Lời nói đầu
\r\n\r\nTCVN 8710-1:2011 do Cục Thú y biên soạn, Bộ\r\nNông nghiệp và Pháttriển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất\r\nlượngthẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.
\r\n\r\n\r\n\r\n
CẢNH BÁO - Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể\r\nliên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu\r\nchuẩn này không thể đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến\r\nviệc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác\r\nan toàn, sức khỏe thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy\r\nđịnh trước khi sử dụng tiêu chuẩn.
\r\n\r\n\r\n\r\nTiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh\r\ncòi do vi rút Penaeus Monodon type baculovirus(MBV) gây ra ở tôm.
\r\n\r\n\r\n\r\nTrong tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ và định\r\nnghĩa sau đây:
\r\n\r\nBệnh còi do vi rút trên tôm (monodon\r\ntype baculovirus disease)
\r\n\r\nBệnh truyền nhiễm nguy hiểm gây ra bởi vi rút\r\nthuộc giống Baculovirus. Vi rút có dạng hình que, có axit nuleic là\r\nADN mạch đôi, thuộc nhóm có thể ẩn.
\r\n\r\nCHÚ THÍCH: Hiện nay đã có hai chủng vi rút được\r\nnghiên cứu và mô tả: MBV từ tôm Penaeus monodon vùng Thái Bình\r\nDương,có cấu trúc chính (nucleocapsid): (42 nm ± 3 nm) x (246 nm ± 15 nm) và vi\r\nthể vi rút (virion) có kích thước (75 nm ± 4 nm) x (324 nm ± 33 nm). Một\r\nchủng khác được phân lập trên tôm Penaeus plebejus, P. monodon, P.\r\nmerguiensis ở Úc cũng có cấu trúc tương tự MBV ở Ấn Độ, Thái Bình Dương có\r\ncấu trúc chính (nuleocapsid): (45 nm đến 52 nm) x (260 nm đến 300 nm)\r\nvà vi thể vi rút (virion) có kích thước 60 nm x 420 nm.
\r\n\r\n\r\n\r\n\r\n\r\n3.1.1 Dịch tễ học
\r\n\r\nĐặc điểm phân bố: MBV đã trở thành bệnh dịch\r\nđộng vật thủy sản trên các loài tôm thuộc họPeenaeidae.
\r\n\r\nBệnh lây lan thông qua các cá thể bị nhiễm bệnh\r\ntrong ao, bể do tôm ăn thức ăn có chứa mầm bệnh, do dụng cụ đựng thức ăn bị nhiễm\r\nhoặc qua vật chủ trung gian như copepoda, tôm, cua, ghẹ... hoặc các loài chim\r\nmang mầm bệnh MBV vào vùng nuôi.
\r\n\r\nGiai đoạn cảm nhiễm: tất cả các giai đoạn ngoại\r\ntrừ trứng và ấu trùng Naupli, tỉ lệ cảm nhiễm từ 1 % trên tôm tự nhiên, có thể\r\nlên đến 100 % trong các trại sản xuất giống.
\r\n\r\n3.1.2 Triệu chứng lâm sàng
\r\n\r\nGiai đoạn ấu trùng biến thái (zoea, mysis) và\r\ngiai đoạn đầu của tôm giống (postlarvae) bị cảm nhiễmMBV nặng có thể quan sát\r\nthấy ruột giữa có màu sắc nhợt nhạt, do sự xuất hiện của các thể ẩn và các mảnh\r\nvụn tế bào trong phân.
\r\n\r\nTôm giống nhiễm nặng thường yếu, bơi lội lờ đờ,\r\ncơ thể đổi màu xanh lơ hay xanh đen, sinh trưởng chậm, chuyển giai đoạn\r\nkhông đều, tỉ lệ chết tích luỹ có thể lên đến 90 % nếu môi trường không ổn định.
\r\n\r\nTôm thương phẩm thường phân đàn, có thể sau 3\r\ntháng đến 4 tháng nuôi vẫn có kích thước rất nhỏ gọi là “tôm kim”.
\r\n\r\nCơ quan kí sinh: tế bào biểu bì của cơ quan\r\ngan tụy và ruột giữa.
\r\n\r\n3.2.1 Phương pháp PCR
\r\n\r\n3.2.1.1 Nguyên tắc
\r\n\r\nPhương pháp PCR dựa trên hoạt động của ADN\r\npolymerase tổng hợp nên mạch mới từ mạch khuôn, có sự tham ra của mồi, bốn\r\nloại gồm adenin (dATP), thymin (dTTP), guanin (dGTP), cytocin (dCTP), dùng\r\nđể khuếch đại đoạn ADN đích thông qua các chu kì luân nhiệt. Để thực hiện phản ứng\r\nkhuếch đại ADN đích gồm 3 quá trình: biến tính, bắt cặp và kéo dài mạch, tổng hợp\r\nmạch ADN mới.
\r\n\r\nPhương pháp PCR tổ (nested PCR): là PCR có\r\nhai giai đoạn, giai đoạn đầu dùng cặp mồi ngoài (gọi là PCR vòng ngoài) để\r\nkhuếch đại một đoạn ADN đích. Sau đó dùng sản phẩm PCR vòng ngoài này làm
\r\n\r\nkhuôn cho vào ống PCR có cặp mồi trong (gọi\r\nlà PCR vòng trong) để khuếch đại đoạn ADN trong đoạn ADN đích.
