Lời nói đầu
\r\n\r\nTCVN 8710-2:2011 do Cục Thú y biên soạn, Bộ\r\nNông nghiệp và Pháttriển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất\r\nlượngthẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.
\r\n\r\n\r\n\r\n
CẢNH BÁO - Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể\r\nliên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu\r\nchuẩn này không thể đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến\r\nviệc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác\r\nan toàn, sức khỏe thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy\r\nđịnh trước khi sử dụng tiêu chuẩn.
\r\n\r\n\r\n\r\nTiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh\r\nhoại tử thần kinh (VNN) ở cá biển.
\r\n\r\n\r\n\r\nTrong tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ và định\r\nnghĩa sau đây:
\r\n\r\nBệnh hoại tử thần kinh trên cá biển (viral\r\nnervous necrosis disease in marine fish)
\r\n\r\nBệnh truyền nhiễm nguy hiểm gây ra bởi vi rút\r\nthuộc giống Betanodavirus họ Nodaviridae. Khi cá bịcảm nhiễm, vi rút\r\ncó kích thước nhỏ 25 nm đến 30 nm, không có màng bao, cấu trúc di truyền là\r\nARNchuỗi đơn (+ARN).
\r\n\r\nCHÚ THÍCH: Hiện nay có 4 kiểu\r\ngen Betanodavirus gây bệnh VNN, được phân loại thành: SJNNV (striped\r\njack nevousnecrosis virus), TPNNV (tiger puffer nervous necrosis virus), RGNNV\r\n(red-spotted grouper nervous necrosis virus) và BFNNV (barfin flounder nervous\r\nnecrosis virus).
\r\n\r\n\r\n\r\n\r\n\r\n3.1.1 Dịch tễ học
\r\n\r\nHiện nay, đã có khoảng 30 loài cá biển thuộc\r\n16 họ nhiễm VNN. Vi rút gây bệnh VNN ngoài lây truyền theo chiều dọc (từ mẹ\r\nsang con) còn có thể lây truyền theo trục ngang như qua dòng nước, lây truyền từ\r\ncá thể bị bệnh sang cá thể khỏe mạnh trong cùng một bể, chúng có thể lây lan\r\nqua các dụng cụ vận chuyển cá và các sản phẩm từ cá bị nhiễm vi rút từ nơi này\r\nđến nơi khác.
\r\n\r\nỞ Việt Nam hiện nay bệnh VNN có gần như quanh\r\nnăm và bùng phát mạnh từ tháng 5 đến tháng 10, đặc biệt khi mưa nhiều. Nhiệt\r\nđộ thích hợp cho sự phát triển của bệnh là 25 ºC đến 30 ºC, tỷ lệ chết\r\nlên đến 100 %.
\r\n\r\n3.1.2 Triệu chứng lâm sàng
\r\n\r\nDấu hiệu bệnh lý điển hình của cá nhiễm VNN\r\nlà các biểu hiện thần kinh như: bơi lội không bìnhthường (bơi vòng tròn, bơi ngửa,\r\nbơi hỗn loạn không định hướng…), bỏ ăn, da tối màu, trương bóng hơi và tỷ lệ chết\r\nlớn.
\r\n\r\nCơ quan đích của Betanodavirus thường xuất hiện\r\nmô não và võng mạc cá bị bệnh.
\r\n\r\nGiai đoạn cấp tính thường xuất hiện tại các\r\ntrại ương giống ấu trùng (từ 10 ngày tuổi đến 25 ngày tuổi). Cá giống bỏ ăn, cá\r\nchết rải rác, bơi không bình thường, bơi lội mạnh không định hướng, đầu lao xuống dưới.\r\nCá chết và hấp hối hầu hết bóng hơi trương phồng, có sự xung huyết trong. Cá bệnh\r\nhoạt động yếu đầu treo trên mặt nước hoặc nằm dưới đáy bể hoặc đáy lồng. Triệu\r\nchứng tăng dần khi cả quần đàn nhiễm bệnh. Cá chết sau khoảng từ 3 ngày đến 5\r\nngày sau khi có dấu hiệu bệnh.
\r\n\r\nTrong lồng, cá lớn (trên 150 g) bị bệnh VNN\r\ncó ít triệu chứng hơn và tỷ lệ chết giảm. Cá thườngchuyển màu đen và bơi chậm\r\nchạp với bóng hơi trương phồng và có thể hoặc không có vết bệnh ở đầu. Giải phẫu\r\ncơ quan nội tạng bình thường và ruột không có thức ăn.
