TIÊU CHUẨN VIỆT\r\nNAM

TCVN\r\n8677-1:2011

THỨC\r\nĂN CHĂN NUÔI – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG AXIT BÉO –

PHẦN\r\n1: PHƯƠNG PHÁP CHUẨN BỊ METYL ESTE

Animal feeding stuffs\r\n– Determination of the content of fatty acids –

Part 1: Preparation\r\nof methy esters

Lời nói đầu

TCVN 8677-1:2011 hoàn toàn tương đương với\r\nISO/TS 17764-1:2002;

TCVN 8677-1:2011 do Cục Chăn nuôi biên soạn,\r\nBộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị. Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường\r\nChất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

THỨC ĂN CHĂN NUÔI –\r\nXÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG AXIT BÉO –

PHẦN 1: PHƯƠNG PHÁP\r\nCHUẨN BỊ METYL ESTE

Animal feeding stuffs\r\n– Determination of the content of fatty acids –

Part 1: Preparation\r\nof methy esters

1. Phạm vi áp dụng

Bộ ISO/TS 17764 qui định các phương pháp định\r\nlượng các axit béo riêng rẽ và tổng hàm lượng axit béo (axit béo có thể rửa\r\ngiải).

Tiêu chuẩn này qui định hai phương pháp chuẩn\r\nbị metyl este của các axit béo từ dầu mỡ động thực vật và các hỗn hợp axit béo\r\ntừ các nguyên liệu thô dùng trong thức ăn chăn nuôi hỗn hợp, các axit béo có\r\nnguồn gốc từ các chất chiết chất béo của thức ăn chăn nuôi, bao gồm các chất\r\nbéo và các hỗn hợp axit béo chứa axit butyric.

Phương pháp bo trifluoride (BF₃)\r\nlà phương pháp chung liên quan đến việc chuẩn bị metyl este của các axit béo có\r\ntừ sáu nguyên tử C trở lên, có nguồn gốc từ chất béo, dầu và axit béo tự do.

Phương pháp KOH/HCl liên quan đến việc chuẩn\r\nbị metyl este của axit béo có từ bốn nguyên tử C trở lên. Phương pháp này cũng\r\ncó thể được dùng để định lượng các axit béo có chiều dài chuỗi ngắn hơn mười\r\nnguyên tử C trong các hỗn hợp axit béo tự do.

Các metyl este tạo thành có thể được sử dụng\r\nđể phân tích sắc ký khí-lỏng (GLC).

CHÚ THÍCH 1: Các chất không xà phòng hóa\r\nkhông loại bỏ được, nếu có mặt với một lượng đáng kể, thì sẽ gây nhiễu phép\r\nphân tích sắc khí.

CHÚ THÍCH 2: Tiêu chuẩn ISO/TS 17764-2 mô tả\r\nviệc áp dụng sắc ký khí với cột mao quản và detector ion hóa ngọn lửa để xác\r\nđịnh hàm lượng axit béo trong một loại chất béo bằng cách sử dụng các metyl\r\neste của axit béo thu được theo phương pháp qui định trong tiêu chuẩn này.

2. Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho\r\nviệc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì\r\náp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố\r\nthì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 4331:2001 (ISO 6492:1999), Thức ăn\r\nchăn nuôi – Xác định hàm lượng chất béo.

TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987), Nước dùng\r\nđể phân tích trong phòng thí nghiệm – Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử.

TCVN 6128:1996 (ISO 661:1989), Dầu mỡ động\r\nvật và thực vật – Chuẩn bị mẫu thử.

3. Chiết chất béo

3.1. Yêu cầu chung

Chiết chất béo để xác định hàm lượng axit béo\r\ncó thể xà phòng hóa có trong thức ăn chăn nuôi hoặc thức ăn hỗn hợp phù hợp với\r\nphân loại thức ăn chăn nuôi như mô tả trong TCVN 4331:2001 (ISO 6492:1999) với\r\nnhững sửa đổi sau đây:

3.2. Mẫu loại A

Tiến hành chiết chất béo theo 9.5.1 của TCVN 4331\r\n(ISO 6492).

Làm bay hơi dung môi bằng thiết bị cô quay\r\ntrên nồi cách thủy ở nhiệt độ không quá 40^oC. Sau đó làm khô phần\r\ncặn 2h trong tủ sấy chân không ở 40 ^oC ± 2 ^oC.

