CẢNH BÁO - Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể\r\nliên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu\r\nchuẩn này không thể đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến\r\nviệc sử dụng chúng. Các phòng thí nghiệm sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các\r\nnguyên tắc bảo đảm an toàn sinh học để không phải bị nhiễm bệnh nghề nghiệp hoặc\r\nthất thoát các mầm bệnh từ phòng thí nghiệm ra môi trường.
\r\n\r\n\r\n\r\nTiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh\r\nviêm gan vịt typ I gây ra cho vịt dưới 6 tuần tuổi.
\r\n\r\nTrong tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ, định\r\nnghĩa và chữ viết tắt sau:
\r\n\r\n2.1 Thuật ngữ và định nghĩa
\r\n\r\nBệnh viêm gan vịt typ I (Duck virus\r\nhepatitis type I disease)
\r\n\r\nBệnh truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm xảy ra ở\r\nvịt, do Avihepatovirus thuộc họ Picornaviridae gây nên.
\r\n\r\nCHÚ THÍCH: Có 3 typ vi rút khác nhau là: typ\r\nI, typ II và typ III. Ở Việt Nam, bệnh viêm gan vịt thường do vi rút typ I\r\ngây ra. Bệnh xảy ra chủ yếu ở vịt con từ 1 tuần tuổi đến 6 tuần tuổi, vịt 3 tuần\r\ntuổi mẫn cảm nhất.
\r\n\r\n2.2 Chữ viết tắt
\r\n\r\n- VN: Virus neutralization (Phản ứng trung\r\nhòa vi rút)
\r\n\r\n– SN: Serum neutralizatuion (Phản ứng trung\r\nhòa huyết thanh)
\r\n\r\n- CPE: Cytopathic pathogene effect (Bệnh tích\r\ntế bào)
\r\n\r\n– FCS: Fetal calf serum (Huyết thanh thai bê)
\r\n\r\n- DEL: Duck embryo liver (Tế bào gan phôi vịt)
\r\n\r\n- NI: Neutralization index (Chỉ số trung hòa)
\r\n\r\n- BSC II: Bio-safety cabinet (Buồng cấy an\r\ntoàn sinh học cấp II)
\r\n\r\n- MEM: Modified eagles medium (Môi trường\r\nnuôi cấy tế bào)
\r\n\r\n– CAM: Chorioallantoic membrance (Màng nhung\r\nniệu)
\r\n\r\n- LD50: 50 % Lethal dose (Liều gây chết\r\n50 % động vật thí nghiệm)
\r\n\r\n– EID50: 50 % Egg infective dose (Liều\r\ngây chết 50 % phôi trứng)
\r\n\r\n- TCID50: 50 % tissue culture infective\r\ndose (Liều gây nhiễm 50 % tế bào)
\r\n\r\n– BHI: Brain heart infusion (Canh thang nước\r\nthịt tim não)
\r\n\r\nChỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân\r\ntích và sử dụng nước cất hai lần (pH 7) hoặc nước đã khử khoáng hoặc nước có độ\r\ntinh khiết tương đương không có enzym phân giải RNA (RNAse), trừ khi có quy định\r\nkhác.
\r\n\r\nXem Phụ lục A về mô tả các dung dịch thuốc thử\r\nvà môi trường.
\r\n\r\n- Cloroform.
\r\n\r\n- Hoá chất tiêu độc: formalin, cloramin.
\r\n\r\n- Môi trường tế bào MEM.
\r\n\r\n- Môi trường nước thịt (hoặc BHI).
\r\n\r\n- Môi trường thạch máu.
\r\n\r\n- Trứng gà có phôi (9 ngày tuổi đến 11 ngày\r\ntuổi) hoặc trứng vịt có phôi (10 ngày tuổi đến 14 ngày tuổi).
\r\n\r\n- Trứng vịt có phôi (14 ngày tuổi đến 16 ngày\r\ntuổi) để làm tế bào gan phôi vịt.
\r\n\r\n- Giống vi rút viêm gan vịt typ I.
\r\n\r\n- Kháng huyết thanh Viêm gan vịt typ I.
\r\n\r\n- Các loại kháng sinh Penicillin, Kanamycin,\r\nStreptomycin, Mycostatin.
\r\n\r\n- Kit chiết tách, ví dụ Rneasy Mini kit của\r\nhãng Qiagen.
\r\n\r\n- Kit nhân gen, ví dụ Maxime RT-PCR PreMix\r\nkit của hãng iNtRON Biotechnology.