\r\n\r\n3.2.1 Phương pháp RT PCR (reverse\r\ntranscription polymerase chain reaction)
\r\n\r\n3.2.1.1 Nguyên tắc
\r\n\r\nPhương pháp PCR (polymerase chain reaction) dựa\r\ntrên hoạt động của ADN polymerase tổng hợp nên mạch mới từ mạch khuôn, có\r\nsự tham gia của mồi, bốn loại nucleotit gồm adenin (dATP), thymin (dTTP),\r\nguanin (dGTP), cytocin (dCTP), dùng để khuếch đại đoạn ADN đích thông qua các\r\nchu kì luân
\r\n\r\nnhiệt. Để thực hiện phản ứng khuếch đại ADN\r\nđích cần có 3 quá trình: biến tính, bắt cặp và kéo dài mạch tổng hợp mạch mới.
\r\n\r\nRT PCR là phương pháp PCR mà nucleic axit\r\nđích là ARN. Để có thực hiện được PCR này thì trước hết ARN đích phải được\r\nphiên mã ngược (RT- reverse transcription) thành cADN bằng mồi đặc hiệu cho phản\r\nứng này.
\r\n\r\nGiai đoạn phiên mã ngược RT, enzym được sử dụng\r\nlà Reverse Transcriptase. Đây là một loại enzym không chịu nhiệt, sử dụng mạch\r\nARN là mạch khuôn để tổng hợp nên sợi ADN bổ sung (cADN) có sự tham ra của\r\nmồi, dNTP và dung dịch đệm cho phản ứng.
\r\n\r\nCó hai phương pháp thực hiện RT PCR, đó là RT\r\nPCR một bước và RT PCR hai bước. Trong quytrình này, phương pháp PCR một bước\r\nđược thực hiện khuếch đại ARN đích.
\r\n\r\n3.2.1.2 Thuốc thử và vật liệu thử
\r\n\r\nChỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân\r\ntích và sử dụng nước cất hai lần đã khử ion hoặc nước cóđộ tinh khiết tương\r\nđương không có ARNase, trừ khi có quy định khác.
\r\n\r\n- Trizol;
\r\n\r\n- Cloroform;
\r\n\r\n- Isopropanol;
\r\n\r\n- Cồn 75 % và 95 %;
\r\n\r\n- Dung dịch TBE 1 X
\r\n\r\nDung dịch đệm TBE đậm đặc 10 lần (Tris - axit\r\nboric - EDTA 10X): Hòa tan 108 g Tris và 55 g axit boric trong 600 mL nước.\r\nThêm 40 mL EDTA 0,5 M và thêm nước cho đủ 1 lít. Hấp vô trùng ở 121oC\r\ntrong 15 min, bảo quản ở nhiệt độ phòng.
\r\n\r\nKhi sử dụng, thêm 900 ml nước vào 100 ml\r\ndung dịch TBE gốc (10X) thành dung dịch TBE 1X.
\r\n\r\n- Dung dịch EDTA (etylen diamin tetra axetic)\r\n0,5 M
\r\n\r\nHòa tan 93,05 g EDTA trong 350 mL nước, chỉnh\r\npH 8,0 bằng dung dịch NaOH nồng độ 4 M. Thêm nước cho đủ 500 ml. Hấp vô trùng ở\r\n121 oC trong 15 min. Bảo quản ở nhiệt độ phòng.
\r\n\r\n- Dung dịch DEPC
\r\n\r\nDung dịch di-etypyrocacbonat 0,1 % thể tích,\r\nlắc trộn đều khoảng 10 min. Sau đó để qua đêm trong bình kín, nới lỏng nắp và hấp\r\nkhử trùng ở 121 C trong 15 min, bảo quản ở nhiệt độ -20 C.
\r\n\r\n- Dung dịch TE (Tris - EDTA)
\r\n\r\nChuẩn bị dung dịch chứa Tris [tris\r\n(hydroxymetyl) aminometan] 10 mM và EDTA 1 mM, dùng HCl để chỉnh pH 7,6.
\r\n\r\n- Dung dịch TBE 1X hoặc TAE 1X
\r\n\r\nThêm 900 ml nước vào 100 ml dung dịch\r\nTAE gốc (10X) hoặc dung dịch TBE gốc (10X).
\r\n\r\n- AMV RT(Reverse Transcriptase);
\r\n\r\n- Hỗn hợp phản ứng RT-PCR;
\r\n\r\n- Dung dịch đệm tải mẫu ADN đậm đặc 6 lần\r\n(loading dye 6X);
\r\n\r\n- Thang chuẩn ADN (ADN marker) gồm có các\r\nthang 100 bp; 200 bp; 300bp; 400 bp; 500 bp; 1000 bp; 1500 bp;
\r\n\r\n- Etidi bromua (EtBr);
\r\n\r\n- Gel agarose;
\r\n\r\n3.2.1.3 Thiết bị, dụng cụ
\r\n\r\nSử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử\r\nnghiệm chẩn đoán bệnh và cụ thể như sau:
\r\n\r\n- Tủ lạnh.