3.3. Mẫu loại B

Chiết chất béo theo hai bước. Bước thứ nhất,\r\ntiến hành theo 9.5.1 của TCVN 4331 (ISO 6492), xử lý phần mẫu thử theo 9.3 của\r\nTCVN 4331 (ISO 6492) như mẫu loại A.

Thu lấy phần chiết chất béo vào bình khô. Để cho\r\ndung môi bay hết khỏi phần cặn bằng cách để ống chiết phơi ra ngoài không khí.

Tiến hành thủy phân phần cặn theo 9.4 của\r\nTCVN 4331 (ISO 6492).

Sau khi thủy phân, làm khô phần cặn trong ống\r\nchiết 60 min trong tủ sấy chân không ở 40 ^oC ± 2 ^oC.

Chiết phần cặn theo 9.5.1 của TCVN 4331 (ISO\r\n6492).

Cho dịch chiết chất béo vào phần dịch chiết\r\nthứ nhất.

Làm bay hơi dung môi bằng bộ cô quay trên nồi\r\ncách thủy ở nhiệt độ không quá 40 ^oC và làm khô phần cặn 2 h trong\r\ntủ sấy chân không ở 40 ^oC ± 2 ^oC.

4. Chuẩn bị mẫu thử\r\ncủa chất béo hoặc của dịch chiết chất béo

Nếu mẫu chất béo hoặc dịch chiết chất béo\r\nkhông tan chảy hoàn toàn thì làm nóng mẫu đến nhiệt độ cao hơn so với nhiệt độ\r\nnóng chảy không quá 10 ^oC. Xem TCVN 6128 (ISO 661).

5. Phương pháp chuẩn\r\nbị các metyl este của axit béo có trên sáu nguyên tử C (phương pháp BF₃)

5.1. Nguyên tắc

Dùng natri hydroxit metanolic để xà phòng hóa\r\nglyxerit. Xà phòng được chuyển thành các metyl este bằng phản ứng với phức chất\r\nbo triluoride/metanol.

5.2. Thuốc thử

Chỉ sử dụng thuốc thử và dung môi loại tinh\r\nkhiết phân tích.

5.2.1. Nước, phù hợp với loại 3\r\ncủa TCVN 4851 (ISO 3696).

5.2.2. Axit heptadecanoic (chất chuẩn nội), có độ tinh khiết ít\r\nnhất 99 %.

5.2.3. Natri hydroxit, dung dịch trong\r\nmetanol, c(NaOH) ≈ 0,5 mol/l.

Hòa tan 2 g natri hydroxit trong 100 ml\r\nmetanol chứa không quá 0,5 % (phần khối lượng) nước. Nếu dung dịch đã được bảo\r\nquản trong một thời gian khá dài thì một lượng nhỏ natri carbonat có thể tạo\r\nthành kết tủa màu trắng, điều này không làm ảnh hưởng đến việc chuẩn bị metyl\r\neste.

Có thể sử dụng kali hydroxit trong metanol có\r\ncùng nồng độ thay cho natri hydroxit.

5.2.4. Bo trifluoride (BF₃), dung dịch trong\r\nmetanol, từ 10 % đến 15 % (phần khối lượng).

CẢNH BÁO – Bo trifluoride là một chất độc. Do\r\nđó, khuyến cáo người phân tích không pha chế dung dịch bo trifluoride trong\r\nmetanol từ metanol và bo trifluoride.

Các dung dịch này có bán sẵn trên thị trường.

Trong phép phân tích sắc ký khí đối với metyl\r\neste, một số thuốc thử nhất định có thể làm tăng các pic gây nhiễu cho phép\r\nphân tích. Cụ thể, các dung dịch BF₃ có thể gây ra các pic trong\r\nvùng metyl este của axit béo có 20 nguyên tử C hoặc 22 nguyên tử C. Nên kiểm\r\ntra thuốc thử bằng cách chuẩn bị metyl este của axit oleic sau đó phân tích sắc\r\nký khí. Các thuốc thử phải không làm tăng các pic gây nhiễu khi phân tích sắc\r\nký khí các metyl este của axit béo.

5.2.5. n-hexan hoặc n-heptan.

