he (Penaeidae):Penaeus vannamei, P.\r\nstylirostris, P. monodon, Penaeus chinensis, Penaeus japonicus...\r\nTrong số đó tôm Penaeus vannamei là loài nhạy cảm nhất với bệnh\r\ntaura.

Bệnh gây chết từ 40 % đến 90 % tuỳ theo kích\r\ncỡ tôm bệnh.

Phương thức lan truyền bệnh: Bệnh cũng có thể\r\nlây lan theo những cá thể nhiễm bệnh mãn tính lantruyền sang con cháu trong quá\r\ntrình sinh sản hoặc thông qua những sinh vật mang mầm bệnh vàovùng nuôi như:\r\nchim Gallus domesticus, ký chủ trung gian dưới nước như Trichocorixa\r\nreticulate. và qua nguồn nước có chứa vi rút và qua thức ăn nhiễm bệnh TSV làm\r\nthức ăn cho tôm nuôi.

4.1.2 Triệu chứng lâm sàng

Giai đoạn cảm nhiễm: Chủ yếu giai đoạn giống\r\nPoslarvae từ 14 ngày đến 40 ngày tuổi, kích thước khoảng 0,1 g đến 5 g. Tôm lớn\r\nhơn vẫn có thể nhiễm bệnh này.

Thời kì ủ bệnh: Giai đoạn này diễn ra trong\r\nthời gian ngắn khoảng 2 ngày đến 5 ngày cho đến khi bùng phát bệnh, tôm\r\nkhông thể hiện dấu hiệu bệnh lí ra bên ngoài..

Giai đoạn cấp tính: Kéo dài khoảng 1 ngày đến\r\n10 ngày. Tôm bị bệnh sẽ chuyển màu đỏ nhợt nhạt của biểu mô vỏ, đặc biệt\r\nvùng đuôi, chân bơi. Ngoài ra còn có thể có dấu hiệu khác như mềm vỏ, ruột rỗng\r\nvà thường chết khi lột xác. Tỉ lệ chết tích lũy từ 80 % đến 95 %. Đặc điểm trên\r\ncác lát cắt mô bệnh học của tầng biểu bì mang, dạ dày, ruột trước, ruột sau, mô\r\nliên kết thể hiện các vùng bị hoại tử.

Giai đoạn mãn tính: Những con tôm nhiễm TSV sống\r\nsót bắt mồi trở lại bình thường nhưng sẽ mang vi rút suốt đời. Các sắc tố\r\nđen trên vỏ ki tin, sau vài lần lột xác sẽ biến mất. Và trở thành vật mang mầm bệnh,\r\nnếu là tôm bố mẹ sẽ lan truyền cho thế hệ sau theo trục dọc, hoặc theo trục\r\nngang nếu trở thành mồi ăn thịt cho các cá thể khác.

4.2 Chẩn đoán phòng thí nghiệm

4.2.1 Phương pháp RT PCR, theo TCVN\r\n8376:2010.

4.2.2 Phương pháp mô bệnh học

4.2.2.1 Lấy mẫu

Thu lấy mẫu tôm từ postlavare 5 (hậu ấu trùng\r\n5 ngày tuổi) đến tôm trưởng thành. Mẫu tôm phải còn sống hoặc đang trong tình\r\ntrạng hấp hối.

Thu những mẫu tôm có biểu hiện bệnh có dấu hiệu\r\nkhông bình thường, có nhiều điểm bị thương tổn màu nâu, đen trên vỏ kitin, có\r\nhiện tượng mềm vỏ và đổi màu đỏ của các phần phụ. Không dùng tômchết hoặc tôm bảo\r\nquản đá để cắt mô.

4.2.2.2 Thuốc thử và vật liệu thử

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân\r\ntích và sử dụng nước cất hai lần đã khử ion hoặc nước cóđộ tinh khiết tương\r\nđương, trừ khi có quy định khác.

- Dung dịch Davidson (xem A.1).

- Thuốc nhuộm hematoxylin (xem A.2).

- Thuốc nhuộm eosin (xem A.3).

- Cồn 70 %, 80 %, 95 % và cồn tuyệt đối;

- Parafin;

- Xylen;

- Keo dán, ví dụ Bom Canada;

4.2.2.3 Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm\r\nchẩn đoán bệnh.

