CẢNH\r\nBÁO - Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị\r\nvà các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không thể đưa ra được\r\nhết tất cả các vấn đề an toàn liên
Tiêu\r\nchuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh xuất huyết thỏ đối với thỏ ở mọi\r\nlứa tuổi.
\r\n\r\n\r\n\r\nTrong\r\ntiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ và định nghĩa sau:
\r\n\r\nBệnh\r\nxuất huyết thỏ (Rabbit\r\nhaemorrhagic disease)
\r\n\r\nBệnh\r\ntruyền nhiễm cấp tính do vi rút Calici thuộc họ Caliciviridae gây ra cho thỏ ở\r\nmọi lứa tuổi (đặc biệt đối với thỏ 2 tháng tuổi trở lên). Bệnh có biểu hiện là\r\ngây chết nhanh và xuất huyết nặng ở gan, khí quản, phổi,
\r\n\r\n\r\n\r\nChỉ\r\nsử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích và sử dụng nước cất hai lần hoặc\r\nnước đã được khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, trừ khi có quy\r\nđịnh khác.
\r\n\r\nXem\r\nPhụ lục A về mô tả tất cả các dung dịch thuốc thử.
\r\n\r\n-\r\nCồn 70 %.
\r\n\r\n-\r\nKháng huyết thanh chuẩn xuất huyết thỏ.
\r\n\r\n-\r\nKháng nguyên chuẩn xuất huyết thỏ.
\r\n\r\n4. Thiết bị, dụng cụ và động vật thí nghiệm
\r\n\r\n4.1\r\nThiết bị, dụng cụ
\r\n\r\nSử\r\ndụng thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thí nghiệm và cụ thể sau đây:
-\r\nTủ ấm, có thể duy trì nhiệt độ 37oC, 5 % CO2.
\r\n\r\n-\r\nCân phân tích.
\r\n\r\n-\r\nTủ sấy, có thể duy trì nhiệt độ từ 1000C đến 2000C.
\r\n\r\n-\r\nNồi hấp ướt.
\r\n\r\n-\r\nNồi đun cách thủy.
\r\n\r\n-\r\nBuồng cấy.
\r\n\r\n-\r\nMáy ly tâm lạnh, tốc độ tối đa 3000 r/min.
\r\n\r\n-\r\nMáy ly tâm lạnh, tốc độ tối đa 12000 r/min.
\r\n\r\n-\r\nMáy khuấy từ, thanh khuấy từ.
\r\n\r\n-\r\nMáy lắc đĩa 96 giếng làm phản ứng ngưng kết.
\r\n\r\n-\r\nMicropipet đơn kênh cỡ từ 0,5 µl đến 10 µl, 1 µl đến 20 µl, 20 µl đến 200 µl,\r\n100 µl đến 1000 µl.
\r\n\r\n-\r\nMicropipet đa kênh cỡ từ 5 µl đến 50 µl.
\r\n\r\n-\r\nĐầu tip phù hợp\r\nvới các loại micropipet (có lọc và không có lọc).
\r\n\r\n-\r\nĐĩa phản ứng 96 giếng, đáy chữ U.
\r\n\r\n-\r\nMáy đọc ELISA.
\r\n\r\n-\r\nBộ đồ mổ tiểu gia súc.
\r\n\r\n-\r\nỐng nghiệm vô trùng, dung tích 10 ml.
\r\n\r\n–\r\nGiá đựng ống nghiệm.
\r\n\r\n-\r\nỐng effendorf chắt huyết thanh, dung tích 1,5 ml.
\r\n\r\n-\r\nỐng effendorf, dung tích 0,2 ml.
\r\n\r\n–\r\nỐng hút Pasteur.
\r\n\r\n–\r\nPipet khắc độ 1 ml, 5 ml, 10 ml.
\r\n\r\n-\r\nPipet.
\r\n\r\n–\r\nBơm tiêm loại 1 ml, 5 ml và kim tiêm.
\r\n\r\n-\r\nLọ đựng bệnh phẩm 20 ml.
\r\n\r\n–\r\nBộ cối chày sứ.
\r\n\r\n-\r\nĐĩa lồng Petri
\r\n\r\n-\r\nPanh, kéo cắt tổ chức bệnh phẩm.
\r\n\r\n-\r\nĐèn cồn hoặc đèn ga.
\r\n\r\n-\r\nBình nón 100 ml, 250 ml, 500 ml, 1000 ml.
\r\n\r\n–\r\nHộp nhuộm tiêu bản.
\r\n\r\n–Hộp\r\ngiữ ẩm cho lam kính.