\r\n\r\n- Tủ lạnh âm sâu, có thể hoạt động ở nhiệt độ\r\n-20 ºC;
\r\n\r\n- Máy li tâm, có thể hoạt động với vận tốc\r\n13000 r/min.
\r\n\r\n- Máy lắc trộn;
\r\n\r\n- Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,1\r\nmg;
\r\n\r\n- Đèn cồn;
\r\n\r\n- Khay hay hộp để đựng đá lạnh;
\r\n\r\n- Micropipet đơn kênh có dải từ 0,5 µl đến 10\r\nµl, từ 2 µl đến 20 µl, từ 10 µl đến 100 µl, từ 100 µl đến 1000 µl;
\r\n\r\n- Giá eppendorf có kích thước 0,2 ml và 1,5\r\nml;
\r\n\r\n- Bộ kéo panh vô trùng, chày nghiền mẫu, bút\r\nđánh dấu, sổ ghi chép;
\r\n\r\n- Hộp đựng giấy thấm lau tay, gang tay, khẩu\r\ntrang;
\r\n\r\n- Hộp đựng đầu típ micropipet các loại;
\r\n\r\n- Máy PCR;
\r\n\r\n- Bếp điện hoặc lò vi sóng;
\r\n\r\n- Ống đong, dung tích 100 ml; 500 ml; 1000\r\nml;
\r\n\r\n- Bình nón chịu nhiệt, dung tích 250 ml;
\r\n\r\n- Bộ điện di gồm bộ nguồn và máng chạy điện\r\ndi;
\r\n\r\n- Buồng đổ gel;
\r\n\r\n- Bàn đọc gel (UV);
\r\n\r\n- Giấy parafin.
\r\n\r\n3.2.1.4 Lấy mẫu
\r\n\r\nCá bột: lấy cả con (20 con).
\r\n\r\nCá giống: 1 con đến 5 con, lấy phần trước của\r\nđầu (20 con).
\r\n\r\nCá lớn: lấy não, mắt, trứng hoặc sẹ.
\r\n\r\nLượng mẫu lấy để tách chiết ARN khoảng 20 mg,\r\ncó thể dùng cá còn sống, tiến hành làm ngay hoặc mẫu cố định trong cồn 95 % để\r\nlàm sau đó.
\r\n\r\n3.2.1.5 Cách tiến hành
\r\n\r\n3.2.1.5.1 Tách chiết ARN
\r\n\r\nCHÚ THÍCH: Có rất nhiều quy trình tách chiết\r\nARN từ mô động vật theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Hiện nay có rất nhiều các\r\nthuốc thử và bộ kít thương mại hữu ích cho việc tách chiết ARN…). Người sử dụng\r\ncó thể lựa chọn bộ kít thích hợp và an toàn theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
\r\n\r\nPhương pháp tách chiết ARN bằng trizol:
\r\n\r\nCho 20 mg mẫu vào ống Eppendorf 1,5 ml. Nếu mẫu\r\nđược cố định trong cồn 95 %, cần làm khô cồn bằng cách đổ cồn và dốc ngược\r\ntrên tờ giấy lọc, để khô tự nhiên.
\r\n\r\nCho vào ống Eppendorf có chứa mẫu khoảng 100\r\nµl đến 200 µl dung dịch trizol (lượng mẫu không quá 10 % trizol).
\r\n\r\nNghiền nhỏ và mịn bằng chày nghiền, sau đó\r\nthêm vào khoảng 550 µl đến 650 µl dung dịch trizol và nghiền tiếp đến khi nhuyễn.\r\nGiữ ở nhiệt độ phòng đến 5 min.
\r\n\r\nLy tâm 12000 r/min trong thời gian 10 min,\r\nsau đó chuyển dịch trong sang ống Eppendorf mới, nhỏ thêm 200 µl cloroform/1 ml\r\ntrizol. Lắc cẩn thận bằng tay trong 15 s.
\r\n\r\nỦ 15 oC đến 30 oC từ 2 min đến 3\r\nmin.
\r\n\r\nLy tâm 12000 r/min từ 2 oC đến 8 oC\r\ntrong 15 min, sau đó chuyển phần trong phía trên sang ốngEppendorf 1,5 ml mới.
\r\n\r\nThêm 500 µl dung dịch isopropanol/1 ml\r\ntrizol, ủ ở 15 oC đến 30 oC trong 10 min. Ly tâm 12000 r/min tại\r\n4 oC trong 10 min, sau đó rút bỏ isopropanol.
\r\nRửa phần viên bằng etanol 75 %; 1 ml etanol 75 %/1 ml trizol.
Trộn đều bằng máy vortex và ly tâm ở 7500\r\nr/min trong 5 min ở 4 oC, sau đó rút bỏ etanol. Làm khô phần viên.