\r\n\r\n3.2.1.2 Thuốc thử và vật liệu thử
\r\n\r\nChỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân\r\ntích và sử dụng nước cất hai lần đã khử ion hoặc nước cóđộ tinh khiết tương\r\nđương không có ARNase, trừ khi có quy định khác.
\r\n\r\n- Dung dịch đệm TE (Tris - EDTA)
\r\n\r\nChuẩn bị dung dịch chứa Tris [tris\r\n(hydroxymetyl) aminometan] 10 mM và EDTA 1 mM, dùng axitclohydric (HCl) để chỉnh\r\npH 7,6.
\r\n\r\n- Dung dịch EDTA (etylen diamin tetra axetic)\r\n0,5 M
\r\n\r\nHòa tan 93,05 g EDTA trong 350 mL nước, chỉnh\r\npH 8,0 bằng dung dịch NaOH nồng độ 4 M. Thêm nước cho đủ 500 mL. Hấp vô trùng ở\r\n121 oC trong 15 min. Bảo quản ở nhiệt độ phòng
\r\n\r\n- Pha dung dịch TBE 1 X
\r\n\r\nDung dịch đệm TBE đậm đặc 10 lần (Tris - axit\r\nboric - EDTA 10X)
\r\n\r\nHòa tan 108 g Tris và 55 g axit boric trong\r\n600 mL nước. Thêm 40 mL EDTA 0,5 M và thêm nước cho đủ 1 lít. Hấp vô trùng\r\nở 121 oC trong 15 min, bảo quản ở nhiệt độ phòng. Khi sử dụng thêm 900\r\nml nước vào 100 ml dung dịch TBE gốc (10X) thành dung dịch 1X.
\r\n\r\n- Dung dịch đệm tải mẫu ADN đậm đặc 6 lần\r\n(loading dye 6X)
\r\n\r\nChuẩn bị dung dịch gồm Tris-HCl 10 mM (pH\r\n7,6); bromophenol blue 0,03 %; xylen xyanol FF 0,03 %; glycerol 60 % và EDTA 60\r\nmM (sử dụng dung dịch EDTA 0,5 M). Bảo quản ở nhiệt độ -20 oC.
\r\n\r\n- Cồn 95 %
\r\n\r\n- Bộ Kít tách chiết ADN
\r\n\r\n- Thang chuẩn ADN (ADN marker) gồm có các\r\nthang 100 bp; 200 bp; 300 bp; 400 bp; 500 bp; 1000 bp.
\r\n\r\n- Etidi bromua (EtBr)
\r\n\r\n- Agaroza.
\r\n\r\n3.2.1.3 Thiết bị, dụng cụ
\r\n\r\nSử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử\r\nnghiệm chẩn đoán bệnh. Yêu cầu cơ bản là phòng thử nghiệm cần có các khu vực\r\nriêng biệt để thao tác tách chiết ADN, tiến hành phản ứng PCR và điện di đọc\r\nkết quả.
\r\n\r\n- Tủ lạnh;
\r\n\r\n- Tủ lạnh âm sâu, có thể hoạt động ở nhiệt độ\r\n-20 ºC;
\r\n\r\n- Máy li tâm, có thể hoạt động với vận tốc\r\n13000 r/min.
\r\n\r\n- Tủ ấm, có thể hoạt động ở nhiệt độ\r\n95 oC.
\r\n\r\n- Nồi cách thủy hay block nhiệt khô, , có thể\r\nhoạt động ở nhiệt độ 95 ºC;
\r\n\r\n- Máy lắc trộn vortex;
\r\n\r\n- Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,1\r\nmg;
\r\n\r\n- Đèn cồn;
\r\n\r\n- Khay hay hộp đựng đá lạnh;
\r\n\r\n- Micropipet đơn kênh có dải từ 0,5 µl đến 10\r\nµl, từ 2 µl đến 20 µl, từ 10 µl đến 100 µl, từ 100 µl đến 1000 µl;
\r\n\r\n- Giá cho ống eppendof có kích thước 0,2 ml\r\nvà 1,5 ml;
\r\n\r\n- Bộ kéo panh vô trùng, chày nghiền mẫu, bút\r\nđánh dấu, sổ ghi chép;
\r\n\r\n- Hộp đựng giấy thấm, găng tay, khẩu trang;
\r\n\r\n- Hộp đựng đầu típ micropipet các loại;
\r\n\r\n- Máy luân nhiệt (máy PCR);
\r\n\r\n- Bếp điện hoặc lò vi sóng;
\r\n\r\n- Ống đong, dung tích 100 ml; 500 ml; 1000\r\nml;
\r\n\r\n- Bình nón bằng thủy tinh chịu nhiệt, dung\r\ntích 250 ml;
\r\n\r\n- Bộ điện di gồm bộ nguồn và máng chạy điện\r\ndi;
\r\n\r\n- Buồng đổ gel;
\r\n\r\n- Bàn đọc gel (UV);
\r\n\r\n- Giấy parafin.
\r\n\r\n3.2.1.4 Lấy mẫu
\r\n\r\nTôm bố mẹ: lấy mẫu phân tôm bố mẹ.
\r\n\r\nTôm giống (lớn hơn postlavare 8, hay hậu ấu\r\ntrùng lớn hơn 8 ngày tuổi): lấy một phần khối gan tụy, lấy khoảng 10 con đến\r\n15 con.