5.2.6. Natri clorua, dung dịch nước bão hòa.

5.2.7. Natri sulfat, khan.

5.3. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử\r\nnghiệm thông thường và cụ thể như sau:

5.3.1. Bình cầu đáy tròn, dung tích 50 ml, có cổ mài và nút thủy\r\ntinh mài.

5.3.2. Chất trợ sôi, không chứa chất béo.

5.3.3. Bình ngưng hồi lưu, chiều dài hiệu quả\r\ntừ 20 cm đến 30 cm, có khớp nối mài để gắn với bình cầu.

5.3.4. Pipet chia độ, dung tích nhỏ nhất là 10\r\nml và được gắn với bầu cao su hoặc pipet tự động.

5.3.5. Lọ nhỏ, có nắp vặn.

5.4. Cách tiến hành

5.4.1. Yêu cầu chung

Do tính độc của bo trifluoride nên việc metyl\r\nhóa tốt nhất được tiến hành trong tủ hút khói được thông thí. Cần rửa tất cả\r\ncác dụng cụ thủy tinh bằng nước ngay sau khi sử dụng.

Nếu các axit béo chứa trên hai liên kết đôi\r\nthì cần loại không khí ra khỏi bình bằng cách bơm khí nitơ có hàm lượng oxi nhỏ\r\nhơn 5 mg/kg qua dung dịch trong vài phút và duy trì dòng khí nitơ ở phần trên\r\ncủa bình ngưng trong suốt quá trình xà phòng hóa tiếp theo.

Khi chuẩn bị các metyl este của axit béo để\r\nphân tích sắc ký khí-lỏng, thì không loại dung môi ra khỏi dung dịch metyl\r\neste.

5.4.2. Phần mẫu thử

Cân từ 100 mg đến 250 mg mẫu thử đã chuẩn bị\r\n(Điều 4), chính xác đến 0,1 mg, cho vào bình cầu đáy tròn (5.3.1). Cho axit\r\nheptadecanoic (5.2.2) có khối lượng khoảng 20 % phần khối lượng làm chất chuẩn\r\nnội vào bình cầu và cân chính xác đến 0,1 mg. Cân một lượng tương tự của mẫu\r\nthử đã được chuẩn bị cho vào bình cầu đáy tròn thứ hai.

Xử lý cả hai bình theo cùng một cách như sau:

Nếu phần mẫu thử có dầu hoặc chất béo thì\r\ntiến hành theo 5.4.3.

Nếu phần mẫu thử hoàn toàn gồm các axit béo\r\ntự do hoặc xà phòng thì tiến hành theo 5.4.5.

Nếu lượng mẫu không đủ thì có thể dùng phần\r\nmẫu thử nhỏ hơn 100 mg. Thuốc thử và dung môi qui định phải được giảm theo tỷ\r\nlệ và thể tích của các thiết bị điều chỉnh.

5.4.3. Xà phòng hóa

Cho 4 ml natri hydroxit, dung dịch metanolic\r\n(5.2.3) và chất trợ sôi (5.3.2). Gắn bình ngưng (5.3.3) vào bình cầu.

Đun sôi hồi lưu cho đến khi hết các giọt chất\r\nbéo và đun tiếp 30 min.

Nếu còn lại bất kỳ chất nào chưa xà phòng hóa\r\nthì có thể gây nhiễu phép phân tích, do đó, dung dịch sau khi xà phòng hóa có\r\nthể cần pha loãng bằng nước rồi được chiết bằng dietyl ete, hexan hoặc ete dầu\r\nmỏ. Loại bỏ dịch chiết. Sau khi axit hóa dung dịch xà phòng còn lại, các axit\r\nbéo có thể được tách ra và được metyl hóa theo 5.4.5.

5.4.4. Chuyển về metyl este trong trường hợp\r\nmẫu là chất béo hoặc dầu

Dùng pipet chia độ (5.3.4), cho 5 ml dung\r\ndịch bo trifluoride/metanol (5.2.4) vào dung dịch đang sôi qua đầu của bình\r\nngưng. Tiếp tục đun sôi trong 3 min.

Tiến hành theo 5.4.6.