\r\n\r\n\r\n\r\nSử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thí\r\nnghiệm thông thường và cụ thể như sau:
\r\n\r\n- Tủ lạnh thường, tủ lạnh âm sâu
\r\n\r\n- Tủ ấm CO2
\r\n\r\n- Máy lắc đĩa (orbital shaker)
\r\n\r\n– Máy lắc trộn (vortex mixer)
\r\n\r\n- Máy khuấy từ
\r\n\r\n- Nồi cách thuỷ
\r\n\r\n– BSC II
\r\n\r\n– Máy ly tâm
\r\n\r\n– Kính hiển vi soi tế bào
\r\n\r\n- Đèn soi trứng
\r\n\r\n- Tủ ấp trứng
\r\n\r\n- Bình nón, dung tích 100 ml, 200 ml, 500 ml\r\nvà 1000 ml
\r\n\r\n– Ống đong thuỷ tinh, dung tích 50 ml, 100\r\nml, 200 ml, 500 ml và 1000 ml -Cốc có mỏ, dung tích 100 ml, 200 ml, 500 ml và\r\n1000 ml
\r\n\r\n- Ống Falcon, dung tích 50 ml, 15 ml
\r\n\r\n- Pipet thuỷ tinh, dung tích 1 ml, 5 ml và 10\r\nml
\r\n\r\n- Micropipet, dung tích từ 0,5 µl đến 10\r\nµl, từ 5 µl đến 50 µl, từ 50 µl đến 200 µl, từ 100 µl đến 1000 µl
\r\n\r\n– Micropipet đa kênh, dung tích từ 5 µl đên\r\n50 µl, từ 50 µl đến 200 µl
\r\n\r\n- Đầu tip phù hợp với micropipet
\r\n\r\n- Bộ cối chày sứ
\r\n\r\n- Chai nhựa, đĩa nhựa nuôi tế bào: chai nhựa\r\nT25, đĩa nhựa 6 giếng, 24 giếng, 96 giếng - Màng lọc Millipor có kích thước\r\nlỗ lọc 0,45 µm
\r\n\r\n- Đĩa Petri
\r\n\r\n- Dao, kéo, panh kẹp.
\r\n\r\n\r\n\r\n\r\n\r\n5.1.1 Đặc điểm dịch tễ
\r\n\r\n- Bệnh viêm gan vịt là bệnh truyền nhiễm cấp\r\ntính của loài vịt.
\r\n\r\n- Bệnh xảy ra ở vịt từ 6 tuần tuổi trở xuống.\r\nVịt trưởng thành và các loài gia cầm khác không mắc bệnh.
\r\n\r\n- Bệnh lây lan nhanh và trầm trọng trong khoảng\r\n2 ngày đến 3 ngày.
\r\n\r\n- Vịt con dưới 3 tuần tuổi khi mắc bệnh viêm\r\ngan do vi rút có tỷ lệ chết rất cao, từ 50 % đến 95 %. Vịt từ 4 tuần tuổi đến 5\r\ntuần tuổi khi mắc bệnh thì tỷ lệ chết rất thấp hoặc không đáng kể.
\r\n\r\n5.1.2 Triệu chứng lâm sàng
\r\n\r\nVịt khi mắc bệnh viêm gan sốt cao, ăn, uống\r\nkém, ủ rũ, ít vận động, chỉ nằm một chỗ. Vịt có triệu chứng về thần kinh, khi vận\r\nđộng thì mất thăng bằng, đi liêu xiêu hoặc bị ngã, khi nằm thì hai chân co giật.\r\nSau 2 ngày đến 3 ngày mắc bệnh thì chết. Vịt chết có tư thế rất đặc trưng: chân\r\nvịt duỗi thẳng giống như bơi chèo, đầu ngửa hết về phía sau. Người ta gọi đây\r\nlà tư thế Opisthotonus.
\r\n\r\n5.1.3 Giải phẫu bệnh học
\r\n\r\nBệnh tích đai thể đặc trưng nhất ở gan, gan\r\nsưng, trên bề mặt có các điểm xuất huyết. Xung quanh các điểm xuất huyết còn thấy\r\ncác đám tụ máu. Một số trường hợp lách lốm đốm xuất huyết và sưng, thận tụ máu\r\nvà có dịch rỉ viêm.
\r\n\r\n5.1.4 Lấy mẫu và bảo quản
\r\n\r\nLấy vô trùng gan, lách, thận của vịt nghi mắc\r\nbệnh. Bệnh phẩm sau khi lấy được bảo quản ở nhiệt độ âm 20 0C. Bệnh phẩm để\r\nphát hiện kháng thể là mẫu huyết thanh. Máu được lấy vô trùng, lượng tối thiểu\r\nlà 3 ml, để đông, chắt lấy huyết thanh. Bảo quản ở nhiệt độ từ 2 0C đến\r\n8 0C. Nên lấy ít nhất là 5 mẫu huyết thanh.
\r\n\r\nMẫu sau khi lấy được giữ trong điều kiện lạnh,\r\nbao gói cẩn thận để không làm lây lan bệnh rồi chuyển tới phòng xét nghiệm\r\ncàng sớm càng tốt, không chậm hơn 5 ngày để có kết quả xét nghiệm nhanh chóng\r\nvà chính xác.
\r\n\r\n5.2.1 Bệnh tích vi thể
\r\n\r\nTế bào gan hoại tử, thoái hóa xen lẫn tế bào\r\nviêm ở các mức độ khác nhau. Tế bào ống mật tăng sinh. Hiện tượng xuất huyết\r\ntràn lan trong nhu mô gan.
\r\n\r\n5.2.2 Phát hiện và giám định vi rút
\r\n\r\n5.2.2.1 Xử lý bệnh phẩm
\r\n\r\nBệnh phẩm gan, lách nghiền trong cối chày sứ\r\nvới dung dịch PBS (A.2) thành huyễn dịch 10 % sau đó xử lý với kháng sinh\r\npenicillin (200 UI/ml) và streptomycin (200 µg/ml), hoặc có thể lọc vô trùng\r\nqua màng lọc cỡ lỗ 0,45 µm. Ly tâm huyễn dịch bệnh phẩm 2000 r/min trong\r\n15 min. Hút lấy dịch nước trong ở phía trên khoảng 3 ml đến 4 ml. Xử lý dịch\r\nthu được bằng cloroform 5 % trong 15 min ở nhiệt độ phòng. Kiểm tra vô trùng của\r\nmẫu trên môi trường BHI hoặc môi trường thạch máu.