\r\n\r\nTôm nhỏ hơn tôm giống (nhỏ hơn postlavare 8):\r\nlấy phần đầu khoảng 10 con đến 15 con. Ấu trùng biến thái: lấy cả con, khoảng\r\n50 con.
\r\n\r\nLượng mẫu lấy để tách chiết ADN khoảng 20 mg,\r\ncó thể dùng tôm còn sống hoặc mẫu tôm, mẫu phân cố định trong cồn 95 % để\r\ntách chiết ADN.
\r\n\r\n3.2.1.5 Cách tiến hành
\r\n\r\n3.2.1.5.1 Tách chiết ADN
\r\n\r\nCHÚ THÍCH: Hiện nay có rất nhiều thuốc thử và\r\nbộ kít thương mại tiện lợi cho việc tách chiết ADN (QiaGen, Promega…). Người sử\r\ndụng có thể lựa chọn bộ kít thích hợp và an toàn theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
\r\n\r\nVí dụ quy trình tách chiết ADN bằng dung dịch\r\nđệm chiết tách (Lysis Buffer) (kít IQ2000MBV): Cho mẫu vào ống Eppendorf\r\n1,5 ml.
\r\n\r\nNếu mẫu cố định trong cồn 95 %, cần làm khô cồn\r\nbằng cách: đổ cồn và dốc ngược trên tờ giấy lọc, để khô tự nhiên.
\r\n\r\nCho vào ống Eppendorf có chứa mẫu khoảng 100\r\nµl đến 200 µl dung dịch tách chiết, nghiền nhỏ và mịn bằng chày nghiền, sau đó\r\nthêm vào khoảng 300 µl đến 400 µl dung dịch tách chiết và nghiền tiếpđến khi\r\nnhuyễn.
\r\n\r\nỦ mẫu ở nhiệt độ 95 oC trong 10 min, ly\r\ntâm 12000 r/min trong thời gian 10 min.
\r\n\r\nChuyển 200 µl phần dịch nổi sang ống\r\nEppendorf mới có chứa 400 µl cồn 95 %, trộn trên máy lắc trộn vortex hoặc\r\nlắc nhẹ.
\r\n\r\nLy tâm 12000 r/min trong thời gian 5 min, sau\r\nđó loại bỏ cồn và làm khô mẫu.
\r\n\r\nHòa tan ADN bằng nước tinh khiết hoặc dung dịch\r\nđệm TE 1X với lượng khoảng từ 50 µl đến 200 µl tùy thuộc vào lượng ADN tách chiết\r\nđược.
\r\n\r\nCẢNH BÁO AN TOÀN: Tách chiết axít nucleic phụ\r\nthuộc vào việc phân giải hay hoà tan của các mô và sự phân tách của axít\r\nnucleic từ hỗn hợp kết cấu phức tạp. Hầu như các quy trình đều sử dụng hoá chất\r\nnguy hiểm và có khả năng gây hại nếu thao tác không cẩn thận. Do vậy\r\nnên tránh tiếp xúc trực tiếp với da và hít phải hơi của các hoá chất này.\r\nLuôn luôn đeo găng tay, khẩu trang, mặc quần áo bảo hộ khi thực hiện các thao\r\ntác này.
\r\n\r\n3.2.1.5.2 Tiến hành phản ứng PCR
\r\n\r\n3.2.1.5.2.1 Cặp mồi ngoài sử dụng trong phản ứng\r\nPCR
\r\n\r\nPhản ứng khuếch đại được thực hiện trong máy\r\nluân nhiệt theo phương pháp PCR tổ (nested PCR) khuếch đại ADN đặc hiệu của\r\nvi rút MBV, sử dụng cặp mồi MBV1.4 F/R và MBV1.4 NF/NR (Bảng 1).
\r\n\r\n| \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n MBV 1.4F \r\n | \r\n \r\n 5'-CGA- TTC-CAT-ATC-GGC-CGA-ATA-3' \r\n | \r\n
| \r\n MBV 1.4R \r\n | \r\n \r\n 5'-TTG-GCA-TGC-ACT-CCC-TGA-GAT-3' \r\n | \r\n
| \r\n MBV 1.4NF \r\n | \r\n \r\n 5'-TCC-AAT-CGC-GTC-TGC-GAT-ACT-3' \r\n | \r\n
| \r\n MBV 1.4NR \r\n | \r\n \r\n 5'-CGC-TAA-TGG-GGC-ACA-AGT-CTC-3' \r\n | \r\n
Cặp mồi MBV 1.4 F/R dùng để khuếch đại đoạn\r\nADN của vi rút MBV có kích thước 533 bp. Cặp mồi MBV 1.4NF /NR dùng để khuếch\r\nđại đoạn ADN có kích thước 361 bp, nằm trong đoạn ADN sản phẩm bước 1 của\r\nvi rút MBV.
\r\n\r\nChuẩn bị mồi:
\r\n\r\n- Mồi ở trạng thái đông khô phải được ly tâm\r\nngắn để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Lần đầu tiên nên\r\ndùng đệm TE để hoàn nguyên mồi ở nồng độ 200 pmol/µL làm gốc.