5.4.5. Chuyển về metyl este nếu mẫu chỉ chứa\r\naxit béo tự do hoặc xà phòng

Dùng pipet chia độ (5.3.4) cho 5 ml dung dịch\r\nbo trifluoride/metanol (5.2.4) vào bình cầu. Gắn bình ngưng (5.3.3) vào bình\r\ncầu. Đun sôi trong 3 min.

5.4.6. Chiết

Lấy bình ra khỏi nguồn nhiệt. Thêm 1 ml đến\r\n3ml n-hexan (5.2.5) qua đầu của bình ngưng.

CHÚ THÍCH: Không giới hạn thể tích của dung\r\nmôi được thêm vào.

Để nguội đến nhiệt độ phòng. Lấy bình ngưng\r\nvà thêm khoảng 15 ml natri clorua bão hòa (5.2.6).

Đậy bình và lắc mạnh. Thêm tiếp dung dịch\r\nnatri clorua bão hòa (5.2.6) lên đến cổ bình. Để yên cho hai pha tách ra. Dùng\r\npipet chuyển toàn bộ lớp phía trên vào lọ nhỏ (5.3.5). Chiết dung dịch muối\r\nthêm ba lần với 1ml đến 3 ml n-hexan (5.2.5) bằng cách lắc vài lần và\r\nchuyển lớp phía trên vào lọ.

Cho thêm một lượng nhỏ natri sulfat khan\r\n(5.2.7) để loại bỏ hết nước khỏi dung dịch.

Nếu khối lượng của phần mẫu thử trong khoảng\r\ntừ 100 mg đến 250 mg thì nồng độ của metyl este trong dung dịch là khoảng 3 %\r\n(phần khối lượng). Dung dịch này được dùng để phân tích sắc ký khí.

Nếu dùng để bơm lên cột lạnh trong phép phân\r\ntích sắc ký khí thì chuẩn bị dung dịch pha loãng bằng cách dùng pipet cho 0,25\r\nm; dung dịch vào bình định mức 25 ml và thêm n-hexan (5.2.5) đến vạch.

6. Phương pháp chuẩn\r\nbị metyl este của các axit béo có trên 4 nguyên tử C (phương pháp KOH-HCl)

6.1. Nguyên tắc

Các glyxerit được chuyển về metyl este bằng\r\nphản ứng chuyển hóa este với kali metanolat trong metanol nguyên chất. Các axit\r\nbéo tự do được este hóa bằng dung dịch axit clohydric trong metanol.

6.2. Thuốc thử

Chỉ sử dụng thuốc thử và dung môi loại tinh\r\nkhiết phân tích.

6.2.1. Nước, phù hợp với loại 3 của TCVN 4851\r\n(ISO 3696).

6.2.2. Axit heptadecanoic (chất chuẩn nội), có độ tinh khiết\r\nkhoảng 99 %.

6.2.3. n-hexan hoặc n-heptan.

6.2.4. n-pentan.

6.2.5. Kali metanolat, dung dịch trong\r\nmetanol, c(CH₃OK) 2 mol/l.

Hòa tan 7,8 g kali kim loại trong 100 ml\r\nmetanol nguyên chất. Chuẩn bị dung dịch mới trong ngày sử dụng.

Có thể sử dụng dung dịch natri metanolat trong\r\nmetanol có cùng nồng độ để thay cho dung dịch kali metanolat.

6.2.6. Natri sulfat, khan.

6.2.7. Metanol, khan.

Cho 5 g natri sulfat (6.2.6) vào bình cầu có\r\nchứa 250 ml metanol. Đậy bình rồi lắc mạnh. Lọc dung dịch qua giấy lọc vào bình\r\nnón (6.3.1) và đậy kín bình này.

6.2.8. Axit clohydric, dung dịch trong\r\nmetanol, w(HCl)  20 % (phần khối lượng).

Cân 80 g metanol (6.2.7), chính xác đến 0,1\r\ng, cho vào bình nón (6.3.1).

Hứng cho khí axit clohydric đi qua dung môi\r\nđược khuấy để làm nguội cho đến khi khối lượng của dung dịch tăng khoảng 20 g.\r\nTiếp tục để dung dịch nguội.

Dung dịch này có thể giữ được 3 tháng nếu được\r\nđể trong bình đậy kín và bảo quản nơi tối.