\r\n\r\n5.2.2.2 Phương pháp phân lập vi rút
\r\n\r\n5.2.2.2.1 Tiêm truyền trên phôi gà hoặc phôi\r\nvịt
\r\n\r\nDùng phôi gà từ 9 ngày tuổi đến 11 ngày tuổi\r\nhoặc phôi vịt từ 10 ngày tuổi đến 14 ngày tuổi.
\r\n\r\nTiêm 0,2 ml huyễn dịch bệnh phẩm vào xoang niệu\r\nmô hoặc màng CAM của phôi gà hoặc phôi vịt: mỗi mẫu bệnh phẩm\r\ntiêm 3 phôi.
\r\n\r\nTrứng được ấp tiếp ở tủ ấm 37 0C.
\r\n\r\nSoi trứng hàng ngày, loại bỏ những phôi chết\r\ntrước 24 h sau khi tiêm.
\r\n\r\nVi rút viêm gan vịt thường gây chết phôi gà\r\nsau 5 ngày đến 8 ngày tiêm (gây chết phôi vịt từ 1 ngày đến 3 ngày sau khi\r\ntiêm).
\r\n\r\nMổ phôi thấy hiện tượng: phôi còi cọc, xuất\r\nhuyết toàn thân, phù nề ở bụng. Gan của phôi có màu đỏ hoặc vàng, xuất huyết và\r\nhoại tử rất rõ. Đối với phôi chết muộn hơn, dịch niệu có màu xanh lục.
\r\n\r\nThu hoạch gan phôi và dịch niệu để giám định\r\nvi rút.
\r\n\r\n5.2.2.2.2 Tiêm truyền cho vịt con 1 ngày tuổi\r\nđến 7 ngày tuổi
\r\n\r\nTiêm huyễn dịch bệnh phẩm (5.2.2.1) vào bắp\r\ncho vịt con 1 ngày tuổi đến 7 ngày tuổi với liều lượng: 0,5 ml/con. Mỗi mẫu bệnh\r\nphẩm tiêm 3 vịt con.
\r\n\r\nVi rút viêm gan vịt gây chết vịt trong khoảng\r\n18 h đến 48 h với các triệu chứng và bệnh tích điển hình của bệnh như đã mô tả ở\r\n5.1.2 và 5.1.3.
\r\n\r\nMổ khám và thu hoạch gan vịt chết có bệnh\r\ntích điển hình. Xử lý gan vịt thu được theo 5.2.2.1 để giám định vi rút.
\r\n\r\n5.2.2.2.3 Tiêm truyền trên tế bào gan phôi vịt\r\n(DEL)
\r\n\r\nChuẩn bị tế bào DEL nuôi cấy lên\r\ncác chai nuôi tế bào T25 hoặc đĩa nuôi cấy 6 giếng hay 24 giếng (xem Phụ lục\r\nB). Sau từ 2 ngày đến 3 ngày, tế bào mọc thành thảm (khoảng 80 %) thì gây nhiễm\r\nhuyễn dịch bệnh phẩm (5.2.2.1) với liều 50 µl/giếng đến 100 µl/giếng hoặc 500\r\nµl/chai.
\r\n\r\nKiểm tra tế bào hàng ngày bằng kính hiển vi.\r\nQuan sát CPE với đặc điểm thảm tế bào bong tróc, các tế bào co tròn và tụ lại từng\r\nđám. CPE thường xuất hiện sau 4 ngày đến 7 ngày gây nhiễm.
\r\n\r\nSau 7 ngày thu huyễn dịch tế bào, đông tan,\r\nly tâm và thu dịch nước trong cho giám định vi rút hoặc cấy chuyển lần 2.
\r\n\r\n5.2.2.3 Phương pháp giám định vi rút
\r\n\r\n5.2.2.3.1 Phương pháp bảo hộ thụ động cho vịt\r\ncon
\r\n\r\n5.2.2.3.1.1 Chuẩn bị
\r\n\r\nDùng vịt con từ 1 ngày tuổi đến 7 ngày tuổi\r\nkhỏe mạnh không có kháng thể viêm gan vịt typ I. Chia làm 2 lô, mỗi lô 3\r\ncon.
\r\n\r\n5.2.2.3.1.2 Cách tiến hành
\r\n\r\nLô thí nghiệm: tiêm dưới da mỗi con vịt 1 ml\r\nđến 2 ml kháng huyết thanh hoặc kháng thể lòng đỏ viêm gan vịt typ I đặc\r\nhiệu.
\r\n\r\nLô đối chứng: không tiêm kháng thể.
\r\n\r\nSau 24 h, cả 2 lô được công cường độc với liều\r\n1000 LD50 (xem Phụ lục C) vi rút đã phân lập bằng cách tiêm bắp hoặc\r\ndưới da.
\r\n\r\n5.2.2.3.1.3 Đánh giá kết quả
\r\n\r\nLô đối chứng (không được tiêm kháng thể viêm\r\ngan vịt): vịt chết từ 2 con đến 3 con trong khoảng thời gian từ 18 h đến 48 h,\r\nthường từ 18 h đến 24 h.
