Lời nói đầu
\r\n\r\nTCVN 8710-3:2011 do Cục Thú y biên soạn, Bộ\r\nNông nghiệp và Pháttriển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất\r\nlượngthẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.
\r\n\r\n\r\n\r\n
CẢNH BÁO - Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể\r\nliên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu\r\nchuẩn này không thể đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến\r\nviệc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác\r\nan toàn, sức khỏe thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy\r\nđịnh trước khi sử dụng tiêu chuẩn.
\r\n\r\n\r\n\r\nTiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh\r\nđốm trắng do vi rút ở tôm.
\r\n\r\n\r\n\r\nCác tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết\r\ncho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm\r\ncông bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi\r\nnăm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu\r\ncó).
\r\n\r\nTCVN 8377:2010, Tôm và sản phẩm tôm -\r\nPhát hiện virut gây bệnh đốm trắng (WSSV) bằng kỹ thuật phản ứng chuỗi\r\ntrùng hợp (PCR).
\r\n\r\n\r\n\r\nTrong tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ và định\r\nnghĩa nêu trong TCVN 8377:2010.
\r\n\r\n\r\n\r\n4.1 Chẩn đoán lâm sàng
\r\n\r\n4.1.1 Dịch tễ học
\r\n\r\nBệnh xảy ra thành dịch chủ yếu trên\r\ncác loài tôm thuộc họ Penaeidae như Peneus monodon, P. vannamei,
\r\n\r\nP.stylirostris, P. setiferus… Ngoài tôm\r\nhe (các loài tôm thuộc họ trên), một số loài tôm đất, tôm càngxanh, cua, ghẹ, đến\r\ntôm có kích thước nhỏ như Acets sp, giáp xác phù du như Artemia,\r\nCopepodađều mang mầm bệnh.
\r\n\r\nBệnh lây lan từ tôm bố mẹ truyền sang con cái\r\ntrong quá trình sinh sản, từ cá thể bị nhiễm trong ao, bể do tôm ăn thức\r\năn có mầm bệnh hoặc do dụng cụ nhiễm mầm bệnh hoặc do các vật chủ trung gian\r\nnhư copepoda, tôm tự nhiên, cua, ghẹ... hoặc chim mang mầm bệnh vào khu vực\r\nnuôi tôm.
\r\n\r\nVi rút có thể cảm nhiễm hầu hết các giai đoạn\r\nphát triển của tôm: giai đoạn ấu trùng biến thái, tôm giống, tôm trưởng thành cả\r\ntôm nước mặn, lợ và nước ngọt.
\r\n\r\nBệnh xuất hiện quanh năm, đặc biệt là mùa\r\nxuân và đầu hè khi thời tiết biến đổi nhiều như biên độ nhiệt độ trong ngày biến\r\nthiên quá lớn, thay đổi độ mặn gây sốc cho tôm.
\r\n\r\n4.1.2 Triệu chứng lâm sàng
\r\n\r\nTôm bị bệnh thường thể hiện dấu hiệu giảm ăn\r\nrõ rệt, đôi khi có trường hợp tăng cường sự bắt mồihơn bình thường, sau vài\r\nngày bỏ ăn, tôm dạt bờ, lờ đờ với dấu hiệu xuất hiện các đốm trắng tròn dưới lớp\r\nvỏ kitin đặc biệt là vùng đầu ngực và đốt bụng cuối cùng. Trong trường hợp cấp\r\ntính, tômbệnh có thể chuyển sang màu hồng đỏ. Hiện tượng chết có thể xảy ra\r\nngay sau đó, tỉ lệ chết có thể lên đến khoảng từ 90 % đến 100 % trong vòng\r\n3 ngày đến 7 ngày.
\r\n\r\n4.2 Chẩn đoán phòng thí nghiệm
\r\n\r\n4.2.1 Phương pháp PCR, theo TCVN\r\n8377:2010.
\r\n\r\n4.2.2 Phương pháp mô học
\r\n\r\n4.2.2.1 Thuốc thử và vật liệu thử
\r\n\r\nChỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân\r\ntích và sử dụng nước cất hai lần đã khử ion hoặc nước cóđộ tinh khiết tương\r\nđương, trừ khi có quy định khác.
\r\n\r\n- Dung dịch Davidson (xem A.1).
\r\n\r\n- Thuốc nhuộm hematoxylin (xem A.2).
\r\n\r\n- Thuốc nhuộm eosin (xem A.3).
\r\n\r\n- Cồn 70 %, 90 %, 95 % và cồn tuyệt đối.
\r\n\r\n- Parafin.