\r\n\r\n- Mồi được sử dụng ở nồng độ 20 pmol/µL: pha\r\nloãng mồi gốc bằng nước không có nuclease (10 µl mồi gốc và 90 µl nước).
\r\n\r\n3.2.1.5.2.2 Chuẩn bị phản ứng
\r\n\r\nTùy theo điều kiện phòng thử nghiệm, chọn lựa\r\nhỗn hợp Mix phản ứng cho phù hợp và sử dụng theohướng dẫn của nhà sản xuất.
\r\n\r\nHỗn hợp phản ứng bước 1 và bước 2 được chuẩn\r\nbị trong 1 ống Eppendorf dựa trên tổng số mẫu cần chẩn đoán, cộng thêm một\r\nmẫu đối chứng dương và một mẫu đối chứng âm. Sau đó hút 22,5 µl hỗn hợp phản\r\nứng vào ống Eppendorf 0,2 ml; ghi kí hiệu mẫu lên nắp ống Eppendorf, chứng\r\ndương và chứng âm.
\r\n\r\n3.2.1.5.2.3 Tiến hành phản ứng PCR vòng ngoài\r\n(bước 1).
\r\n\r\nThêm 2,5 µl ADN mạch khuôn (tách chiết được)\r\nvào ống PCR chứa sẵn 22,5 µl hỗn hợp phản ứngPCR (thành phần gồm: KCl 50 mM;\r\nTris/HCl 10 mM, pH 9; Triton X-100 0,1 %; mỗi dNTP có nồng độ0,2 mM; MgCl2 1,5\r\nmM; mỗi mồi MBV1.4F và MBV1.4R có nồng độ 0,25 µM; 1,25 U Taq ADNpolymerase và\r\nnước cho đủ thể tích) để được hỗn hợp PCR với tổng thể tích 25 µl.
\r\n\r\nCó thể sử dụng thành phần thuốc thử riêng lẻ\r\nhay sử dụng hỗn hợp phản ứng thương mại sao cho đảm bảo nồng độ cuối cùng\r\ncủa các thành phần như trên, ví dụ sử dụng hỗn hợp phản ứng Go Taq Green\r\nMaster Mix của Promega, 2X có thành phần 2X green Go Taq Reaction Buffer (pH\r\n8,5); 400 µM dATP; 400 µM dGTP; 400 µM dTTP; 400 µM dCTP; 3 mM MgCl2; Taq\r\nADN polymerase, và chất đệm tải mẫu (yellow dye và blue dye) nên khi chạy\r\ngel không cần thêm chất đệm tải mẫu (loading dye).
\r\n\r\nHỗn hợp phản ứng PCR vòng ngoài (bước 1), sử\r\ndụng hỗn hợp phản ứng Go Taq Green Master Mixcủa Promega, 2X như trong Bảng 2.
\r\n\r\n| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Promega Gotag Green Master Mix, 2X \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n MBV1.4F mồi \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n MBV1.4R mồi \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n ADN mạch khuôn \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Nước \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
Sau khi pha hỗn hợp cho mỗi phản ứng đặt vào\r\nmáy luân nhiệt.
\r\n\r\nChu kì luân nhiệt của phản ứng PCR bước 1 được\r\nnêu trong Bảng 3.
\r\n\r\n| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Biến tính \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Bắt cặp \r\n | \r\n \r\n | \r\n |
| \r\n Kéo dài mạch \r\n | \r\n \r\n | \r\n |
| \r\n Kéo dài mạch \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
3.2.1.5.2.4 Tiến hành phản ứng PCR vòng trong\r\n(bước 2)
\r\n\r\nThêm 2,5 µl ADN mạch khuôn (sản phẩm bước 1)\r\nvào ống PCR chứa sẵn 22,5 µl hỗn hợp phản ứng PCR (thành phần gồm: KCl 50 mM;\r\nTris/HCl 10 mM, pH 9; Triton X-100 0,1 %; mỗi dNTP có nồng độ0,2 mM; MgCl2 1,5\r\nmM; mỗi mồi MBV1.4F và MBV1.4R có nồng độ 0,25 µM; 1,25 U Taq ADNpolymerase và\r\nnước cho đủ thể tích) để được hỗn hợp PCR với tổng thể tích 25 µl.
\r\n\r\nCó thể sử dụng thành phần hoá chất riêng lẻ\r\nhay sử dụng hỗn hợp phản ứng thương mại vẫn đảm bảo nồng độ cuối cùng của các\r\nthành phần như trên, sử dụng cặp mồi MBV1.4NF và MBV1.4NR.
\r\n\r\nHỗn hợp phản ứng PCR bước 2, sử dụng hỗn hợp\r\nphản ứng Go Taq Green Master Mix của Promega, 2X như trong Bảng 4.
\r\n\r\n| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Promega Gotag Green Master Mix, 2X \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n MBV1.4NF mồi \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n MBV1.4NR mồi \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n ADN sản phẩm bước 1 \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Nước \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
Sau khi pha hỗn hợp cho mỗi phản ứng đặt vào\r\nmáy luân nhiệt. Chu kì luân nhiệt của phản ứng PCR
\r\n\r\nbước 2 được nêu trong Bảng 5.
\r\n\r\n| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Biến tính \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Bắt cặp \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Kéo dài mạch \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Kéo dài mạch \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
CHÚ Ý: Mẫu và nguyên liệu cho phản ứng PCR cần\r\nđặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng.