\r\n\r\nLô thí nghiệm (được tiêm kháng thể viêm gan vịt):\r\ntỷ lệ bảo hộ đạt 100 %. Kết luận: vi rút phân lập được là vi rút viêm gan\r\nvịt typ I.
\r\n\r\n5.2.2.3.2 Phương pháp trung hòa
\r\n\r\n5.2.2.3.2.1 Phương pháp trung hòa trên phôi\r\ngà hoặc phôi vịt
\r\n\r\na) Chuẩn bị
\r\n\r\nDùng phôi gà từ 9 ngày tuổi đến 11 ngày tuổi\r\nhoặc phôi vịt từ 10 ngày tuổi đến 14 ngày tuổi. Vi rút phân lập được pha loãng\r\nvới dung dịch PBS (A.2) nồng độ từ 10-1 đến 10-9.
\r\n\r\nLô đối chứng dương tính: Trộn kháng huyết\r\nthanh dương tính viêm gan vịt typ I với các nồng độ vi rút đã pha loãng theo tỷ\r\nlệ 1:1.
\r\n\r\nLô đối chứng âm tính: Trộn huyết thanh âm\r\ntính với các nồng độ vi rút đã pha loãng theo tỷ lệ 1:1. Ủ hỗn hợp trên ở\r\nnhiệt độ 37 0C trong 1 h.
\r\n\r\nb) Tiến hành
\r\n\r\nTiêm hỗn hợp vi rút và huyết thanh trên vào\r\nxoang niệu mô với liều 0,2 ml/phôi, mỗi nồng độ tiêm 3 phôi. Sau đó các trứng\r\nnày lại được ấp tiếp ở tủ ấm 37 0C trong 7 ngày. Soi trứng hàng ngày và loại\r\nbỏ những phôi chết trước 24 h.
\r\n\r\nPhôi gà thường chết sau từ 5 ngày đến 7 ngày\r\ncòn phôi vịt sau 2 ngày đến 3 ngày. Phôi chết có bệnh tích còi cọc, xuất huyết\r\nvà phù nề.
\r\n\r\nc) Đánh giá kết quả
\r\n\r\nNếu có vi rút viêm gan vịt typ I, lô đối chứng\r\ndương phôi sẽ sống khỏe còn lô đối chứng âm phôi sẽ chết với các triệu chứng và\r\nbệnh tích điển hình của bệnh như đã mô tả ở trên.
\r\n\r\nTính toán chỉ số trung hòa NI (xem Phụ lục\r\nD). Chỉ số trung hòa (NI) là sự chênh lệch giữa EID50 của lô đối chứng\r\ndương tính và âm tính. Chỉ số NI lớn hơn hoặc bằng 2 được coi là dương tính.
\r\n\r\n5.2.2.3.2.2 Phương pháp trung hòa trên vịt\r\ncon
\r\n\r\na) Chuẩn bị
\r\n\r\nVịt con từ 1 ngày tuổi đến 7 ngày tuổi khỏe mạnh,\r\nkhông có kháng thể viêm gan vịt.
\r\nVi rút phân lập được pha loãng với dung dịch PBS (A.2) từ nồng độ 10-1 đến\r\n10-9.
Lô đối chứng dương tính: Trộn kháng huyết\r\nthanh dương tính viêm gan vịt typ I với các nồng độ vi rút đã pha loãng theo tỷ\r\nlệ 1:1.
\r\n\r\nLô đối chứng âm tính: Trộn huyết thanh âm\r\ntính với các nồng độ vi rút đã pha loãng theo tỷ lệ 1:1. Ủ hỗn hợp trên ở\r\nnhiệt độ 37 0C trong 1 h.
\r\n\r\nb) Tiến hành
\r\n\r\nTiêm hỗn hợp vi rút và huyết thanh trên vào bắp\r\ncho vịt với lượng 0,5 ml/con, mỗi nồng độ tiêm 3 con. Tiếp tục nuôi vịt\r\nbình thường và quan sát theo dõi vịt hàng ngày.
\r\n\r\nc) Đánh giá kết quả
\r\n\r\nNếu có vi rút viêm gan vịt typ I, lô đối chứng\r\ndương vịt sẽ sống khỏe, còn lô đối chứng âm vịt sẽ chết trong khoảng từ 18 h đến\r\n48 h với các triệu chứng và bệnh tích điển hình của bệnh như đã mô tả tại
\r\n\r\n5.1.2 và 5.1.3.
\r\n\r\nTính toán chỉ số trung hòa NI (xem Phụ lục\r\nD). Chỉ số NI lớn hơn hoặc bằng 2 được coi là dương tính.
\r\n\r\n5.2.2.3.2.3. Phương pháp trung hòa trên tế\r\nbào gan phôi vịt (DEL)
\r\n\r\na) Chuẩn bị
\r\n\r\nTế bào gan phôi vịt được nuôi cấy trên đĩa tế\r\nbào 96 giếng, sau 2 ngày đến 3 ngày đã mọc thành thảm đạt khoảng 80 % đến\r\n90 %.
\r\n\r\nVi rút phân lập được pha loãng với môi trường\r\nnuôi cấy tế bào (MEM) từ nồng độ 10-1 đến 10-9.