\r\n\r\n–\r\nGiấy nhôm bao gói.
\r\n\r\n–
-
–
–
-
4.2\r\nĐộng vật thí nghiệm
\r\n\r\nChuẩn\r\nbị thỏ 3 tháng tuổi khỏe mạnh, không bị bệnh.
\r\n\r\n\r\n\r\n5.1\r\nChẩn đoán lâm sàng
\r\n\r\n5.1.1\r\nĐặc điểm dịch tễ
\r\n\r\nBệnh\r\nxuất huyết thỏ lây truyền do tiếp xúc trực tiếp giữa thỏ khỏe mạnh và thỏ bị\r\nnhiễm bệnh qua các chất bài tiết, chất thải như phân, nước tiểu, thức ăn và các\r\nvật dụng nuôi nhốt, quần áo...
\r\n\r\nVi\r\nrút xuất huyết thỏ lây truyền qua không khí.
\r\n\r\nThỏ\r\nbị bệnh có tỷ lệ chết cao từ 80 % đến 100 %.
\r\n\r\nThỏ\r\nbệnh trở thành vật mang trùng và có thể đào thải vi rút ra ngoài môi trường\r\ntrong vòng 4 tuần sau khi khỏi bệnh.
\r\n\r\n5.1.2\r\nTriệu chứng lâm sàng
\r\n\r\nBệnh\r\nxuất huyết thỏ có thời gian ủ bệnh từ 1 ngày đến 3 ngày.
\r\n\r\nThỏ\r\nnon thường cảm nhiễm với bệnh mạnh nhất, thỏ bị bệnh sẽ chết đột ngột hàng loạt\r\ntrong vòng 6 h đến\r\n24 h mà không biểu hiện triệu chứng.
\r\n\r\nĐối\r\nvới thỏ mắc bệnh, lúc đầu có biểu hiện sốt cao (40,50C) nhưng khó\r\nphát hiện, chỉ khi thỏ có các triệu chứng thì mới nhận ra được thỏ bệnh.
\r\n\r\nThỏ\r\nmắc bệnh có biểu hiện chán ăn, đờ đẫn, co giật, khó thở, ít vận động, chảy máu\r\nmũi và thường bị chết\r\nsau 18 h đến 40 h.
\r\n\r\n5.1.3\r\nBệnh tích
\r\n\r\n5.1.3.1\r\nLấy mẫu
\r\n\r\nLấy\r\nvô trùng gan, thận thỏ nghi mắc bệnh để kiểm tra bệnh tích đại thể, vi thể. Bảo\r\nquản và xử lí mẫu theo\r\n5.2.1.
\r\n\r\n5.1.3.2\r\nBệnh tích đại thể
\r\n\r\n-\r\nTổ chức dưới da bị xuất huyết điểm.
\r\n\r\n-\r\nGan, thận, lách của thỏ bệnh sưng to, xung huyết, xuất huyết.
\r\n\r\n-\r\nHệ hô hấp xung huyết, xuất huyết và chứa nhiều bọt khí, dịch nhầy.
\r\n\r\n-\r\nViêm dạ dày cata, viêm ruột xuất huyết, hạch màng treo ruột sưng to.
\r\n\r\n5.1.3.3\r\nBệnh tích vi thể
\r\n\r\nCác\r\ntế bào gan hoại tử, trong phế nang và tiểu cầu thận có nhiều cục huyết khối.
\r\n\r\n5.2\r\nChẩn đoán phòng thí nghiệm
\r\n\r\n5.2.1\r\nLấy mẫu
\r\n\r\nLấy\r\nvô trùng gan, thận thỏ nghi mắc bệnh để phát hiện kháng nguyên.
\r\n\r\nMẫu\r\nbệnh phẩm là huyết thanh chẩn đoán thỏ mắc bệnh được lấy sau khi thỏ có triệu\r\nchứng lâm sàng tối\r\nthiểu là 10 ngày trở đi đối với thỏ chưa được tiêm phòng bệnh xuất huyết thỏ,\r\nhoặc sau từ 3 tuần đến 4 tuần đối với thỏ đã tiêm phòng bệnh xuất huyết thỏ để\r\nphát hiện kháng thể. Lấy từ 5 mẫu đến 10 mẫu huyết thanh.
\r\n\r\nMẫu\r\nđược lấy ngay sau khi mổ khám, đựng vào lọ hoặc túi nilon sạch có dán nhãn có\r\nghi ngày lấy mẫu, địa điểm lấy mẫu, chủ vật nuôi, lứa tuổi.