\r\n\r\n- Xylen.
\r\n\r\n- Keo dán, ví dụ Bom Canada.
\r\n\r\n4.2.2.2 Thiết bị, dụng cụ
\r\n\r\nSử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử\r\nnghiệm chẩn đoán bệnh.
\r\n\r\n- Kính giải phẫu;
\r\n\r\n- Bộ đồ giải phẫu gồm các dụng cụ panh, rùi\r\nnhọn, giải phẫu kéo các loại, lam kính và lamen
\r\n\r\n- Lọ nhỏ cố định mẫu;
\r\n\r\n- Bình rót parafin;
\r\n\r\n- Bộ phận làm lạnh mẫu;
\r\n\r\n- Máy cắt mẫu microtome;
\r\n\r\n- Nồi nước có chỉnh nhiệt độ;
\r\n\r\n- Tủ ấm hoặc bàn sấy mẫu;
\r\n\r\n- Kính hiển vi quang học;
\r\n\r\n- Cassete;
\r\n\r\n- Khung đúc mẫu.
\r\n\r\n4.2.2.3 Lấy mẫu
\r\n\r\nThu mẫu tôm giống (từ postlavare 5 trở lên).\r\nMẫu tôm phải còn sống hoặc đang trong tình trạng hấp hối. Không dùng tôm đông lạnh,\r\ntôm bảo quản đá để cắt mô.
\r\n\r\n4.2.2.4 Các bước tiến hành
\r\n\r\n4.2.2.4.1 Chuẩn bị mẫu
\r\n\r\n- Cố định mẫu trong dung dịch Davidson. Tỷ lệ\r\nmẫu và dung dịch cố định là 1/10.
\r\n\r\n- Đối với tôm ấu trùng hoặc tôm postlavare (hậu\r\nấu trùng) có thể cố định cả con trong dung dịch từ 12 h đến 24 h. Thu lấy\r\nkhoảng từ 30 con đến 50 con trên bể. Sau đó cố định trong cồn 70 % ở nhiệt độ\r\nphòng.
\r\n\r\n- Đối với tôm lớn lấy mang, dạ dày và biểu mô\r\ndưới vỏ cho vào lọ có chứa dung dịch Davidson. Thu lấy khoảng từ 5 con đến 10\r\ncon trên một ao. Ngâm trong 24 h đến 72 h phụ thuộc vào kích thước củamẫu, sau\r\nđó bảo quản ngay trong cồn 70 % ở nhiệt độ phòng.
\r\n\r\n4.2.2.4.2 Khử mẫu cố định
\r\n\r\n- Ngâm trong cồn 90 % hai lần, trong thời\r\ngian 30 min đến 60 min mỗi lần.
\r\n\r\n- Sau đó ngâm trong cồn tuyệt đối hai lần, thời\r\ngian 30 min đến 60 min mỗi lần.
\r\n\r\n4.2.2.4.3 Làm trong mẫu
\r\n\r\n- Ngâm sang xylen 1 để trong 30 min đến 60\r\nmin
\r\n\r\n- Ngâm sang xylen 2 để trong 30 min đến 60\r\nmin.
\r\n\r\n- Ngâm tẩm parafin 2 lần, mỗi lần 56 ºC\r\nđến 58 ºC trong 1 h.
\r\n\r\n- Đúc khuôn: Đặt mẫu đã thấm parafin vào\r\nkhuôn đổ parafin tập trung vào một mặt của khuôn để khi cắt được tốt hơn.\r\nLàm lạnh mẫu trong bàn lạnh hoặc để trong tủ lạnh.
\r\n\r\n4.2.2.4.4 Cắt mẫu
\r\n\r\n- Cắt gọt khối block parafin vuông, mặt cắt bằng\r\nphẳng, để trên mặt khay đá.
\r\n\r\n- Đặt mặt khối block nến song song với mép lưỡi\r\ndao, cắt chiều dày lát cắt từ 4 µm đến 5 µm.
\r\n\r\n- Chọn lát cắt tiêu bản phẳng thả vào nồi nước\r\nnhiệt độ nước từ 30 ºC đến 35 ºC; sau đó dùng lam kính vớt lát cắt\r\ntiêu bản. Để khô.
\r\n\r\n4.2.2.4.5 Nhuộm tiêu bản H&E
\r\n\r\n- Tẩy parafin bằng cách ngâm trong xylen hai\r\nlần, mỗi lần từ 3 min đến 5 min, sau đó ngâm lần lượttrong cồn tuyệt đối, cồn\r\n90 % và cồn 70%, mỗi lần ngâm từ 3 min đến 5 min rồi đem rửa dưới vòi nước chảy\r\ntừ 3 min đến 5 min.