\r\n\r\nLô đối chứng dương tính: Trộn kháng huyết\r\nthanh dương tính viêm gan vịt typ I với các nồng độ vi rút đã pha loãng theo tỷ\r\nlệ 1:1.
\r\n\r\nLô đối chứng âm tính: Trộn huyết thanh âm\r\ntính với các nồng độ vi rút đã pha loãng theo tỷ lệ 1:1. Ủ hỗn hợp trên ở\r\nnhiệt độ 37 0C trong 1 h.
\r\n\r\nb) Tiến hành
\r\n\r\nGây nhiễm hỗn hợp vi rút và huyết thanh trên\r\nlên đĩa 96 giếng đã nuôi cấy tế bào DEL: 100 µl/giếng, nhiễm 8 giếng/nồng\r\nđộ.
\r\n\r\nỦ đĩa nuôi cấy ở tủ ấm CO2 ở nhiệt độ\r\n37 0C trong 1 h.
\r\n\r\nĐổ bỏ hỗn hợp trên, cho môi trường nuôi cấy tế\r\nbào MEM (không có FCS): 100 µl/giếng.
\r\n\r\nTiếp tục ủ đĩa nuôi cấy ở tủ ấm CO2 ở\r\nnhiệt độ 37 0C. Quan sát đĩa hàng ngày dưới kính hiển vi để kiểm tra\r\nphát hiện CPE.
\r\n\r\nc) Đánh giá kết quả
\r\n\r\nNếu có vi rút viêm gan vịt typ I, lô đối chứng\r\ndương tế bào phát triển bình thường, còn lô đối chứng âm CPE xuất hiện từ 3\r\nngày đến 7 ngày sau khi nhiễm
\r\n\r\nTính toán chỉ số trung hòa NI (xem Phụ lục\r\nD). Chỉ số NI lớn hơn hoặc bằng 2 được coi là dương tính.
\r\n\r\n5.2.2.4. Phương pháp RT- PCR
\r\n\r\n5.2.2.4.1. Nguyên tắc
\r\n\r\nPhản ứng chuỗi polyme phiên mã ngược dùng để\r\nphát hiện ARN của vi rút viêm gan vịt.
\r\n\r\n5.2.2.4.2. Các bước tiến hành (xem Phụ lục\r\nE)
\r\n\r\nChiết tách ARN bằng kit theo hướng dẫn của\r\nnhà sản xuất, sau đó chạy RT-PCR.
\r\n\r\n5.2.3. Phát hiện kháng thể
\r\n\r\nMẫu bệnh phẩm để tiến hành phản ứng là huyết\r\nthanh lấy vào thời gian sau 10 ngày từ khi dịch xảy ra đối với vịt chưa được\r\ntiêm phòng vacxin Viêm gan vịt typ I, hoặc sau 3 tuần đến 4 tuần đối với vịt đã\r\ntiêm phòng.
\r\n\r\nXử lý mẫu huyết thanh ở 56 0C trong 30\r\nmin để diệt bổ thể trước khi xét nghiệm.
\r\nSử dụng một trong ba phương pháp trung hòa (SN) sau để phát hiện kháng thể
5.2.3.1. Phương pháp trung hòa trên phôi gà\r\nhoặc phôi vịt
\r\n\r\n5.2.3.1.1. Chuẩn bị
\r\n\r\nDùng phôi gà từ 9 ngày tuổi đến 11 ngày tuổi\r\nhoặc phôi vịt từ 10 ngày tuổi đến 14 ngày tuổi.
\r\n\r\nPha loãng mẫu huyết thanh với dung dịch PBS\r\n(A.2) theo cơ số 2 ở 10 nồng độ (1/5, 1/10,...1/2560).
\r\n\r\nPha vi rút viêm gan vịt typ I với dung dịch\r\nPBS pH 7,2 (A.2) với liều 100 EID50.
\r\n\r\n5.2.3.1.2. Tiến hành
\r\n\r\nTrộn vi rút viêm gan vịt và huyết thanh kiểm\r\ntra đã chuẩn bị ở trên theo tỷ lệ 1:1. Ủ hỗn hợp vi rút và huyết thanh này\r\nở tủ ấm 37 0C trong 1 h.
\r\n\r\nTiêm hỗn hợp vi rút và huyết thanh trên vào\r\nxoang niệu mô phôi trứng: 0,2 ml/phôi, mỗi một nồng độ tiêm 3 phôi.
\r\n\r\nSau đó các trứng này lại được ấp tiếp ở tủ ấm\r\n37 0C trong 9 ngày với phôi gà và 12 ngày với phôi vịt. Soi trứng hàng\r\nngày và loại bỏ những phôi chết trước 24 h.
\r\n\r\n5.2.3.1.3. Đánh giá kết quả
\r\n\r\nNếu huyết thanh có kháng thể viêm gan vịt typ\r\nI, phôi sẽ sống còn nếu huyết thanh không có kháng thể phôi sẽ chết (sau 5\r\nngày đến 7 ngày đối với phôi gà và 2 ngày đến 3 ngày với phôi vịt). Phôi chết\r\ncó bệnh tích còi cọc, xuất huyết và phù nề.
\r\n\r\nTính toán 50 % điểm kết thúc trung hòa\r\n(SN50) và hiệu giá trung hòa theo công thức của Reed Muench (xem Phụ\r\nlục D).
\r\n\r\nĐiểm kết thúc trung hòa được coi là bảo hộ 50\r\n% động vật thí nghiệm.