6.3. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử\r\nnghiệm thông thường và cụ thể như sau:

6.3.1. Bình nón, dung tích 250 ml, có cổ mài và được\r\nđậy bằng nắp thủy tinh mài.

6.3.2. Lọ phản ứng, dung tích khoảng 10\r\nml, được đậy bằng màng kín và nắp vặn.

6.3.3. Ống đong chia độ, có dung tích 10 ml.

6.3.4. Thiết bị đốt nóng bằng điện, có thể duy trì\r\nnhiệt độ ở (85 ± 3) ^oC, có gắn với que khuấy từ.

6.4. Cách tiến hành

Cân từ 50 mg đến 75 mg mẫu thử đã được chuẩn\r\nbị (Điều 4), chính xác đến 0,1 mg, cho vào hai lọ phản ứng (6.3.2). Thêm vào\r\nmột bình, một lượng axit heptadecanoic (6.2.2) khoảng 20 % khối lượng của phần\r\nmẫu thử và cân chính xác đến 0,1 mg làm chất chuẩn nội.

Xử lý cả hai lọ theo cùng một cách như sau:

Thêm 4 ml n-hexan (6.2.3). Sử dụng 4\r\nml n-pentan thay cho n-hexan thì dùng phương pháp bơm lên cột\r\nlạnh để phân tích bằng sắc ký khí các axit béo có ít hơn 10 nguyên tử C.

Thêm khoảng 75 mg natri sulfat khan (6.2.6)\r\nvà lắc để hòa tan phần mẫu thử.

Thêm 0,20 ml kali metanolat (6.2.5), đậy lọ\r\nphản ứng và lắc mạnh trong khoảng từ 20 s đến 50 s. Dung dịch bị đục ngay do\r\ntạo thành glyxerol lắng xuống nhanh. Thêm 2 ml dung dịch axit clohydric (6.2.8)\r\nvà khuấy bằng que khuấy từ. Đậy lọ phản ứng và đặt vào bộ phận đốt nóng bằng\r\nđiện (6.3.4), đã làm nóng trước đến nhiệt độ 85 ^oC. Đun trong 20 min\r\ntrong khi vẫn khuấy đều. Lắc hỗn hợp vài lần trong giai đoạn này.

Làm nguội lọ cùng với lượng chứa bên trong\r\nđến nhiệt độ phòng dưới dòng nước lạnh và lắc mạnh.

Gạn lớp phía trên có metyl este. Không loại\r\ndung môi ra khỏi dung dịch metyl este.

Nếu khối lượng của phần mẫu thử trong khoảng\r\ntừ 50 mg đến 75 mg thì nồng độ của metyl este trong dung dịch ở khoảng 2 %\r\n(phần khối lượng). Dung dịch này dùng để phân tích sắc ký khí.

Nếu dùng để bơm lên cột lạnh trong phép phân\r\ntích sắc ký khí, thì chuẩn bị dung dịch pha loãng bằng cách dùng pipet cho 0,25\r\nml dung dịch này vào định mức 25 ml và thêm n-hexan (6.2.4) cho đến\r\nvạch.

7. Bảo quản

Các dung dịch metyl este thu được thích hợp\r\nđể phân tích sắc ký khí ngày. Dung dịch metyl este có thể được bảo quản vài\r\ntuần trong điều kiện khí trơ ở nhiệt độ từ 4 ^oC đến 8 ^oC,\r\nnếu cần.

Khi cần phải bảo quản lâu hơn, để tránh việc\r\noxi hóa metyl este, nên bổ sung dung dịch chất chống oxit hóa ở nồng độ mà\r\nkhông ảnh hưởng đến phép phân tích sắc ký khí. Ví dụ: bổ sung 0,05 g BHT (butyl\r\nhydroxy toluen) trên một lít.

8. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

- tất cả các thông tin cần thiết để nhận biết\r\nđầy đủ về mẫu thử;

- phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

- phương pháp este hóa đã dùng (ví dụ: phương\r\npháp BF₃ hoặc phương pháp KOH/HCl), viện dẫn trong tiêu chuẩn này.

- mọi chi tiết thao tác không được quy định\r\ntrong tiêu chuẩn này hoặc những điều được coi là tùy ý cũng như các sự cố bất\r\nkỳ có thể ảnh hưởng đến kết quả thử.