\r\n\r\n3.2.1.5.3 Chạy điện di
\r\n\r\n3.2.1.5.3.1 Chuẩn bị bản gel
\r\n\r\nPha thạch với nồng độ agarose từ 1,5 % đến 2\r\n% bằng dung dịch đệm TBE 1X hoặc TAE 1X vào bình nón 250 ml, lắc cho tan.
\r\n\r\nSau đó cho vào lò vi sóng đun đến sôi, khi\r\nnhiệt độ giảm xuống khoảng 40 oC đến 50 oC thì cho vào 5 µl etidi\r\nbromua/100 ml. Lắc nhẹ tránh tạo bọt để etidi bromua tan đều.
\r\n\r\nChuẩn bị khuôn đổ thạch, đặt lược vào khuôn,\r\nrồi đổ thạch vào khuôn. Tiến hành đổ vào bản gel, không nên đổ bản gel dày quá\r\n0,8 cm.
\r\n\r\nKhi bản gel đông lại thì tiến hành gỡ lược khỏi\r\nbản gel.
\r\n\r\nChuyển bản gel vào máng điện di, đổ dung dịch\r\nđệm (TBE 1X hoặc TAE 1X) cùng loại với dung dịch agarose đã đun) vào máng điện\r\ndi cho tới khi ngập bản gel.
\r\n\r\n3.2.1.5.3.2 Điện di
\r\n\r\nHút 10 µl sản phẩm PCR nhỏ vào một giếng trên\r\nbản gel.
\r\n\r\nKhi thực hiện điện di, chạy kèm theo AND\r\nmarker để dự đoán kích thước sản phẩm khuếch đại. Hút 10 µl thang ADN vào một\r\ngiếng trên bản gel.
\r\n\r\nĐiện di ở hiệu điện thế 100 volt đến 150 volt\r\n(quan sát thấy bóng khí nổi lên từ hai phía điện cực của máy điện di sau khi nối\r\nđiện). Khi quan sát thấy màu xanh đậm của thuốc nhuộm cách giếng khoảng 2/3 chiều\r\ndài bảng thạch agaroza, dừng quá trình điện di.
\r\n\r\nCHÚ Ý: Trong trường hợp Master Mix không có sẵn\r\nđệm tải mẫu thì khi tiến hành điện di nhỏ 2 µl loading dye 6X lên giấy\r\nparafin, hút 10 µl sản phẩm PCR ra, nhỏ vào và trộn đều, sau đó lấy khoảng 10\r\nµl nhỏ vào một giếng trên bản gel.
\r\n\r\n3.2.1.5.4 Đọc kết quả
\r\n\r\nSau khi điện di xong, đọc kết quả trên bàn đọc\r\nUV, đọc kết quả với tia UV bước sóng 302 nm.
\r\n\r\nĐối chiếu các vạch sáng của mẫu với các vạch\r\nsáng từ thang ADN, mẫu kiểm chứng dương tính và mẫu kiểm chứng âm tính để đưa\r\nra kết luận.
\r\n\r\n| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n |
| \r\n Mẫu kiểm chứng dương tính \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n Hỗn hợp phản ứng PCR tốt \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n Đạt yêu cầu \r\n | \r\n |
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n Mẫu kiểm chứng dương tính hỏng,\r\n enzym hỏng \r\n | \r\n |
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n Không đạt yêu cầu \r\n | \r\n |
| \r\n Mẫu kiểm chứng âm tính \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n Không ngoại nhiễm \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n Bị ngoại nhiễm \r\n | \r\n |
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n \r\n | \r\n |
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n \r\n | \r\n |
| \r\n Mẫu \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n Dương tính MBV \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n Dương tính với MBV \r\n | \r\n |
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n Âm tính với MBV \r\n | \r\n |
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n Không chấp nhận kết quả. Phân tích lại mẫu \r\n | \r\n |
Kết quả mẫu thử dương tính khi: Xuất hiện vạch\r\nsáng có kích thước bằng kích thước giống mẫu đối chứng dương có kích thước\r\n533 bp bước 1 và 361 bp bước 2 hoặc chỉ có vạch 361 bp. Thang ADN phân vạch\r\nrõ ràng, mẫu đối chứng âm không có vạch sáng.
\r\n\r\n Kết quả mẫu thử âm tính khi: Không có vạch\r\nsáng kích thước 361 bp. Không có vạch sáng của mẫu đối chứng âm tính, có vạch\r\nsáng mẫu đối chứng dương tính. Thang ADN phân vạch rõ ràng.
\r\n\r\n3.2.2 Phương pháp mô học
\r\n\r\n3.2.2.1 Thuốc thử và vật liệu thử
\r\n\r\n- Dung dịch Davidson (xem A.1).
\r\n\r\n- Thuốc nhuộm hematoxylin (xem A.2).
\r\n\r\n- Thuốc nhuộm eosin (xem A.3).
\r\n\r\n- Dung dịch xanh malachit (MG) 0,5 % (xem\r\nA.4).
\r\n\r\n- Xylen.
\r\n\r\n- Cồn 70 %, 90 % và cồn tuyệt đối.
\r\n\r\n- Parafin.
\r\n\r\n- Keo dán, ví dụ Bom Canada.