\r\n\r\n5.2.3.2. Phương pháp trung hòa trên vịt con 1\r\nngày tuổi đến 7 ngày tuổi
\r\n\r\n5.2.3.2.1. Chuẩn bị
\r\n\r\nVịt con khỏe mạnh từ 1 ngày tuổi đến 7 ngày\r\ntuổi, không có kháng thể viêm gan vịt.
\r\n\r\nPha loãng mẫu huyết thanh với dung dịch PBS\r\n(A.2) theo cơ số 2 ở 10 nồng độ (1/5, 1/10,... 1/2560). Pha vi rút viêm\r\ngan vịt typ I với dung dịch PBS (A.2) liều 1000 LD50.
\r\n\r\n5.2.3.2.2 Tiến hành
\r\n\r\nTrộn vi rút viêm gan vịt và huyết thanh kiểm\r\ntra đã chuẩn bị ở trên theo tỷ lệ 1:1. Ủ hỗn hợp vi rút/huyết thanh này ở\r\ntủ ấm 37 0C trong 1 h
\r\n\r\nTiêm hỗn hợp vi rút/huyết thanh trên vào bắp\r\ncho vịt với lượng 0,5 ml/con, mỗi một nồng độ tiêm 3 con. Tiếp tục nuôi vịt\r\nbình thường và quan sát theo dõi vịt hàng ngày.
\r\n\r\nNếu huyết thanh có kháng thể viêm gan vịt typ\r\nI, vịt sẽ sống còn nếu huyết thanh không có kháng thể vịt sẽ chết trong khoảng\r\n18 h đến 72 h, với các triệu chứng, bệnh tích điển hình của bệnh viêm gan vịt.
\r\n\r\nTính toán 50 % điểm kết thúc trung hòa\r\n(SN50) và hiệu giá trung hòa theo công thức của Reed Muench (xem Phụ\r\nlục D).
\r\n\r\nĐiểm kết thúc trung hòa được coi là bảo hộ 50\r\n% động vật thí nghiệm.
\r\n\r\n5.2.3.3 Phương pháp trung hòa trên tế bào gan\r\nphôi vịt DEL
\r\n\r\n5.2.3.3.1 Chuẩn bị
\r\n\r\nTiến hành pha loãng tế bào DEL với môi trường nuôi cấy MEM với số lượng cần thiết (5x104 tế\r\nbào/ml). Pha vi rút viêm gan vịt typ I chuẩn với môi trường MEM liều 100\r\nTCID50
\r\n\r\n5.2.3.3.2 Tiến hành trên đĩa nuôi cấy tế bào\r\n96 giếng
\r\n\r\nCho môi trường nuôi cấy MEM (không có FCS)\r\nvào tất cả các giếng của đĩa: 50 µl/giếng. Cho mẫu huyết thanh kiểm tra :\r\n50 µl vào giếng đầu tiên của cột 1.
\r\n\r\nPha loãng mẫu huyết thanh theo cơ số 2 (1/2,\r\n1/4,...) từ cột 1 đến cột 12. Cho vi rút viêm gan vịt typ I vào các giếng:\r\n50 µl/giếng.
\r\n\r\nỦ đĩa nuôi cấy ở tủ ấm CO2 ở nhiệt độ\r\n37 0C trong 1 h.
\r\n\r\nCho tiếp vào các giếng dung dịch môi trường\r\ncó tế bào DEL đã pha ở trên: 100 µl/giếng.
\r\n\r\nTiếp tục ủ đĩa nuôi cấy ở tủ ấm CO2 ở\r\nnhiệt độ 37 0C trong 5 ngày đến 7 ngày. Soi đĩa hàng ngày dưới kính\r\nhiển vi để kiểm tra bệnh tích tế bào.
\r\n\r\n5.2.3.3.3 Đánh giá kết quả
\r\n\r\nNếu huyết thanh có kháng thể viêm gan vịt typ\r\nI sẽ không xuất hiện CPE, ngược lại huyết thanh không có kháng thể thì sau\r\n3 ngày đến 7 ngày sẽ có CPE.
\r\n\r\nTính toán 50 % điểm kết thúc trung hòa\r\n(SN50) và hiệu giá trung hòa theo công thức của Reed Muench (xem Phụ\r\nlục D).
\r\n\r\nĐiểm kết thúc trung hòa có hiệu giá huyết\r\nthanh pha loãng tại đó bảo hộ 50 % động vật thí nghiệm.
\r\n\r\n\r\n\r\nVịt được xác định mắc bệnh viêm gan vịt typ I\r\nkhi có các đặc điểm dịch tễ học, triệu chứng lâm sàng của bệnh viêm gan vịt và\r\nkết quả dương tính với một trong hai phương pháp xét nghiệm sau:
\r\n\r\n- Phân lập và giám định được vi rút viêm gan\r\nvịt typ I trong mẫu bệnh phẩm.
\r\n\r\n- Phát hiện được kháng thể viêm gan vịt typ I\r\ntrên đàn vịt chưa được tiêm phòng.
\r\n\r\n\r\n\r\n
A.1. Dung dịch kháng khuẩn
\r\n\r\nPenicillin 1.000.000\r\nUI
\r\n\r\nMycostatin 250.000\r\nUI
\r\n\r\nStreptomycin 200\r\nmg
\r\n\r\nKanamycin 1.000.000\r\nUI
\r\n\r\nNước 10\r\nml
\r\n\r\nHòa tan các kháng sinh bằng nước rồi lọc bằng\r\nmàng lọc cỡ 0,45 µm. Bảo quản ở ngăn đá tủ lạnh.