\r\n\r\nHòa tan ARN bằng nước tinh khiết hoặc DEPC\r\n(dietyl pyrocarbonat) với lượng khoảng từ 50 µl đến 100 µl tùy thuộc vào lượng\r\nARN tách chiết được.
\r\n\r\nCẢNH BÁO AN TOÀN: Việc tách chiết ARN sử dụng\r\nhoá chất nguy hiểm và có khả năng gây hại nếu thao tác không cẩn thận. Do\r\nvậy, nên tránh tiếp xúc trực tiếp với da và hít phải hơi của các hoá chất\r\nnày. Luôn luôn đeo gang tay, khẩu trang, mặc quần áo bảo hộ khi thực hiện các\r\nthao tác này.
\r\n\r\n3.2.1.5.2 Tiến hành phản ứng RT PCR
\r\n\r\n3.2.1.5.2.1 Cặp mồi ngoài sử dụng trong phản ứng\r\nRT PCR
\r\n\r\nPhản ứng khuếch đại được thực hiện trong máy\r\nluân nhiệt theo phương pháp RT PCR một bước, sử dụng cặp mồi khuếch đại đoạn\r\ngen vùng T4 mã hoá protein vỏ của chủng SSJNNV.
\r\n\r\nR3: 5'-CGA-GTC-AAC-ACG-GGT-GAA-GA-3'
\r\n\r\nF2: 5'-CGT-GTC-AGT-CAT-GTG-TCG-CT-3'
\r\n\r\nChuẩn bị mồi:
\r\n\r\n- Mồi ở trạng thái đông khô phải được ly tâm\r\nngắn để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Lần đầu tiên nên\r\ndùng đệm TE để hoàn nguyên mồi ở nồng độ 200 pmol/µL làm gốc.
\r\n\r\n- Mồi được sử dụng ở nồng độ 20 pmol/µL: pha\r\nloãng mồi gốc bằng nước không có nuclease (10 µl mồi gốc và 90 µl nước).
\r\n\r\nTùy theo điều kiện phòng thí nghiệm chọn lựa\r\nhỗn hợp Mix phản ứng cho phù hợp và sử dụng theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
\r\n\r\nChuẩn bị hỗn hợp phản ứng theo số mẫu chẩn\r\nđoán, cộng thêm một mẫu đối chứng dương và một mẫu đối chứng âm, trộn chung vào\r\nmột ống Eppendorf.
\r\n\r\nSau đó hút 22,5 µl hỗn hợp phản ứng vào ống\r\nEppendorf 0,2 ml. Ghi kí hiệu mẫu lên nắp ốngEppendorf, chứng dương và chứng\r\nâm.
\r\n\r\n3.2.1.5.2.3 Hỗn hợp phản ứng RT PCR một bước
\r\n\r\nThêm 2,5 µl ARN mạch khuôn (tách chiết được)\r\nvào ống PCR chứa sẵn 22,5 µl hỗn hợp phản ứng RT PCR để thu được 25 µl hỗn\r\nhợp có thành phần như sau: dNTP mỗi loại có nồng độ 1 mM; mồi R3 có nồng độ 0,5\r\nµM pmol; mồi F2 có nồng độ 0,1 µM pmol; dung dịch đệm cho phản ứng RT PCR; ADN\r\npolymerase chịu nhiệt (0,625 U); enzym phiên mã ngược AMV reverse transcriptase\r\n(2,5 U);
\r\n\r\nNhiều hỗn hợp phản ứng thương mại có chứa sẵn\r\ncác thành phần cho tổng hợp ADN từ ARN. Ví dụ hỗn hợp phản ứng sử dụng Mix RT\r\nPCR độ đậm đặc 2 lần (2X), có thành phần: Tfl ADN polymerase, dNTP, magie\r\nsulfat và dung dịch đệm phản ứng, enzym phiên mã ngược AMV RT.
\r\n\r\n| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n RT PCR Master Mix, 2X \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Mồi F2 \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Mồi R3 \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n ARN mạch khuôn \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n AMV RT(Reverse Transcriptase) (5 U) \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Nước \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Tạo cADN \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Biến tính \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Biến tính \r\n | \r\n \r\n | \r\n |
| \r\n Kéo dài mạch \r\n | \r\n \r\n | \r\n |
| \r\n Kéo dài mạch \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Giữ ổn định \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
CHÚ Ý: Mẫu và nguyên liệu cho phản ứng PCR cần\r\nđặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng.