\r\n\r\nMẫu\r\nđược bảo quản ở nhiệt độ từ 4 0C đến 8
5.2.2\r\nPhát hiện kháng nguyên
\r\n\r\n5.2.2.1\r\nXử lý bệnh phẩm
\r\n\r\nCho\r\ndung dịch PBS pH 6,4 vào cối sứ có gan hoặc thận thỏ nghi mắc bệnh với tỷ lệ\r\n9:1.
\r\n\r\nNghiền\r\nnát gan hoặc thận thành huyễn dịch 1/10, ly tâm huyễn dịch với tốc độ 3000
Thu\r\ndịch nổi, xử lý vô trùng bằng dung dịch kháng sinh đậm đặc (Phụ lục A) liều\r\nlượng 0,1 ml /10 ml huyễn dịch, để ở nhiệt độ phòng trong 30 min hoặc lọc qua\r\nmàng lọc có đường kính 0,45 m. Huyễn dịch bệnh phẩm đã xử lý dùng để chẩn\r\nđoán phát hiện vi rút bằng các phản ứng HA, HI, phân lập vi rút trên bản động\r\nvật hoặc phản ứng RT-PCR (Phụ lục D), ELISA.
\r\n\r\n5.2.2.2\r\nPhản ứng ngưng kết hồng cầu người typ O (xem Phụ lục B)
\r\n\r\nPhản\r\nứng ngưng kết hồng cầu (phản ứng HA) dùng phát hiện vi rút trong mẫu bệnh phẩm,\r\ncho huyễn dịch\r\nđã xử lý kết hợp với hồng cầu người typ O 0,75 % trên đĩa nhựa chữ U và dung\r\ndịch đệm PBS có pH\r\n6,4.
\r\n\r\nVi\r\nrút xuất huyết thỏ làm ngưng kết hồng cầu người typ O.
\r\n\r\nPhản\r\nứng ngưng kết xảy ra ở độ pha loãng lớn hơn hoặc bằng 1/160 được kết luận là\r\ndương tính.
\r\n\r\n5.2.2.3\r\nPhản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu người typ O
Phản\r\nứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (phản ứng HI) dùng để giám định vi rút xuất\r\nhuyết thỏ hoặc kiểm tra kháng thể kháng vi rút xuất huyết thỏ trong huyết\r\nthanh.
\r\n\r\nChuẩn\r\nbị kháng nguyên: Huyễn dịch bệnh phẩm dương tính theo 5.2.2.2 được pha 8 đơn vị\r\nHA.
\r\n\r\nThực\r\nhiện phản ứng HI với hồng cầu người 2,5 % và dung dịch đệm phosphat pH 6,4. Đọc\r\nkết quả sau 1 h.
\r\n\r\n-\r\nMẫu dương tính: có ngăn trở ngưng kết hồng cầu (thường đạt hiệu giá từ 1/20 đến\r\n1/80). -\r\nMẫu âm tính: không có ngăn trở ngưng kết hồng cầu.
\r\n\r\n5.2.2.4\r\nPhân lập vi rút
\r\n\r\n5.2.2.4.1\r\nCách tiến hành
\r\n\r\nTiêm\r\nbắp huyễn dịch bệnh phẩm cho 3 thỏ, mỗi con với liều 1 ml huyễn dịch. Theo dõi\r\ntriệu chứng, bệnh tích thỏ được tiêm bệnh phẩm trong vòng 5 ngày đến 7 ngày.
\r\n\r\nNếu\r\nbệnh phẩm có vi rút, thỏ sẽ có triệu chứng lâm sàng như miêu tả trong 5.1.2,\r\nthỏ chết mổ khám sẽ thấy bệnh tích giống như miêu tả trong 5.1.3. Sau đó thu\r\nhoạch gan, thận và xử lý theo 5.2.2.1.
\r\n\r\nLàm\r\nphản ứng ngưng kết hồng cầu người typ O (Phụ lục C) và giám định vi rút các mẫu\r\ndương tính HA\r\nbằng phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu typ O với kháng thể kháng vi rút xuất\r\nhuyết thỏ chuẩn như\r\ntrong 5.2.2.3 để kết kuận.
\r\n\r\n5.2.2.4.2\r\nĐánh giá kết quả
\r\n\r\n-\r\nNếu phản ứng HA và HI dương tính, có vi rút xuất huyết thỏ trong bệnh phẩm.
\r\n\r\n-\r\nNếu kết quả HA dương tính và HI âm tính, có thể có vi rút xuất huyết thỏ nhưng\r\nlượng vi rút ít nên tiếp\r\ntục phân lập lần 2 lặp lại như mô tả (5.2.2.4.1).