\r\n\r\n- Ngâm trong thuốc nhuộm haematoxylin từ 3\r\nmin đến 5 min sau đó rửa dưới vòi chảy từ 3 min đến 5 min rồi tiếp tục\r\nngâm trong thuốc nhuộm eosin từ 1 min đến 2 min.
\r\n\r\n- Làm mất nước trong mẫu qua các thang nồng độ\r\ncồn 75 %, cồn 90 % và cồn tuyệt đối, mỗi bước từ 1 min đến 2 min, chuyển\r\nsang xylen hai lần (mỗi lần từ 2 min đến 3 min), gắn lamen bằng keo dán,\r\nví dụ Bom Canada. Để khô và soi kính.
\r\n\r\n4.2.2.4.6 Đọc kết quả
\r\n\r\n- Soi kính hiển vi từ vật kính có độ phóng đại\r\nthấp đến vật kính có độ phóng đại cao.
\r\n\r\n- Khi tôm bị bệnh WSSV, trong mô của một số\r\ncơ quan như mang, dạ dày, biểu mô dưới vỏ kitin, cơquan tạo máu… có những biến\r\nđổi đặc thù. Những tế bào bị nhiễm vi rút thể hiện sự hơi phình to củanhân tế\r\nbào, trong đó chứa duy nhất một thể vùi hình cầu hoặc hình trứng bắt màu tím hồng\r\ncủahematoxylin. Khi bệnh nặng các thể vùi thường chiếm hết thể tích của nhân tế\r\nbào phình to.
\r\n\r\n\r\n\r\nTôm được xác định nhiễm bệnh vi rút đốm trắng\r\nkhi có các đặc điểm dịch tễ học, triệu chứng lâm sàng và kết quả dương\r\ntính thu được từ một trong hai phương pháp sau:
\r\n\r\n- Phản ứng PCR phát hiện vi rút dương tính;
\r\n\r\n- Mẫu cắt mô có bệnh tích của vi rút đốm trắng\r\n(WSSV).
\r\n\r\n\r\n\r\n
A.1 Dung dịch Davidson
\r\n\r\nCồn 95\r\n%: 330\r\nml
\r\n\r\nFormalin (formaldehyd 37\r\n%): 220\r\nml
\r\n\r\nAxit axetic đậm đặc: 115\r\nml
\r\n\r\nNước: 335\r\nml
\r\n\r\nA.2 Thuốc nhuộm hematoxylin (dung dịch\r\nhematoxylin - Mayer)
\r\n\r\nHematoxylin dạng tinh thể: 1\r\ng
\r\n\r\nNatri\r\niodat: 0,2\r\ng
\r\n\r\nAmoni alum [NH4Al(SO4)2] hoặc kali alum\r\n[KAl(SO4)2]: 50 g
\r\n\r\nAxit\r\nxitric: 1\r\ng
\r\n\r\nCloral\r\nhydrat: 50\r\ng
\r\n\r\nNước: 1000\r\nml
\r\n\r\nHoà tan hematoxylin trong nước, sau đó cho\r\nnatri iodat và amoni alum hoặc kali alum, hoà tan, tiếp tục cho axit\r\nxitric và chloral hydrat rồi lọc qua giấy lọc.
\r\n\r\nBảo quản dung dịch đã pha trong chai tối màu.
\r\n\r\nA.3 Thuốc nhuộm eosin
\r\n\r\nEosin\r\nY: 1\r\ng
\r\n\r\nCồn 70\r\n%: 1\r\nlít
\r\n\r\nAxit axetic\r\nbăng: 5\r\nml
\r\n\r\nThêm từ 2 giọt đến 3 giọt axit axetic vào cồn\r\n70 %. Hoà tan eosin trong cồn, sau đó cho thêm axitaxetic rồi lọc qua giấy lọc.
\r\n\r\nBảo quản dung dịch đã pha trong chai tối màu.
\r\n\r\n\r\n\r\n
[1] Bùi Quang Tề. 2008, Bệnh truyền nhiễm\r\ncủa động vật thủy sản. p. 122-128.
\r\n\r\n[2] Đỗ Thị Hòa, Bùi Quang Tề, Nguyễn Hữu\r\nDũng, Nguyễn Thị Muội. 2004. Bệnh học thủy sản. p. 184-189.
\r\n\r\n[3] Flegel, T.W. 1997. Special topic\r\nreview: major viral diseases of the black tiger prawn (Penaeus monodon) in Thailand. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 13 : p. 442.