\r\n\r\nCẢNH BÁO: Do bản chất của ARN là rất dễ bị\r\nphân huỷ trong môi trường cũng như enzymARNase tiết ra từ các vi sinh vật, môi\r\ntrường chai, lọ, thiết bị, dụng cụ và dung dịch. Enzym ARNase rất bền, khó bị\r\nphân huỷ bởi nhiệt độ. Vì vậy, tất cả mọi dụng cụ, thiết bị, thuốc thửdùng\r\ntrong RT PCR phải tuyệt đối vô trùng.
\r\n\r\n3.2.1.5.3 Chạy điện di
\r\n\r\n3.2.1.5.3.1 Chuẩn bị bản gel
\r\n\r\nPha thạch nồng độ từ 1,5 % đến 2 % agarose bằng\r\ndung dịch đệm TBE 1X hoặc TAE 1X vào bình nón 250 ml, lắc cho tan.
\r\n\r\nSau đó cho vào lò vi sóng đun đến sôi, đợi đến\r\nkhi nhiệt độ giảm xuống khoảng 40 oC đến 50 oC, cho vào 5 µl ethidi\r\nbromua/100 ml. Lắc nhẹ tránh tạo bọt để ethidi bromua tan đều.
\r\n\r\nChuẩn bị khuôn đổ thạch, đặt lược vào khuôn,\r\nrồi đổ thạch vào khuôn. Tiến hành đổ vào bản gel (chú ý không nên đổ bản gel\r\ndày quá 0,8 cm). Khi bản gel đông lại thì tiến hành gỡ lược khỏi bản gel.
\r\n\r\nChuyển bản gel vào máng điện di, đổ dung dịch\r\nđệm (TBE 1X hoặc TAE 1X) cùng loại với dung dịch đã đun agaroza) vào máng điện\r\ndi cho tới khi ngập bản gel.
\r\n\r\n3.2.1.5.3.2 Điện di
\r\n\r\nHút 10 µl sản phẩm PCR nhỏ vào một giếng trên\r\nbản gel.
\r\n\r\nKhi thực hiện điện di, chạy kèm theo AND\r\nmarker để dự đoán kích thước sản phẩm khuếch đại. Hút 10 µl thang ADN vào\r\nmột giếng trên bản gel.
\r\n\r\nĐiện di ở hiệu điện thế 100 volt đến 150 volt\r\n(quan sát thấy bóng khí nổi lên từ hai phía điện cực của máy điện di sau khi nối\r\nđiện). Khi quan sát thấy màu xanh đậm của thuốc nhuộm cách giếng khoảng 2/3 chiều\r\ndài bảng thạch agaroza, dừng quá trình điện di.
\r\n\r\nCHÚ Ý: Trong trường hợp Master Mix không có sẵn\r\nđệm tải mẫu thì khi tiến hành điện di nhỏ 2 µl loading dye 6X lên giấy\r\nparafin, hút 10 µl sản phẩm PCR ra, nhỏ vào và trộn đều, sau đó lấy khoảng 10\r\nµl nhỏ vào một giếng trên bản gel.
\r\n\r\n3.2.1.5.4 Đọc kết quả
\r\n\r\nSau khi điện di xong, đọc kết quả trên bàn đọc\r\nUV, đọc kết quả với tia UV bước sóng 302 nm.
\r\n\r\nĐối chiếu các vạch sáng của mẫu với các vạch\r\nsáng từ thang ADN, mẫu kiểm chứng dương tính và mẫu kiểm chứng âm tính để đưa\r\nra kết luận.
\r\n\r\n| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Thang ADN \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n Điện di tốt \r\n | \r\n
| \r\n Mẫu kiểm chứng âm tính \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n Không ngoại nhiễm \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n Bi ngoại nhiễm \r\n | \r\n |
| \r\n Mẫu kiểm chứng dương tính \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n Hỗn hợp phản ứng RT-PCR tốt \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n Mẫu kiểm chứng dương tính hỏng hoặc enzym hỏng \r\n | \r\n |
| \r\n Mẫu thử \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n Dương tính với VNN \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n Âm tính với VNN \r\n | \r\n
Kết quả mẫu thử dương tính khi: Xuất hiện vạch\r\nsáng có kích thước bằng kích thước giống mẫu đối chứng dương có kích thước\r\n427 bp, thang ADN phân vạch rõ ràng, mẫu đối chứng âm không có vạch sáng.
\r\n\r\nKết quả mẫu thử âm tính khi không có vạch\r\nsáng kích thước 427 bp. Không có vạch sáng của mẫu đối chứng âm tính, có vạch\r\nsáng mẫu đối chứng dương tính. Thang ADN phân vạch rõ ràng.
\r\n\r\n3.2.2 Phương pháp mô học
\r\n\r\n3.2.2.1 Thuốc thử và vật liệu thử
\r\n\r\nChỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân\r\ntích và sử dụng nước cất hai lần đã khử ion hoặc nước cóđộ tinh khiết tương\r\nđương không có ARNase, trừ khi có quy định khác.