\r\n\r\n-\r\nNếu kết quả HA âm tính và HI âm tính, kết luận trong mẫu bệnh phẩm không có vi\r\nrút xuất huyết thỏ.
\r\n\r\n5.2.2.5\r\nPhát hiện\r\nkháng nguyên bằng phương pháp ELISA
\r\n\r\nSử\r\ndụng huyễn dịch bệnh phẩm (5.2.2.1) hoặc huyết thanh của thỏ ốm để tiến hành\r\nthực hiện phản ứng. Khi sử dụng kít ELISA, thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản\r\nxuất.
\r\n\r\n5.2.2.6\r\nPhát hiện kháng nguyên bằng phương pháp PCR
\r\n\r\nSử\r\ndụng huyễn dịch bệnh phẩm (5.2.2.1), tiến hành chiết tách RNA và nhân gen để\r\nchẩn đoán sự có mặt\r\ncủa vi rút. Khi sử dụng kít chiết tách và nhận gen, thực hiện theo hướng dẫn\r\ncủa nhà sản xuất.
\r\n\r\n5.2.3\r\nPhát hiện kháng thể
\r\n\r\n5.2.3.1\r\nNguyên tắc
\r\n\r\nSử\r\ndụng huyết thanh của thỏ ốm để chẩn đoán bệnh xuất huyết thỏ khi chưa tiêm\r\nphòng, hoặc nhiễm vi rút xuất huyết thỏ từ trước đó. Cũng có thể kiểm tra hiệu\r\ngiá kháng thể sau tiêm phòng vacxin xuất huyết thỏ.
\r\n\r\n5.2.3.2\r\nPhản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu người nhóm O
\r\n\r\na)\r\nXử lý huyết thanh làm HI để phát hiện kháng thể xuất huyết thỏ:
\r\n\r\n-\r\nVô hoạt bổ thể ở 56 0C trong 30 min.
\r\n\r\n-\r\nXử lý với dung dịch kaolin 25 % (Phụ lục A) trong 20 min ở nhiệt độ phòng theo\r\ntỷ lệ 1 phần huyết thanh với 9 phần dung dịch kaolin 25 %, ly tâm 1500g
-\r\nXử lý với hồng cầu người typ O: Cho 1 phần hồng cầu người typ O đậm độ 50 % và\r\n9 phần dịch nổi ở\r\ntrên. Lắc đều để ở nhiệt độ phòng trong 20 min, ly tâm 1500g
b)\r\nTiến hành phản ứng HI (xem Phụ lục C)
\r\n\r\n-\r\nPhát hiện kháng thể Xuất huyết thỏ bằng phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu\r\nngười typ O với kháng\r\nnguyên chuẩn xuất huyết thỏ,
\r\n\r\n-\r\nHiệu giá kháng thể được tính ở độ pha loãng huyết thanh cao nhất còn có hiện\r\ntượng ngăn trở ngưng kết hồng cầu.
\r\n\r\n-\r\nMẫu huyết thanh có hiệu giá lớn hơn hoặc bằng 1/80 được đánh giá là dương tính\r\nđối với thỏ nghi bệnh\r\nchưa tiêm phòng,
\r\n\r\n5.2.3.3\r\nPhương pháp ELISA phát hiện kháng thể
\r\n\r\nSử\r\ndụng mẫu bệnh phẩm là huyết thanh của thỏ ốm.
\r\n\r\nKhi\r\nsử dụng kít ELISA, thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
\r\n\r\n\r\n\r\nThỏ\r\nđược xác định mắc bệnh xuất huyết thỏ khi có các đặc điểm dịch tễ học, triệu\r\nchứng lâm sàng, giải phẫu bệnh tích của bệnh xuất huyết thỏ và kết quả dương\r\ntính với một trong những phương pháp sau:
\r\n\r\n-\r\nPhản ứng ngưng kết hồng cầu người typ O (HA) và phản ứng ngăn trở hồng cầu\r\nngười typ O (HI) dương tính hoặc phản ứng RT-PCR hoặc rRT-PCR dương tính.
\r\n\r\n-\r\nPhát hiện thấy kháng thể trong trường hợp chưa tiêm vacxin xuất huyết thỏ.
\r\n\r\n\r\n\r\n
A.1\r\nDung dịch kháng sinh đậm đặc
\r\n\r\nPenicillin\r\n 106 IU
\r\n\r\nStreptomycin\r\n 1 g
\r\n\r\nMycostatin\r\n x 105 U
\r\n\r\nPolymixin\r\n 15 x 104 U
\r\n\r\nKanamycin\r\n 1 g
\r\n\r\nNước\r\n 10 ml
\r\n\r\nLắc\r\nđều cho tan, lọc vô trùng bằng màng lọc cỡ 0,45 µl và bảo quản ở âm 20 0C.