\r\n\r\n3.2.2.2 Thiết bị, dụng cụ
\r\n\r\nSử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm\r\nchẩn đoán bệnh và cụ thể như sau:
\r\n\r\n- Kính giải phẫu
\r\n\r\n- Bộ đồ giải phẫu gồm các dụng cụ panh, rùi\r\nnhọn, giải phẫu kéo các loại, lam kính và lamen
\r\n\r\n- Lọ nhỏ cố định mẫu
\r\n\r\n- Bình rót parafin
\r\n\r\n- Bộ phận làm lạnh mẫu
\r\n\r\n- Máy cắt mẫu microtome
\r\n\r\n- Nồi nước có chỉnh nhiệt độ
\r\n\r\n- Tủ ấm hoặc bàn sấy mẫu
\r\n\r\n- Kính hiển vi quang học
\r\n\r\n- Cassete
\r\n\r\n- Khung đúc mẫu.
\r\n\r\n3.2.2.3 Lấy mẫu
\r\n\r\nThu những mẫu tôm có biểu hiện bệnh có dấu hiệu\r\nkhông bình thường, tôm còi, cơ thể yếu, bơi lội lờ đờ, cơ thể đổi màu xanh lơ\r\nhay xanh đen, sinh trưởng chậm, chuyển giai đoạn chậm không đều. Không dùng tôm\r\nchết hoặc tôm bảo quản đá để cắt mô.
\r\n\r\n3.2.2.4 Cách tiến hành
\r\n\r\n3.2.2.4.1 Chẩn đoán bằng phương pháp nhuộm mô\r\ntươi
\r\n\r\nMẫu tôm tiến hành từ hậu ấu trùng 5 ngày tuổi\r\n(postlarvae 5) đến hậu ấu trùng trưởng thành.
\r\n\r\n3.2.2.4.1.1 Mẫu mô gan tụy
\r\n\r\nSố tôm thu để nhuộm tươi đối với tôm ấu trùng\r\nvà tôm giống là từ 30 con đến 50 con, đối với tôm nuôi là từ 5 con đến 10\r\ncon.
\r\n\r\nĐặt tôm lên lam kính, nhỏ một giọt nước muối\r\nsinh lý vừa đủ không làm mẫu khô. Dùng kính giải phẫuquan sát để lấy gan tụy của\r\ntôm.
\r\n\r\nDùng hai kim giải phẫu nhọn, kim bên trái giữ\r\nphần mắt và anten, kim bên phải đặt lên đốt bụng thứ nhất. Từ từ tách phần\r\nbụng ra khỏi phần ngực, gan tụy lộ ra ngoài dính với phần bụng. Tách lấy phần\r\ngan tụy.
\r\n\r\nNhỏ giọt xanh malachit (MG) 0,5 % lên khối\r\ngan tụy, dùng lamen ép mỏng quan sát dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại\r\n100X, 400X.
\r\n\r\nĐọc kết quả:
\r\n\r\nTế bào bình thường: nhân và tế bào chất bắt\r\nmàu MG đậm hơn.
\r\n\r\nTế bào mang mầm bệnh MBV: tế bào gan tụy\r\nphình to, trong nhân có từ một đến nhiều thể ẩn hình cầu có kích thước\r\nkhoảng 0,1 µm đến 20 µm. Các thể ẩn không bắt màu hoặc bắt màu nhạt hơn,\r\nsáng rõ hơn.
\r\n\r\n3.2.2.4.1.2 Mẫu phân
\r\n\r\nCHÚ THÍCH: Ưu điểm của phương pháp là có thể\r\nkiểm tra cả đối với tôm giống, tôm có kích thước lớn, tôm bố mẹ mà khônggây chết\r\ntôm, vẫn có thể loại bỏ được những đàn tôm mang mầm bệnh MBV.
\r\n\r\nMẫu phân thu trong hồ bể nuôi, sau khi dải\r\nphân lắng xuống đáy hồ.
\r\n\r\nMẫu phân thu đặt trên lam, nhỏ giọt MG 0,5 %,\r\nép lamen và quan sát dưới kính hiển vi quang học. Nếu tôm nhiễm bệnh sẽ\r\nquan sát thấy các thể ẩn hình cầu có tính khúc xạ nên sáng rõ hơn các thể hình\r\ncầu khác thấy trong phân.
\r\n\r\nĐánh giá cường độ cảm nhiễm MBV theo 3 mức:
\r\n\r\nMức thấp (+): tổng số nhân tế bào gan tuỵ bị\r\nnhiễm MBV nhỏ hơn 30 %.
\r\n\r\nMức trung bình (++): tổng số nhân tế bào gan\r\ntuỵ bị nhiễm MBV từ 30 % đến 60 %. Mức cao (+++): tổng số nhân tế bào gan\r\ntuỵ bị nhiễm MBV lớn hơn 60 %.
\r\n\r\nTỉ lệ cảm nhiễm là số tôm nhiễm bệnh\r\ntrên tổng số tôm kiểm tra
\r\n\r\n3.2.2.4.2 Chẩn đoán bằng phương pháp cắt mô
\r\n\r\n3.2.2.4.2.1 Chuẩn bị mẫu
\r\n\r\nCố định mẫu trong dung dịch Dadvison. Đối với\r\nấu trùng hoặc tôm hậu ấu trùng có thể cố định cả con trong dung dịch Davidson từ\r\n12 h đến 24 h. Số tôm thu từ 30 con đến 50 con mỗi bể. Sau đó cố định trong cồn\r\n70 % ở nhiệt độ phòng.