- Kính giải phẫu

- Bộ đồ giải phẫu gồm các dụng cụ panh, rùi\r\nnhọn, giải phẫu kéo các loại, lam kính và lamen

- Lọ nhỏ cố định mẫu.

- Bình rót parafin;

- Bộ phận làm lạnh mẫu;

- Máy cắt mẫu microtome;

- Nồi nước có chỉnh nhiệt độ;

- Tủ ấm hoặc bàn sấy mẫu;

- Kính hiển vi quang học;

- Cassete;

- Khung đúc mẫu.

4.2.2.4 Cách tiến hành

4.2.2.4.1 Chuẩn bị mẫu

Cố định mẫu trong dung dịch Davidson. Tỷ lệ mẫu\r\nvà dung dịch cố định là 1/10.

Đối với tôm ấu trùng hoặc tôm postlavare (hậu\r\nấu trùng) có thể cố định cả con trong dung dịch từ 12 h đến 24 h. Số tôm\r\nthu từ 30 con đến 50 con trên bể. Sau đó cố định trong cồn 70 % ở nhiệt độ\r\nphòng.

Đối với tôm lớn lấy mang, dạ dày và biểu mô\r\ndưới vỏ cho vào lọ có chứa dung dịch Davidson. Số tôm thu từ 5 con đến 10 con một\r\nao. Ngâm trong 24 h đến 72 h phụ thuộc vào kích thước của mẫu, sau đó bảo\r\nquản ngay trong cồn 70 % ở nhiệt độ phòng.

4.2.2.4.2 Khử mẫu cố định

Ngâm trong cồn 90 % hai lần, trong thời gian\r\n30 min đến 60 min mỗi lần. Sau đó ngâm trong cồn tuyệt đối hai lần, thời\r\ngian 30 min đến 60 min mỗi lần.

4.2.2.4.3 Làm trong mẫu

Ngâm sang xylen 1 để trong 30 min đến 60 min.

Ngâm sang xylen 2 để trong 30 min đến 60 min.

Ngâm tẩm parafin 2 lần, mỗi lần 56 ºC đến\r\n58 ºC trong 1 h.

Đúc khuôn: Đặt mẫu đã thấm parafin vào khuôn\r\nđổ parafin tập trung vào một mặt của khuôn để khi cắtđược tốt hơn. Làm lạnh mẫu\r\ntrong bàn lạnh hoặc để trong tủ lạnh.

4.2.2.4.4 Cắt mẫu

Cắt gọt khối block parafin vuông, mặt cắt bằng\r\nphẳng, để trên mặt khay đá.

Đặt mặt khối block nến song song với mép lưỡi\r\ndao, cắt chiều dày lát cắt từ 4 µm đến 5 µm.

Chọn lát cắt tiêu bản phẳng thả vào nồi nước\r\nnhiệt độ nước từ 30 ºC đến 35 ºC; sau đó dùng lam kính vớt lát cắt\r\ntiêu bản. Để khô.

4.2.2.4.5 Nhuộm tiêu bản H&E

Tẩy parafin bằng cách ngâm trong xylen hai lần,\r\nmỗi lần từ 3 min đến 5 min, sau đó ngâm lần lượttrong cồn tuyệt đối, cồn 90 %\r\nvà cồn 70 %, mỗi lần ngâm từ 3 min đến 5 min rồi đem rửa dưới vòinước chảy từ 3\r\nmin đến 5 min.

Ngâm trong thuốc nhuộm haematoxylin từ 3 min\r\nđến 5 min sau đó rửa dưới vòi chảy từ 3 min đến 5 min rồi tiếp tục ngâm\r\ntrong thuốc nhuộm eosin từ 1 min đến 2 min.

Làm mất nước trong mẫu qua các thang nồng độ\r\ncồn 75 %, cồn 90 % và cồn tuyệt đối, mỗi bước từ 1 min đến 2 min, chuyển\r\nsang xylen hai lần (mỗi lần từ 2 min đến 3 min), gắn lamen bằng keo dán, vídụ\r\nBom Canada. Để khô và soi kính.