\r\n\r\nA.2\r\nDung dịch muối đệm phosphat (PBS) pH 7,2
\r\n\r\nNatri\r\nclorua (NaCl) 8,5 g
\r\n\r\nDinatri\r\nhydrophosphat (Na2HPO4)\r\n1,15 g
\r\n\r\nKali\r\ndihydrophosphat (KH2PO4)\r\n0,2 g
\r\n\r\nKali\r\nclorua (KCl) 0,2 g
\r\n\r\nNước\r\n 1000 ml
\r\n\r\nChỉnh\r\npH bằng dung dịch NaOH 1 N hoặc dung dịch HCl 1 N. Hấp vô trùng ở 121 0C\r\ntrong 30 min.
\r\n\r\nGiữ\r\ntrong tủ mát ở 4 0C đến 8 0C trong 2 tuần.
\r\n\r\nA.3\r\nDung dịch PBS pH 6,4
\r\n\r\nNaCl\r\n 8,5 g
\r\n\r\nNa2HPO4 2,53\r\ng
\r\n\r\nKH2PO4\r\n 6,66 g
\r\n\r\nNước\r\n 1000 ml
\r\n\r\nChỉnh\r\npH bằng dung dịch NaOH 1 N hoặc dung dịch HCl 1 N. Hấp vô trùng ở 121 0C\r\ntrong 30 min.
\r\n\r\nGiữ\r\ntrong tủ mát ở 4 0C đến 8 0C trong 2 tuần.
\r\n\r\nA.4\r\nDung dịch PBS pH 9,0
\r\n\r\nAxit\r\nboric 3,092 g
\r\n\r\nNaOH\r\n 0,96 g
\r\n\r\nNaCl\r\n 7,012 g
\r\n\r\nNước\r\n 1200 ml
\r\n\r\nHấp\r\nvô trùng ở 121 0C trong 30 min.
\r\n\r\nGiữ\r\ntrong tủ mát ở 4 0C đến 8 0C trong 3 tháng.
\r\n\r\nA.5\r\nDung dịch hồng cầu người typ O 0,75 %
\r\n\r\nHồng\r\ncầu người typ O rửa sạch: 0,75 ml
\r\n\r\nDung\r\ndịch PBS pH 6,4: 100 ml
\r\n\r\nLắc\r\nđều, giữ trong tủ mát ở 4 0C đến 8 0C. Pha dùng\r\ntrong ngày.
\r\n\r\nA.6\r\nDung dịch hồng cầu người typ O 2,5 %
\r\n\r\nHồng\r\ncầu người typ O rửa sạch: 2,5 ml
\r\n\r\nDung\r\ndịch PBS pH 6,4: 100 ml
\r\n\r\nLắc\r\nđều, giữ trong tủ mát ở 4 0C đến 8 0C. Pha dùng\r\ntrong ngày.
\r\n\r\nA.7\r\nDung dịch kaolin 25 %
\r\n\r\nBột\r\nkaolin 10 g
\r\n\r\nDung\r\ndịch PBS pH 9,0 40 ml
\r\n\r\nLắc\r\nđều, giữ trong tủ mát ở 4 0C đến 8 0C trong 3\r\ntháng.
\r\n\r\n\r\n\r\n
B.1\r\nNguyên liệu
\r\n\r\n-\r\nHồng cầu người typ O 0,75 % (A.5)
\r\n\r\n-\r\nHuyễn dịch bệnh phẩm 10 % trong PBS pH 6,4 (hoặc kháng nguyên chuẩn xuất huyết\r\nthỏ) - Dung dịch PBS pH 6,4 (A.3)
\r\n\r\nB.2\r\nTrình tự tiến hành phản ứng
\r\n\r\nDùng\r\nđĩa ngưng kết 96 giếng, đáy chữ U
\r\n\r\nCho\r\n25 m
Cho\r\n25 m
Pha\r\nloãng kháng nguyên: Trộn đều huyễn dịch hoặc kháng nguyên với PBS ở giếng 1,\r\nhút 25 m
Cho\r\nhồng cầu người 0,75 % vào mỗi giếng 25 ml,\r\nlắc nhẹ trên máy lắc 1 min. Để đĩa phản ứng ở nhiệt độ phòng. Đọc kết quả\r\nsau 30 min đến 60 min.
\r\n\r\n-\r\nPhản ứng dương tính: Có hạt ngưng kết lấm chấm.