\r\n\r\nĐối với tôm lớn cố định bằng cách lấy tôm sống\r\ncắt giữa phần đầu ngực và bụng, giữ phần đầu ngực lại (trong đó có chứa\r\ngan tụy), dùng dung dịch Davidson tiêm vào gan tuỵ và vùng xung quanh gan tuỵ. Lượng\r\nthuốc dùng từ 0,1 ml đến 10 ml (thay đổi tuỳ kích thước tôm), sau đó cho vào lọ\r\ncó chứa dung dịch Davidson. Số tôm thu từ 5 con đến 10 con một ao. Nếu mẫu lớn\r\ncần phải cắt nhỏ, chiều dài mẫu không quá 3 cm. Tỷ lệ mẫu và dung dịch cố\r\nđịnh là 1/10, ngâm trong 24 h đến 72 h phụ thuộc vào kích thước của mẫu,\r\nsau đó bảo quản ngay trong cồn 70 % ở nhiệt độ phòng.
\r\n\r\n3.2.2.4.2.2 Khử mẫu cố định
\r\n\r\nNgâm trong cồn 90 % hai lần, trong thời gian\r\n30 min đến 60 min mỗi lần. Sau đó ngâm trong cồn tuyệt đối hai lần, thời\r\ngian 30 min đến 60 min mỗi lần.
\r\n\r\n3.2.2.4.2.3 Làm trong mẫu
\r\n\r\nNgâm sang lọ xylen 1 để trong 30 min đến 60\r\nmin.
\r\nNgâm sang lọ xylen 2 để trong 30 min đến 60 min.
Sau đó ngâm tẩm parafin hai lần, mỗi lần\r\n56 ºC đến 58 ºC trong 1 h.
\r\n\r\nĐúc khuôn: Đặt mẫu đã thấm parafin vào khuôn\r\nđổ parafin tập trung vào một mặt của khuôn để khi cắtđược tốt hơn. Làm lạnh mẫu\r\ntrong bàn lạnh hoặc để trong tủ lạnh.
\r\n\r\n3.2.2.4.2.4 Cắt mẫu
\r\n\r\nCắt gọt khối block parafin vuông, mặt cắt bằng\r\nphẳng, để trên mặt khay đá.
\r\n\r\nĐặt mặt khối block parafin song song với mép\r\nlưỡi dao, cắt chiều dày lát cắt 4 µm đến 5 µm.
\r\n\r\nChọn lát cắt tiêu bản phẳng thả vào nồi nước\r\nnhiệt độ nước 30 ºC đến 35 ºC; sau đó dùng lam kính vớt lát cắt\r\ntiêu bản. Để khô.
\r\n\r\n3.2.2.4.2.5 Nhuộm tiêu bản H&E
\r\n\r\nTẩy parafin bằng cách ngâm trong xylen hai lần,\r\nmỗi lần từ 3 min đến 5 min, sau đó ngâm lần lượttrong cồn tuyệt đối, cồn 90 %\r\nvà cồn 70 %, mỗi lần ngâm từ 3 min đến 5 min rồi đem rửa dưới vòinước chảy từ 3\r\nmin đến 5 min.
\r\n\r\nNgâm trong thuốc nhuộm haematoxylin từ 3 min\r\nđến 5 min sau đó rửa dưới vòi chảy từ 3 min đến 5 min rồi tiếp tục ngâm\r\ntrong thuốc nhuộm eosin từ 1 min đến 2 min.
\r\n\r\nLàm mất nước trong mẫu qua các thang nồng độ\r\ncồn 75 %, cồn 90 % và cồn tuyệt đối, mỗi bước từ 1 min đến 2 min, chuyển\r\nsang xylen hai lần (mỗi lần từ 2 min đến 3 min), gắn lamen bằng keo dán, vídụ\r\nBom Canada. Để khô và soi kính.
\r\n\r\n3.2.2.4.2.6 Đọc kết quả
\r\n\r\nSoi kính hiển vi từ vật kính có độ phóng đại\r\nthấp đến vật kính có độ phóng đại cao (100 X; 400 X, 1000 X).
\r\n\r\nKhi tôm bị bệnh MBV cho thấy một số thể ẩn\r\nhình cầu, bắt màu hồng của eosin, nằm trong nhân tế bào biểu mô gan tuỵ\r\nphình to. Ở những đàn tôm bị nhiễm nặng, trong mỗi nhân tế bào phình to có chứa hàng\r\nchục thể ẩn và có một tỷ lệ lớn những nhân tế bào có chứa thể vùi. Đây chính là\r\ncăn cứ để đánh giá mức độ nhiễm nặng hay nhẹ ở một mẫu tôm nghiên cứu.
\r\n\r\n\r\n\r\nTôm được xác định nhiễm bệnh MBV khi có kết\r\nquả dương tính một trong hai phương pháp sau:
\r\n\r\n- Phản ứng PCR phát hiện vi rút dương tính.
\r\n\r\n- Mẫu mô nhuộm tươi và mẫu cắt mô xuất hiện\r\nthể ẩn của MBV.