\r\n\r\nA.2. Dung dịch PBS pH 7,2
\r\n\r\nNaCl 8\r\ng
\r\n\r\nKCl 2\r\ng
\r\n\r\nNa2HPO4 1,15\r\ng
\r\n\r\nKH2PO4 0,2\r\ng
\r\n\r\nNước 1000\r\nml
\r\n\r\nChỉnh pH đến 7,2 bằng dung dịch NaOH 1 N hoặc\r\ndung dịch HCl 1 N. Hấp tiệt trùng. Bảo quản ở 4 0C.
\r\n\r\nA.3. Dung dịch NaHCO3 7 %
\r\n\r\nNaHCO3 7\r\ng
\r\n\r\nNước 100\r\nml
\r\n\r\nHấp tiệt trùng và bảo quản ở 4 0C.
\r\n\r\nA.4. Dung dịch L-glutamin 3 %
\r\n\r\nL-glutamin 3\r\ng
\r\n\r\nNước 100\r\nml
\r\n\r\nLọc vô trùng bằng lọc Millipor 0,45 µm, bảo\r\nquản ở - 20 0C.
\r\n\r\nA.5. Canh thang Tryptose Phosphat (TPB)
\r\n\r\nTryptose\r\nphosphat 29,5\r\ng
\r\n\r\nNước 1000\r\nml
\r\n\r\nHấp tiệt trùng, bảo quản ở 4 0C.
\r\n\r\nA.6. Dung dịch trysin 2,5% (10X)
\r\n\r\nTrypsin 2,5\r\ng
\r\n\r\nNước 100\r\nml
\r\n\r\nKhuấy bằng que khuấy từ qua đêm ở 4 0C,\r\nlọc vô trùng bằng lọc Millipor 0,45 µm. Bảo quản ở - 200C
\r\n\r\nA.7. Môi trường nuôi cấy tế bào (MEM)
\r\n\r\nMEM 430\r\nml
\r\n\r\nCanh thang Tryptose phosphat\r\n(TPB) 50\r\nml
\r\n\r\nL-glutamin 3\r\n% 5\r\nml
\r\n\r\nNaHCO3 7\r\n% 5\r\nml
\r\n\r\nKháng sinh (streptomycin và\r\npenicilin) 5\r\nml
\r\n\r\nFCS 5\r\nml
\r\n\r\nA.8. Chuẩn bị đoạn gen mồi cho quá trình nhân\r\ngen
\r\n\r\nMồi đông khô phải được ly tâm ngắn để chắc chắn\r\nrằng mồi được lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Trước tiên\r\nnên dùng dung dịch đệm TE để hoàn nguyên mồi ở nồng độ 200 pmol/µl làm mồi\r\ngốc.
\r\n\r\nMồi sử dụng ở nồng độ 10 pmol/µl: pha loãng mồi\r\ngốc bằng nước không có nuclease.
\r\n\r\nMồi gốc 10\r\nµl
\r\n\r\nNước không chứa\r\nRNAse 90\r\nµl
\r\n\r\nTổng lượng 100\r\nµl
\r\n\r\n\r\n\r\n
B.1. Chuẩn bị
\r\n\r\nPhôi trứng vịt khỏe mạnh từ 14 ngày tuổi đến\r\n16 ngày tuổi.
\r\n\r\nDung dịch PBS pH 7,2 (A.2) chứa 1 % dung dịch\r\nkháng khuẩn (A.1).
\r\n\r\nDung dịch trypsin 0,25 % [pha loãng 10 lần\r\ntrypsin 2,5 % với PBS pH 7,2 (A.2)]. Môi trường MEM và huyết thanh thai bê\r\nFCS.
\r\n\r\nĐĩa petri, panh, kéo, cốc đong thủy tinh,\r\nchai tam giác vô trùng.
\r\n\r\nB.2. Tiến hành
\r\n\r\nSát trùng trứng bằng cồn 70 %, mổ trứng lấy\r\nphôi vịt.
\r\n\r\nRửa phôi 3 lần bằng dung dịch PBS pH 7,2\r\n(A.2) có chứa 1 % kháng sinh trong đĩa petri. Bộc lộ gan phôi, thu hoạch lấy\r\ngan phôi sang một đĩa petri khác.
\r\n\r\nRửa gan phôi 1 lần đến 2 lần trong dung dịch\r\nPBS pH 7,2 (A.2) có chứa 1 % kháng sinh. Cắt nhỏ gan phôi, đổ vào chai tam\r\ngiác.
\r\n\r\nCho dung dịch trypsin ấm 0,25 % vào để tách\r\ngan phôi và lắc nhẹ 250 r/min trong 15 min.
\r\n\r\nThu hoạch tế bào đã tách trong phần nước\r\ntrong ở trên cho vào môi trường MEM có 10 % FCS.
\r\n\r\nTiếp tục cho dung dịch trypsin 0,25 % vào phần\r\ntổ chức còn lại để tách tiếp tế bào. Thực hiện như vậy 2 lần đến 3 lần.