\r\n\r\n[4] Hameed, A.S., Balasubramanian. G.,\r\nMusthaq, S.S., Yoganandhan. K. 2003. Experimental infection of twenty species\r\nof Indian marine crabs with white spot syndrome virus (WSSV). 57: p. 157-161.
\r\n\r\n[5] Lightner, D.V. 1996. A handbook of\r\npathology and diagnostic procedures for diseases of penaeid shrimp. Baton Rouge, Louisiana, USA: World Aquaculture Society.
\r\n\r\n[6] Li, Q., Zhange, Z., Chen, Y., Yang, F.\r\n2003. White spot syndrome virus (WSSV) infectivity for Artemia at\r\ndifferent developmental stages.. Diease of Aquatic Organism. 57: p.\r\n261-264.
\r\n\r\n[7] Lo, C.F., Ho, C.H., Peng, S.E., Chen,\r\nC.H., Hsu, H.E., Chiu, Y.L., Chang, C.F., Liu, K.F., Su, M.S., Wang, C.H. and\r\nKou, G.H. 1996a. White spot syndrome associated virus (WSBV)\r\ndetected in cultured and captured shrimp, crabs and other arthropods.\r\nDiseases of Aquatic Organisms.27: p. 215-225.
\r\n\r\n[8] Lo, C.F., Leu, J.H., Ho, C.H., Chen,\r\nC.H., Peng, S.E., Chen, Y.T., Chou, C.M., Yeh, P.Y., Huang, C.J., Chou, H.Y.,\r\nWang, C.H., Kou, G.H. 1996b. Detection of baculovirus associated with\r\nwhitespot syndrome (WSBV) in penaeid shrimps using polymerase chain reaction.\r\nDiseases of Aquatic Organisms. 25: p. 133-141.
\r\n\r\n[9] Lo C.F., Ho C.H., Chen C.H., Liu K.F.,\r\nChiu Y.L., Yeh P.Y., Peng S.E., Hsu H.C., Liu H.C., Chang C.F., Su M.S., Wang\r\nC.H. & Kou G.H. 1997. Detection and tissue tropism of white spot\r\nsyndrome baculovirus (WSBV) in captured brooders of Penaeus monodon with a\r\nspecial emphasis on reproductive organs. Dis. Aquat. Org., 30:\r\np. 53-72.
\r\n\r\n[10] Lo C.F. & Kou G.H.\r\n1998. Virus-associated white spot syndrome of shrimp in Taiwan: a review. Fish Pathol.,33: p. 365-371.
\r\n\r\n[11] Maeda M., Itami T., Mizuki E., Tanaka\r\nR., Yoshizu Y., Doi K., Yasunaga-Aoki C., Takahashi Y. & Kawarabata T.\r\n2000. Red swamp crawfish (Procambarus clarkii): an alternative\r\nexperimental host in the study of white spot syndrome virus. Acta\r\nVirol., 44: p. 371-374.
\r\n\r\n[12] OIE. 2009. Manual of Diagnostic\r\nTests for Aquatic Animals. Chapter 2.3.2.
\r\n\r\n[13] Peng, S.E., Lo, C.F., Ho, C.H., Chang,\r\nC.F. and Kou, G.H. 1998. Detection of white spot baculovirus (WSBV) in\r\ngiant freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii, using polymerase chain\r\nreaction. Aquaculture. 164: p. 253-262
\r\n\r\n[14] Wang, Y.-C. 1998. Experimental\r\ninfection of white spot baculovirus in some cultured and wild decapods in Taiwan. Aquaculture. 164: p. 221 - 231.
\r\n\r\n[15] Vlak J.M., Bonami J.R., Flegel T.W., Kou\r\nG.H., Lightner D.V., Lo C.F., Loh P.C. & Walker P.J. 2004. Nimaviridae. In C.\r\nM. Fauquet, M. A.
\r\n\r\n\r\n\r\n
File gốc của Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8710-3:2011 về bệnh thủy sản – quy trình chẩn đoán – phần 3: bệnh đốm trắng ở tôm đang được cập nhật.
Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8710-3:2011 về bệnh thủy sản – quy trình chẩn đoán – phần 3: bệnh đốm trắng ở tôm
Tóm tắt
| Cơ quan ban hành | Đã xác định |
| Số hiệu | TCVN8710-3:2011 |
| Loại văn bản | Tiêu chuẩn Việt Nam |
| Người ký | Đã xác định |
| Ngày ban hành | 2011-01-01 |
| Ngày hiệu lực | |
| Lĩnh vực | Nông nghiệp |
| Tình trạng | Hết hiệu lực |