\r\n\r\n-\r\nPhản ứng âm tính: Hồng cầu lắng xuống đáy tạo thành chấm tròn.
\r\n\r\nHiệu\r\ngiá ngưng kết HA được tính ở độ pha loãng kháng nguyên cao nhất còn xuất hiện\r\nngưng kết hoàn toàn. Ví dụ: giếng cuối cùng còn có ngưng kết hoàn toàn ở cột 8,\r\nhiệu giá HA = 1/256 (hay 8 log2).
\r\n\r\n| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n |||||||||||
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n ||
| \r\n Pha\r\n loãng kháng nguyên xuất 25 ml.\r\n huyết thỏ \r\n | \r\n \r\n PBS, | \r\n \r\n 25 \r\n | \r\n \r\n 25 \r\n | \r\n \r\n 25 \r\n | \r\n \r\n 25 \r\n | \r\n \r\n 25 \r\n | \r\n \r\n 25 \r\n | \r\n \r\n 25 \r\n | \r\n \r\n 25 \r\n | \r\n \r\n 25 \r\n | \r\n \r\n 25 \r\n | \r\n \r\n 25 \r\n | \r\n \r\n 25 \r\n | \r\n
| \r\n \r\n | \r\n \r\n Kháng\r\n nguyên huyễn dịch bệnh phẩmml \r\n | \r\n \r\n 25 \r\n | \r\n \r\n Trộn\r\n đều, chuyển 25 m | \r\n ||||||||||
| \r\n \r\n | \r\n \r\n Hồng\r\n cầu 0,75 %, m | \r\n \r\n \r\n | \r\n \r\n 25 \r\n | \r\n \r\n 25 \r\n | \r\n \r\n 25 \r\n | \r\n \r\n 25 \r\n | \r\n \r\n 25 \r\n | \r\n \r\n 25 \r\n | \r\n \r\n 25 \r\n | \r\n \r\n 25 \r\n | \r\n \r\n 25 \r\n | \r\n \r\n 25 \r\n | \r\n \r\n 25 \r\n | \r\n
| \r\n Cho\r\n hồng cầu người typ O \r\n | \r\n \r\n Độ\r\n pha loãng kháng nguyên \r\n | \r\n \r\n 1/2 \r\n | \r\n \r\n 1/4 \r\n | \r\n \r\n 1/8 \r\n | \r\n \r\n 1/18 \r\n | \r\n \r\n 1/32 \r\n | \r\n \r\n 1/64 \r\n | \r\n \r\n 1/128 \r\n | \r\n \r\n 1/256 \r\n | \r\n \r\n 1/512 \r\n | \r\n \r\n 1/1024 \r\n | \r\n \r\n 1/2048 \r\n | \r\n \r\n \r\n | \r\n
| \r\n \r\n | \r\n \r\n \r\n | \r\n \r\n \r\n | \r\n \r\n \r\n | \r\n \r\n \r\n | \r\n \r\n \r\n | \r\n \r\n \r\n | \r\n \r\n \r\n | \r\n \r\n \r\n | \r\n \r\n \r\n | \r\n \r\n \r\n | \r\n \r\n \r\n | \r\n \r\n \r\n | \r\n \r\n \r\n | \r\n
B.3\r\nNhận định kết quả
\r\n\r\n-\r\nNếu HA dương tính: Kết luận có vi rút gây bệnh. Để xác định là vi rút xuất\r\nhuyết thỏ cần phải làm phản ứng HI với kháng huyết thanh dương tính chuẩn xuất\r\nhuyết thỏ.
\r\n\r\n-\r\nNếu phản ứng HA âm tính: Có thể trong bệnh phẩm không có mặt vi rút xuất huyết\r\nthỏ hoặc lượng vi rút quá ít. Vì vậy, cần tiêm truyền bệnh phẩm trên thỏ 3\r\ntháng tuổi không có kháng thể kháng vi rút gây bệnh xuất huyết thỏ và giám định\r\nlại bằng phương pháp HA, HI.
\r\n\r\n\r\n\r\n
C.1\r\nChuẩn bị
\r\n\r\n-\r\nDung dịch PBS pH 6, 4 (A.3)
\r\n\r\n-\r\nHồng cầu người typ O 2,5 % (A.6)
\r\n\r\n-\r\nHuyết thanh kiểm tra (hoặc kháng huyết thanh chuẩn xuất huyết thỏ) được xử lý\r\ntheo 5.2.3.1.