\r\n\r\nChuyển toàn bộ phần huyễn dịch tế bào thu được\r\nsang ống Falcon 50 ml vô trùng, ly tâm 1500 r/min trong 5 min.
\r\n\r\nĐổ bỏ phần nước trên, giữ lại phần tế bào gan\r\nphôi lắng ở đáy ống Falcon, rửa bằng môi trường MEM.
\r\n\r\nĐếm và pha loãng tế bào với môi trường phát\r\ntriển MEM có 10% FCS, lượng tế bào cần thiết tối thiểu là 4 x 105 tế\r\nbào/ml.
\r\n\r\nChuẩn bị môi trường phát triển MEM có 10 %\r\nFCS, chia vào các chai nuôi cấy với lượng cần thiết (25 ml cho chai T75,\r\n10 ml cho chai T25). Sau đó dùng pipet chuyển dung dịch môi trường có chứa tế\r\nbào ở trên vào các chai với lượng 5ml cho chai T75, 3 ml cho chai T25.
\r\n\r\nĐối với đĩa để nuôi cấy (đĩa 6 giếng, hoặc 24\r\ngiếng hoặc 96 giếng) thì tế bào được pha loãng luôn với môi trường phát triển\r\nMEM có 10 % FCS, rồi chia vào các giếng với tỷ lệ theo quy định để đảm bảo tối\r\nthiểu có 5 x 104 tế bào/ml (với đĩa 6 giếng là 3 ml/giếng, với đĩa 24 giếng\r\nlà 1 ml/ giếng, với đĩa 96 giếng là 100 µl/giếng).
\r\n\r\nSau đó nuôi ở tủ ấm 37 0C có 5 % CO2.\r\nSau 1 ngày đến 2 ngày đổ bỏ môi trường cũ, rửa sạch thảm tế bào bằng dung dịch\r\nPBS (A.2), cho tiếp môi trường phát triển MEM mới vào nuôi tiếp. Khi tế bào mọc\r\nđạt 80 % đến 90 % thì có thể sử dụng.
\r\n\r\n\r\n\r\n
\r\n\r\n
\r\n\r\n
E.1. Chiết tách ARN
\r\n\r\nTheo hướng dẫn của nhà sản xuất.
\r\n\r\nE.2. Tiến hành phản ứng RT-PCR
\r\n\r\nÁp dụng cho bộ Maxime RT-PCR PreMix kit\r\n(iNtRON Biotechnology) (nếu dùng bộ kit khác có thể thay đổi công thức pha\r\nchế)
\r\n\r\n| \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n H2O \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Dung dịch đệm RT- PCR (Tris/HCl và KCl) \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n OptiScript reverse transcriptase \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n dNTP \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n i-StarTaq DN A polymerase \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Mồi xuôi \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Mồi ngược \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Mẫu ARN \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Tổng cộng \r\n | \r\n \r\n | \r\n
\r\n\r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n DHV-1 Com F \r\n | \r\n \r\n Xuôi \r\n | \r\n \r\n AAG-AAG-GAG-AAA-ATY-[C hoặc T]-AAG-GAA-GG \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n DHV-1 Com R \r\n | \r\n \r\n Ngược \r\n | \r\n \r\n TTG-ATG-TCA-TAG-CCC-AAS- [C hoặc G]-ACA-GC \r\n | \r\n
E.3. Chu trình nhân gen
\r\n\r\n| \r\n | \r\n \r\n Chu | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Bước 1 \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Bước 2 \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Bước 3 \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Bước 4 \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Bước 5 \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
E.4. Chạy điện di
\r\n\r\nChuẩn bị thạch agaroze 2 % pha trong dung dịch\r\nTAE 1X hoặc TBE 1X có ethidi bromua (10 µg/µl). Đổ thạch vào khuôn điện di\r\ncó lược.
\r\n\r\nThạch khô, rút lược ra và cho mẫu vào các giếng\r\n(8 µl sản phẩm PCR + 2 µl dung dịch tải).Sử dụng thang chuẩn (Marker) 100 bp trở\r\nlên.
\r\n\r\nChú ý khi chạy PCR phải có mẫu đối chứng\r\ndương và mẫu đối chứng âm đi kèm (mẫu đối chứng âm có thể là nước).
\r\n\r\nE.5. Đọc kết quả
\r\n\r\nMẫu dương tính: Xuất hiện vạch và có kích thước\r\nbằng kích thước mẫu đối chứng dương.Mẫu âm tính: Không có vạch.
\r\n\r\nE.6. Đánh giá kết quả
\r\n\r\nCó vi rút viêm gan vịt typ I trong mẫu bệnh\r\nphẩm nếu kết quả RT-PCR dương tính.
\r\n\r\n\r\n\r\n
File gốc của Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8400-9:2011 về bệnh động vật – quy trình chẩn đoán – phần 9: bệnh viêm gan vịt typ I đang được cập nhật.
Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8400-9:2011 về bệnh động vật – quy trình chẩn đoán – phần 9: bệnh viêm gan vịt typ I
Tóm tắt
| Cơ quan ban hành | Đã xác định |
| Số hiệu | TCVN8400-9:2011 |
| Loại văn bản | Tiêu chuẩn Việt Nam |
| Người ký | Đã xác định |
| Ngày ban hành | 2011-01-01 |
| Ngày hiệu lực | |
| Lĩnh vực | Nông nghiệp |
| Tình trạng | Còn hiệu lực |