4.2.2.4.6 Đọc kết quả

Soi kính hiển vi từ vật kính có độ phóng đại\r\nthấp đến vật kính có độ phóng đại cao.

Khi tôm bị bệnh TSV, trên các lát cắt mô bệnh\r\nhọc của tầng biểu bì mang, dạ dày, mô liên kết thể hiện các vùng bị hoại tử.\r\nTrong tế bào bị cảm nhiễm, nhân kết đặc hay phân tán, trong tế bào chất xuất hiện các\r\nthể vùi hình cầu kích thước từ 1 µm đến 20 µm, bắt màu trung gian giữa màu tím\r\ncủa haematoxylin và màu hồng của eosin. Ngoài ra một dấu hiệu khác của bệnh\r\ntaura ở thời kì cấp tính là các ống tuyến an ten bị phá hủy, xuất hiện nhiều\r\ncác tế bào bạch cầu có nhân, sự vắng mặt của các tế bào máu trong phần mô\r\nbị hoại tử, xuất hiện sắc tố đen trên vỏ ki tin, là sản phẩm cuối cùng của hoạt\r\nđộng miễn dịch của tôm khi bị bệnh.

5. Kết luận

Tôm được xác định nhiễm bệnh taura khi có các\r\nđặc điểm dịch tễ học, triệu chứng lâm sàng và kết quả dương tính thu được\r\ntừ một trong hai phương pháp sau:

- Phản ứng PCR phát hiện vi rút dương tính;

- Mẫu cắt mô có bệnh tích của vi rút taura.

PHỤ LỤC\r\nA

(Quy\r\nđịnh)

THÀNH PHẦN VÀ CHUẨN BỊ DUNG DỊCH THUỐC THỬ

A.1 Dung dịch Davidson

Cồn 95\r\n%:                                                       330\r\nml

Formalin (formaldehyd 37\r\n%):                        220\r\nml

Axit axetic đậm đặc:                                       115\r\nml

Nước:                                                             335\r\nml

A.2 Thuốc nhuộm hematoxylin (dung dịch\r\nhematoxylin - Mayer)

Hematoxylin dạng tinh thể:                             1\r\ng

Natri iodat:                                                       0,2\r\ng

Amoni alum [NH4Al(SO4)2] hoặc kali alum\r\n[KAl(SO4)2]: 50 g

Axit\r\nxitric:                                                        1\r\ng

Cloral\r\nhydrat:                                                  50\r\ng

Nước:                                                             1000\r\nml

Hoà tan hematoxylin trong nước, sau đó cho\r\nnatri iodat và amoni alum hoặc kali alum, hoà tan, tiếp tục cho axit\r\nxitric và chloral hydrat rồi lọc qua giấy lọc.

Bảo quản dung dịch đã pha trong chai tối màu.

A.3 Thuốc nhuộm eosin

Eosin\r\nY:                                                           1\r\ng

Cồn 70\r\n%:                                                       1\r\nlít

Axit axetic\r\nbăng:                                             5\r\nml

Thêm từ 2 giọt đến 3 giọt axit axetic vào cồn\r\n70 %. Hoà tan eosin trong cồn, sau đó cho thêm axitaxetic rồi lọc qua giấy lọc.

Bảo quản dung dịch đã pha trong chai tối màu.

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Bonami, J.R., Hasson, K.W., Mari, J.,\r\nPoulos, B.T., Lightner, D.V., , Taura syndrome of marine penaeid shrimp:\r\ncharacterization of the viral agent.. J. Gen. Virol,\r\n1997. 78(313-319).

[2] Brock, J.A., Gose, R., Lightner, D.V.,\r\nHasson, K., , An overview of TS an important disease of farmed Penaeus\r\nvannamei. In: Browdy, C.L., Hopkins, J.S. (Eds.), Proceedings of The Special Session\r\non Shrimp Farming. Aquaculture 1995: p. 84-94.

[3] Bùi Quang Tề. 2008. Bệnh học thủy sản.

[4] Chang, Y.S., Peng, S.E., Yu, H.T., Liu,\r\nF.C., Wang, C.H., Lo, C.F., Kou, G.H. 2004. Genetic and phenotypic\r\nvariations of isolates of shrimp Taura syndrome virus found in Penaeus monodon\r\nand Metapenaeusensis in Taiwan. J. Gen. Virol, 2004. 85: p. 2963\r\n- 2968.