\r\n\r\n-\r\nKháng nguyên chuẩn (hoặc huyễn dịch bệnh phẩm cần kiểm tra xuất huyết thỏ)
\r\n\r\n-\r\nKháng nguyên dùng cho phản ứng HI được pha 8 đơn vị HA.
\r\n\r\nC.2\r\nCách pha và chuẩn độ kháng nguyên 8 đơn vị HA
\r\n\r\nVÍ\r\nDỤ: Hiệu giá kháng nguyên trong phản ứng HA là 1/256 thì 8 HA bằng 1/256 x 8 =\r\n1/32 Pha\r\n8 HA gồm 1 phần kháng nguyên và 31 phần PBS pH 6,4.
\r\n\r\nChuẩn\r\nđộ kháng nguyên 8 HA đã pha bằng phản ứng HA. Nếu kết quả ngưng kết đến giếng\r\nthứ 3, như vậy\r\nkháng nguyên pha đạt. Nếu ngưng kết đến giếng thứ 4 (hoặc hơn) là kháng nguyên\r\npha đặc. Nếu ngưng\r\nkết chỉ ở giếng đầu tiên hoặc giềng thứ 2 là kháng nguyên pha loãng. Dựa vào\r\nkết quả đó để bổ xung\r\nthêm kháng nguyên hoặc PBS để có kháng nguyên 8 HA chuẩn.
\r\n\r\nC.3\r\nCách tiến hành phản ứng
\r\n\r\nDùng\r\nđĩa ngưng kết 96 giếng, đáy chữ U.
\r\n\r\nCho\r\nPBS vào mỗi giếng 25 ml\r\ntừ giếng 2 đến giếng 12.
\r\n\r\nCho\r\n50 m
Pha\r\nloãng huyết thanh: Trộn đều huyết thanh với PBS ở giếng 2, rồi hút 25
Cho\r\n25 m
Cho\r\nhồng cầu người typ O 2,5 %: mỗi giếng 25 ml, lắc nhẹ 1 min. Để đĩa phản ứng ở nhiệt độ phòng.
Mỗi\r\nđĩa phản ứng phải có mẫu đối chứng kháng nguyên chuẩn hoặc kháng thể chuẩn làm\r\ntương tự như\r\nmẫu cần chẩn đoán để đảm bảo 8 HA trong 25 ml đã được sử dụng cho phản ứng là đúng, mục đích là để\r\nkiểm soát mẫu huyết thanh và mẫu bệnh phẩm khi làm phản ứng.
\r\n\r\nC.4\r\nĐọc kết quả
\r\n\r\n-\r\nPhản ứng dương tính: Hồng cầu lắng xuống đáy, chứng tỏ kháng nguyên và kháng\r\nthể tương ứng.
\r\n\r\nHiệu\r\ngiá kháng thể được tính ở độ pha loãng cao nhất còn có hiện tượng ức chế ngưng\r\nkết hoàn toàn.
\r\n\r\n-\r\nPhản ứng âm tính: Có hạt ngưng kết lấm tấm. Chứng tỏ không có sự kết hợp giữa\r\nkháng nguyên và kháng\r\nthể trong phản ứng.
\r\n\r\nC.5\r\nĐánh giá kết quả
\r\n\r\nMẫu\r\nlà huyết thanh kiểm tra kháng thể: Những thỏ chưa được chủng vắc xin có kháng\r\nthể lớn hơn hoặc bằng 1/80 thì mẫu đó được coi là nhiễm vi rút xuất huyết thỏ.
\r\n\r\nMẫu\r\nlà kháng nguyên (huyễn dịch bệnh phẩm, huyễn dịch sau phân lập):
\r\n\r\n-\r\nNếu có hiện tượng ức chế ngưng kết với kháng huyết thanh xuất huyết thỏ chuẩn\r\nthì vi rút phân lập được\r\nlà vi rút xuất huyết thỏ.
\r\n\r\n-\r\nNếu không có hiện tượng ức chế ngưng kết, mà HA dương tính cần phân lập tiếp\r\ntrên thỏ.
\r\n\r\n\r\n\r\n
D.1\r\nChiết tách RNA
\r\n\r\nRneasy\r\nExtraction cat # 74104 50 prep hoặc # 74106 250 prep theo quy trình dưới đây.