\r\n\r\n\r\n\r\n
A.1 Dung dịch Davidson
\r\n\r\nCồn 95 %: 330\r\nml
\r\n\r\nFormalin (formaldehyd 37\r\n%): 220\r\nml
\r\n\r\nAxit axetic đậm đặc: 115\r\nml
\r\n\r\nNước: 335\r\nml
\r\n\r\nA.2 Thuốc nhuộm hematoxylin (dung dịch\r\nhematoxylin - Mayer)
\r\n\r\nHematoxylin dạng tinh thể: 1\r\ng
\r\n\r\nNatri\r\niodat: 0,2\r\ng
\r\n\r\nAmoni alum [NH4Al(SO4)2] hoặc kali alum\r\n[KAl(SO4)2]: 50 g
\r\n\r\nAxit xitric: 1\r\ng
\r\n\r\nCloral\r\nhydrat: 50\r\ng
\r\n\r\nNước: 1000\r\nml
\r\n\r\nHoà tan hematoxylin trong nước, sau đó cho\r\nnatri iodat và amoni alum hoặc kali alum, hoà tan, tiếp tục cho axit\r\nxitric và chloral hydrat rồi lọc qua giấy lọc.
\r\n\r\nBảo quản dung dịch đã pha trong chai tối màu.
\r\n\r\nA.3 Thuốc nhuộm eosin
\r\n\r\nEosin\r\nY: 1\r\ng
\r\n\r\nCồn 70\r\n%: 1\r\nlít
\r\n\r\nAxit axetic\r\nbăng: 5\r\nml
\r\n\r\nThêm từ 2 giọt đến 3 giọt axit axetic vào cồn\r\n70 %. Hoà tan eosin trong cồn, sau đó cho thêm axitaxetic rồi lọc qua giấy lọc.
\r\n\r\nBảo quản dung dịch đã pha trong chai tối màu.
\r\n\r\nA.4 Dung dịch xanh malachit 0,5 %
\r\n\r\nXanh malachit\r\n(MG): 5\r\ng
\r\n\r\nNước: 100\r\nml
\r\n\r\nHoà tan MG trong nước, sau đó lọc qua giấy lọc.
\r\n\r\nBảo quản dung dịch đã pha trong chai tối màu.
\r\n\r\n\r\n\r\n
[1] Belcher C.R. & Young P.R. 1998.\r\nColourimetric PCR-based detection of Monodon baculovirus in whole Penaeus\r\nmonodon postlarvae. J. Virol. Methods, 74, p. 21-29.
\r\n\r\n[2] Đỗ Thị Hoà, Bùi Quang Tề, Nguyễn Hữu\r\nDũng, Nguyễn Thị Muội. 2004. Bệnh học thuỷ sản.
\r\n\r\n[3] Doubrovsky A., P.J.L., Sambhi S.K.,\r\nAtherton J.G. & Lester R.J.G. 1988. Observations on the ultrastructure of\r\nbaculovirus in Australian Penaeus monodon and Penaeus merguiensis.\r\nAust. J. Mar. Freshwater Res. 39: p. 743 - 749.
\r\n\r\n[4] Lightner, D.V., Redman, R.M., Bell, T.A., Observations on the geographic distribution, pathogenesis and morphology of\r\nthe baculovirus from Penaeus monodon fabricius.\r\nAquaculture, 1983. 32: p. 209- 233.
\r\n\r\n[5] Lightner DV (ed). A handbook of pathology\r\nand diagnostic procedures for diseases of penaeid shrimp. World Aquaculture\r\nSoc., Baton Roug. 1996.
\r\n\r\n[6] Lester R.J.G., D.A., Paynter J.L., Sambhi\r\nS.K. & Atherton J.G, Light and electron microscope evidence of baculovirus\r\ninfection in the prawn Penaeus plebejus. Dis. Aquat. Org, 1987. 3: p.\r\n217 - 219.
\r\n\r\n[7] Leobert D. de la Pena , C.R.L.P., Corina\r\nBelle R. Villar, Milagros G. Paner Geimbo C. Capulos, Prevalence of monodon\r\nbaculovirus (MBV) in wild shrimp Penaeus monodon in the Philippines. Aquaculture 2008. 285 p. 19-22.
\r\n\r\n[8] Oanh, D.T.H., Phuong, N.T., Presto, N.,\r\nHodgson, R.,Walker, P., , Prevalence of White Spot Syndrome virus (WSSV) and Monodon\r\nbaculovirus (MBV infection in Penaeus monodonpostlarvae in Vietnam. Walker, P., Lester, R., Bondad Reantaso, M.G., 2005. Diseases in Asian Aquaculture\r\nV. Fish Health Section: p. 395-404.
\r\n\r\n[9] OIE, Manual of diagnostic tests for\r\nAquatic animals 2006.
\r\n\r\nFile gốc của Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8710-1:2011 về bệnh thủy sản – quy trình chẩn đoán – phần 1: bệnh còi do vi rút ở tôm đang được cập nhật.
Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8710-1:2011 về bệnh thủy sản – quy trình chẩn đoán – phần 1: bệnh còi do vi rút ở tôm
Tóm tắt
| Cơ quan ban hành | Đã xác định |
| Số hiệu | TCVN8710-1:2011 |
| Loại văn bản | Tiêu chuẩn Việt Nam |
| Người ký | Đã xác định |
| Ngày ban hành | 2011-01-01 |
| Ngày hiệu lực | |
| Lĩnh vực | Nông nghiệp |
| Tình trạng | Còn hiệu lực |