\r\n\r\n- Dung dịch Bouin (xem A.1);
\r\n\r\n- Dung dịch formalin 10 % (có bổ sung 2 % muối)\r\n(xem A.2);
\r\n\r\n- Thuốc nhuộm hematoxylin (xem A.3);
\r\n\r\n- Thuốc nhuộm eosin (xem A.4);
\r\n\r\n- Cồn 70 %, 75 %, 90 % và cồn tuyệt đối;
\r\n\r\n- Parafin;
\r\n\r\n- Xylen;
\r\n\r\n- Keo dán, ví dụ Bom Canada.
\r\n\r\n3.2.2.2 Thiết bị, dụng cụ
\r\n\r\nSử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử\r\nnghiệm chẩn đoán bệnh và cụ thể như sau:
\r\n\r\n- Kính giải phẫu.
\r\n\r\n- Bộ đồ giải phẫu gồm các dụng cụ panh, rùi\r\nnhọn, giải phẫu kéo các loại, lam kính và lamen.
\r\n\r\n- Lọ nhỏ cố định mẫu.
\r\n\r\n- Bình rót parafin.
\r\n\r\n- Bộ phận làm lạnh mẫu.
\r\n\r\n- Máy cắt mẫu microtome.
\r\n\r\n- Nồi nước có chỉnh nhiệt độ.
\r\n\r\n- Tủ ấm hoặc bàn sấy mẫu.
\r\n\r\n- Kính hiển vi quang học.
\r\n\r\n- Cassete.
\r\n\r\n- Khung đúc mẫu.
\r\n\r\n3.2.2.3 Lấy mẫu
\r\n\r\nThu những mẫu cá có dấu hiệu không bình thường, Cá\r\ngiống bỏ ăn, cá chết rải rác, bơi không bìnhthường, bơi lội mạnh không định hướng,\r\nđầu lao xuống dưới. Không dùng cá chết hoặc cá bảo quảnđá để cắt mô.
\r\n\r\n3.2.2.4 Cách tiến hành
\r\n\r\n3.2.2.4.1 Chuẩn bị mẫu
\r\n\r\nĐối với cá lớn lấy phần đầu hoặc não, mắt cắt\r\nthành những lát mỏng (0,5 cm) trước khi ngâm trongdung dịch cố định formalin 10\r\n% (có bổ sung 2 % muối) hoặc dung dịch Bouin ở nhiệt độ phòng. Tỷ lệ mẫu\r\nvà dung dịch cố định là 1/10, ngâm trong 24 h đến 72 h phụ thuộc vào kích thước\r\ncủa mẫu, sau đó chuyển sang dung dịch bảo quản là cồn 70 %.
\r\n\r\nĐối với cá bột có thể cố định cả con, cá giống\r\nlấy phần đầu hoặc não, mắt ngâm trong dung dịch cố định từ 12 h đến 24 h. Sau\r\nđó cố định trong cồn 70 % ở nhiệt độ phòng.
\r\n\r\n3.2.2.4.2 Khử mẫu cố định
\r\n\r\nNgâm trong cồn 90 % hai lần, trong thời gian\r\n30 min đến 60 min mỗi lần. Sau đó ngâm trong cồn tuyệt đối hai lần, thời\r\ngian 30 min đến 60 min mỗi lần.
\r\n\r\n3.2.2.4.3 Làm trong mẫu
\r\n\r\nNgâm sang lọ xylen 1 để trong 30 min đến 60\r\nmin.
\r\n\r\nNgâm sang lọ xylen 2 để trong 30 min đến 60\r\nmin.
\r\n\r\nSau đó ngâm tẩm parafin hai lần, mỗi lần\r\n56 ºC đến 58 ºC trong 1 h.
\r\n\r\nĐúc khuôn: Đặt mẫu đã thấm parafin vào khuôn\r\nđổ parafin tập trung vào một mặt của khuôn để khi cắtđược tốt hơn. Làm lạnh mẫu\r\ntrong bàn lạnh hoặc để trong tủ lạnh.
\r\n\r\n3.2.2.4.4 Cắt mẫu
\r\n\r\nCắt gọt khối block parafin vuông, mặt cắt bằng\r\nphẳng, để trên mặt khay đá.
\r\n\r\nĐặt mặt khối block parafin song song với mép\r\nlưỡi dao, cắt chiều dày lát cắt từ 4 µm đến 5 µm.
\r\n\r\nChọn lát cắt tiêu bản phẳng thả vào nồi nước\r\nnhiệt độ nước từ 30 ºC đến 35 ºC; sau đó dùng lam kính vớt lát cắt\r\ntiêu bản. Để khô.