[5] Hasson, K.W., Lightner, D.V., Poulos,\r\nB.T., Redman, R.M., White, B.L., Brock, J.A., Bonami, J.R. 1995. Taura\r\nsyndrome in Penaeus vannamei: demonstration of a viral etiology. Dis.\r\nAquat. Org. 23: p. 115-126

[6] Lightner, D. V,. R.M.R., K. W. Hasson, C.\r\nR. Pantoja. 1995. Taura syndrome in Penaeus vannamei (Crustacea:\r\nDecapoda): gross signs, histopathology and ultrastructure. Dis. Aquat.\r\nOrg. 21: p. 53 - 59.

[7] Lightner DV. 1996. A handbook of\r\npathology and diagnostic procedures for diseases of penaeid shrimp. World Aquaculture\r\nSoc., Baton Roug. Fauquet C.M., Mayo M.A., Maniloff J., 
\r\n Desselberger U. & Ball L.A. Virus Taxonomy. Classification and\r\nNomenclature of Viruses. Eighth 
\r\nReport of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Elsevier Academic\r\nPress, 2005. 
\r\n1259 pp

[8] Mari, J., Poulos, B.T., Lightner, D.V.,\r\nBonami, J.R. 2002. Shrimp Taura syndrome virus: genomic characterization\r\nand similarity with members of the genus Cricket paralysisđếnlike\r\nviruses. J. Gen. Virol. 83: p. 915-926.

[9] Nielsen, L., Sang Oum,W., Cheevadhanarak,\r\nS., Flegel, T.W. 2005. Taura syndrome virus (TSV) in Thailand and its relationship to TSV in China and the Americas. Dis. Aquat. Org. 63: p.\r\n101- 106.

[10] Nunan L.M., Poulos B.T. & Lightner\r\nD.V. 1998. Reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) used\r\nfor the detection of Taura Syndrome Virus (TSV) in experimentally\r\ninfectedshrimp. Dis. Aquat. Org., 34: p.87 - 91.

[11] Overstreet, R.M., Lightner, D.V.,\r\nHasson, K.W., McIlwain, S., Lotz, J.M. 1997. Susceptibility to Taura\r\nsyndrome virus of some penaeid shrimp species native to the Gulf of Mexico and\r\nthesoutheastern United States. J. Invertebr. Pathol, 1997. 69: p.\r\n165-176.

[12] Robles - Sikisaka, R.,\r\nHasson,K.W.,Garcia,D.K., Brovont, K.E.,Cleveland,K.D., Klimpel,K.R.,Dhar, A.K.\r\n2002. Genetic variation and immunohistochemical differences among\r\ngeographic isolates of Taura syndrome virus of penaeid shrimp. J. Gen.\r\nVirol. 83: p. 3123-3130.

[13] Srisuvan, T., Tang, K.F.J., Lightner,\r\nD.V. 2005. Experimental infection of Penaeus monodon with  Taura\r\nsyndrome virus (TSV). Dis. Aquat. Org. 67: p. 1-8.

[14] Tang, K.F.J., Lightner, D.V. 2005. Phylogenetic\r\nanalysis of Taura syndrome virus isolates collected between 1993 and 2004 and\r\nvirulence comparison between two isolates representing different genetic\r\nvariants. Virus Res. 112: p. 69-76.

[15] Tang, K.F.J., Noble, B., D.V. Lightner.\r\n2008. Taura syndrome virus from Venezuela is a new genetic\r\nvariant. Aquaculture. 284: p. 62-67.

[16] Vanpatten K.A., N.L.M.L.D.V.\r\n2004. Seabirds as potential vectors of penaeid shrimp viruses and\r\nthe development of a surrogate laboratory model utilizing domestic\r\nchickens. Aquaculture. 241: p. 31-46.

[17] Yu, C.I. & Song, Y.L. 2000.\r\nOutbreaks of Taura syndrome in pacific white shrimp Penaeus  vannamei cultured\r\nin Taiwan. Fish Pathology 35(1): p. 21-24.