\r\n\r\n3.2.2.4.5 Nhuộm tiêu bản H&E
\r\n\r\nTẩy parafin bằng cách ngâm trong xylen hai lần,\r\nmỗi lần từ 3 min đến 5 min, sau đó ngâm lần lượt trong cồn tuyệt đối, cồn\r\n90 % và cồn 70 %, mỗi lần ngâm từ 3 min đến 5 min rồi đem rửa dưới vòi nước chảy\r\ntừ 3 min đến 5 min.
\r\n\r\nNgâm trong thuốc nhuộm haematoxylin từ 3 min\r\nđến 5 min sau đó rửa dưới vòi chảy từ 3 min đến 5 min rồi tiếp tục ngâm\r\ntrong thuốc nhuộm eosin từ 1 min đến 2 min.
\r\n\r\nLàm mất nước trong mẫu qua các thang nồng độ\r\ncồn 75 %, cồn 90 % và cồn tuyệt đối, mỗi bước từ 1 min đến 2 min, chuyển\r\nsang xylen hai lần (mỗi lần từ 2 min đến 3 min), gắn lamen bằng keo dán, vídụ\r\nBom Canada. Để khô và soi kính.
\r\n\r\n3.2.2.4.6 Đọc kết quả
\r\n\r\nSoi tiêu bản từ độ phóng đại thấp đến độ\r\nphóng đại cao.
\r\n\r\nTổ chức não và mắt của cá bị bệnh xuất hiện\r\nnhiều không bào màu trắng và xám có đường kính từ 5 µm đến 10 µm. Trong mô\r\nnão và mắt cá cũng tồn tại hiện tượng hoại tử, sự xâm nhập của các tế bào máu\r\nvào các vùng mô bị hoại tử.
\r\n\r\n\r\n\r\nCá được xác định nhiễm bệnh VNN khi có các đặc\r\nđiểm dịch tễ học, triệu chứng lâm sàng và kết quả dương tính thu được từ một\r\ntrong hai phương pháp sau:
\r\n\r\n- Phản ứng RT PCR phát hiện vi rút dương\r\ntính;
\r\n\r\n- Mẫu cắt mô có bệnh tích của vi rút VNN.
\r\n\r\n\r\n\r\n
A.1 Dung dịch Bouin:
\r\n\r\nAxit picric (dung dịch bão\r\nhoà): 750\r\nml
\r\n\r\nFormalin (formaldehyd 37 %)\r\n: 250\r\nml
\r\n\r\nAxit axetic đậm đặc: 50\r\nml
\r\n\r\nA.2 Dung dịch formalin 10 % (có bổ sung\r\n2 % muối)
\r\n\r\nFormalin (formaldehyd 37\r\n%): 100\r\nml
\r\n\r\nDinatri hydro phosphat\r\n(Na2HPO4): 6,5\r\ng
\r\n\r\nNatri hydro phosphat\r\n(NaH2PO4): 0,4\r\ng
\r\n\r\nNatri clorua\r\n(NaCl): 20\r\ng
\r\n\r\nNước: 900\r\nml
\r\n\r\nA.3 Thuốc nhuộm hematoxylin (dung dịch\r\nhematoxylin - Mayer)
\r\n\r\nHematoxylin dạng tinh thể: 1\r\ng
\r\n\r\nNatri\r\niodat: 0,2\r\ng
\r\n\r\nAmoni alum [NH4Al(SO4)2] hoặc kali alum\r\n[KAl(SO4)2]: 50 g
\r\n\r\nAxit\r\naxetic: 1\r\ng
\r\n\r\nCloral\r\nhydrat: 50\r\ng
\r\n\r\nNước: 1000\r\nml
\r\n\r\nHoà tan hematoxylin trong nước, sau đó cho\r\nnatri iodat và amoni alum hoặc kali alum, hoà tan, tiếp tục cho axit\r\naxetic và chloral hydrat rồi lọc qua giấy lọc.
\r\n\r\nBảo quản dung dịch đã pha trong chai tối màu.
\r\n\r\nA.4 Thuốc nhuộm eosin
\r\n\r\nEosin\r\nY: 1\r\ng
\r\n\r\nCồn 70\r\n%: 1\r\nlít
\r\n\r\nAxit axetic\r\nbăng: 5\r\nml
\r\n\r\nThêm từ 2 giọt đến 3 giọt axit axetic vào cồn\r\n70 %. Hoà tan eosin trong cồn, sau đó cho thêm axitaxetic rồi lọc qua giấy lọc.
\r\n\r\nBảo quản dung dịch đã pha trong chai tối màu.
\r\n\r\n\r\n\r\n
[1] Bùi Quang Tề và cộng sự. 1998., Bệnh học\r\nthủy sản.
\r\n\r\n[2] Danayadol, Y., Direkbusarakom, S. and\r\nSupamattaya, K., 1995. Viral nervous necrosis in brownspotted\r\ngrouper, Epinephelus malabaricus, cultured in Thailand. In: Diseases in\r\nAsian Aquaculture II, M. Shariff,
\r\n\r\n[3] Frerichs G.N., Tweedie A.; Starkey W.G.;\r\nRichards R.H., 2000. Temperature, pH, and electrolyte sensitivity, and heat, UV\r\nand disinfectant inactivation of sea bass (Dicentrarchus labrax) neuropathy\r\nnodavirus. Aquaculture. 185: p. 13-24.
\r\n\r\n[4] Fukuda, Y., Nguyen, H.D., Furuhashi, M.,\r\nNakai, T., 1996. Mass mortality of cultured sevenband grouper, Epinephelus\r\nseptemfasciatus, associated with viral nervous necrosis. Fish\r\nPathology. 31: p. 165-170
\r\n\r\n[5] Iwamoto, T., Nakai, T., Mori, K.,\r\nArimoto, M., Furusawa, I., 2000. Cloning of the fish cell line SSN-1 for\r\npiscine nodaviruses. Diseases of Aquatic Organisms. 43: p. 81- 89.
\r\n\r\n[6] Johansen, R., Grove, S., Svendsen, A.K.,\r\nModahl, I., Dannevig, B.H, A., 2004. Sequential study of pathological findings\r\nin Alantic halibut, Hippoglossus hippoglossus (L.), throughout one\r\nyear after an acute outbreak of viral encephalopathy and retinopathy. Journal\r\nof Fish Diseases. 27: p. 327-341.
\r\n\r\n[7] Mladineo, I., 2003. The\r\nimmunohistochemical study of nodavirus changes in larval, juvenile and adult\r\nsea bass tissue. Journal Applied Ichthyology. 19: p. 366-370.
\r\n\r\n[8] Mori, K., Mangyoku, T., Iwamoto, T.,\r\nArimoto, M., Tanaka, S., Nakai, T., 2003. Serological relationships among\r\ngenotypic variants of Betanodavirus. Diseases of Aquatic Organisms. 57: p.\r\n19-26.
\r\n\r\n[9] Munday, B.L., Kwang, J., Moody, N., 2002.\r\nBetanodavirus infections of teleost fish: a review. Journal of Fish\r\nDiseases, 25: 127-142.
\r\n\r\n[10] Nishizawa, T., K. Mori, T. Nakai, I. Furusawa, and K. Muroga. 1994. Polymerase chain reaction (PCR) amplification of RNA\r\nof striped jack nervous necrosis virus (SJNNV). Dis. Aquat.\r\nOrg. 18:103-107.
\r\n\r\n[11] Nishizawa, T., Furuhashi, M., Nagai, T.,\r\nNakai, T., Muroga, K., 1997. Genomic classification of fish nodaviruses\r\nby molecular phylogenetic analysis of the coat protein gene. Applied and Environmental\r\nMicrobiology. 64: p. 1633-1636
\r\n\r\n[12] Sohn, S.G. and Park, M.A., 1998. Viral\r\ndiseases of cultured marine fish and shrimp in Korea. Fish Pathology. 33 :\r\np. 189-192.
\r\n\r\n[13] Tanaka, S., Takagi, M., Miyazaki, T.,2004. Histopathological studies on viral nervous necrosis of sevenband grouper, Epinephelus\r\nseptemfasciatus Thunburg, at the grow-out stage. Journal of Fish\r\nDiseases. 27: p. 385-399.
\r\n\r\n[14] Toyohiko Nishizawa, Koh-ichiro Mori,\r\nToshihiro Nakail, Iwao Furusawa, Kiyokuni Muroga. 1994. Polymerase chain\r\nreaction (PCR) amplification of RNA of striped jack nervous necrosis\r\nvirus (SJNNV). Dis. aquat. Org., 18: p. 103-107.
\r\n\r\n[15] Manual of Diagnostic Test for Aquatic\r\nAnimals, 2006. Viral encephalopathy and retinopathy
\r\n\r\nFile gốc của Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8710-2:2011 về bệnh thủy sản – quy trình chẩn đoán – phần 2: bệnh hoại tử thần kinh ở cá biển đang được cập nhật.
Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8710-2:2011 về bệnh thủy sản – quy trình chẩn đoán – phần 2: bệnh hoại tử thần kinh ở cá biển
Tóm tắt
| Cơ quan ban hành | Đã xác định |
| Số hiệu | TCVN8710-2:2011 |
| Loại văn bản | Tiêu chuẩn Việt Nam |
| Người ký | Đã xác định |
| Ngày ban hành | 2011-01-01 |
| Ngày hiệu lực | |
| Lĩnh vực | Nông nghiệp |
| Tình trạng | Hết hiệu lực |