-\r\nME, lắc đều trên máy Vortex rồi ly tâm nhẹ.b\r\nbuffer RLT có 1 % Ò
l\r\ncồn 70 % vào ống, lắc mạnh bằng máy Vortex rồi ly tâm nhẹ;
Qiagen,\r\nly tâm trong 15 s gia tốc ≥ 8000g ở nhiệt độ phòng;
Qiagen,\r\nly tâm trong 15 s ở tốc độ ≥ 8000g, thay ống thu mới vào cột lọc;
và\r\nly tâm trong 15 s ở gia tốc ≥ 8000g, thay ống thu mới, lặp lại 2 lần với dung\r\ndịch rửa RPE buffer;Ò
Thay\r\nống thu mới, ly tâm cột lọc và ống thu trong 2 min ở tốc độ tối đa, bỏ ống thu;
\r\n\r\nl\r\nnước không chứa RNase vào cột lọc, ủ ở nhiệt độ phòng trong ít nhất 1 min. Tách\r\nRNA bằng cách ly tâm trong 1 min ở gia tốc ≥ 8000g, bỏ cột lọc, giữ lại dung\r\ndịch trong ống thu RNA;m
Bảo\r\nquản mẫu RNA thu được ở 4 0C trong thời gian ngắn trước khi làm\r\nRT-PCR, nếu sau 24 h, nên bảo quản mẫu ở âm 20 0C hoặc nhiệt độ thấp\r\nhơn.
\r\n\r\nD.2\r\nCách tiến hành
\r\n\r\nD.2.1\r\nChuẩn bị cặp mồi
\r\n\r\nCặp\r\nmồi được thiết kế dựa trên đoạn gen mã hóa protein bám gắn của vi rút để khuếch\r\nđại một sản phẩm có kích thước 269 bp. Cặp mồi có trình tự như sau:
\r\n\r\n| \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Mồi\r\n xuôi \r\n | \r\n \r\n 5’-d\r\n CAGCCGTACTGAGCCAGATGTA -3’ \r\n | \r\n
| \r\n Mồi\r\n ngược \r\n | \r\n \r\n 5’-d\r\n AAGGACTAGTGGGAACAAGG- 3’ \r\n | \r\n
Cặp\r\nmồi này được sử dụng ở nồng độ 10 µM
\r\n\r\nD.2.2\r\nThực hiện phản ứng PCR
\r\n\r\nPha\r\nhỗn hợp phản ứng (hỗn hợp mẹ).
\r\n\r\nVÍ\r\nDỤ: Sử dụng kít Platinium Quantitative PCR Superscript II của hãng Invitrogen,\r\nCo., USA
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Nước\r\n cất siêu sạch không có men Nuclease \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Superscript\r\n II reverse transcriptase mix \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Mồi\r\n xuôi \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Mồi\r\n ngược \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Mẫu\r\n RNA \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Tổng\r\n lượng \r\n | \r\n \r\n | \r\n
Để\r\ntính lượng hỗn hợp phản ứng cho nhiều phản ứng, lấy lượng nguyên liệu cho một\r\nphản ứng nhân với tổng số mẫu và các đối chứng.
\r\n\r\nSau\r\nkhi pha hỗn hợp phản ứng, chia 20 µl hỗn hợp mẹ vào các ống PCR, sau đó cho 5\r\nµl RNA mẫu và đối chứng vào các ống thích hợp, ly tâm nhanh, rồi đặt ống PCR\r\nvào máy PCR.
\r\n\r\nChạy\r\nphản ứng theo chu trình nhiệt như sau:
\r\n\r\n| \r\n Chu | \r\n \r\n Chu | \r\n \r\n Chu | \r\n
| \r\n 42 | \r\n \r\n 30\r\n x (94 o | \r\n \r\n 72 | \r\n
| \r\n 94 | \r\n \r\n Giữ\r\n ở 4 o | \r\n
D.2.3\r\nĐiện di và hiển thị sản phẩm PCR
\r\n\r\nPha\r\n1,2 g bột agarose (gel) với 100 ml 1xTAE, rồi đun nóng trong lò vi sóng cho đến\r\nkhi tan hoàn toàn. Khi hỗn hợp nguội bớt có thể chạm tay vào, cho tiếp 2 µl\r\netidi bromua (10 mg/ml) vào. Sau đó đổ gel vào khay gel và cắm lược. Để gel\r\ncứng lại trong khoảng 1 h, rồi rút lược ra.
\r\n\r\nĐổ\r\nđầy dung dịch 1xTAE vào bể điện di (đến vạch full level), đặt khay gel vào vị\r\ntrí trong bể điện di. Pha 2 ul loading dye với 4 µl 100 bp lader rồi đưa vào\r\ngiếng đầu tiên của miếng Gel. Pha 2 µl loading dye vơi 8 µl mẫu (đối chứng âm\r\nvà dương) rồi đưa vào các giếng còn lại của miếng Gel.
\r\n\r\nĐiện\r\ndi gel ở 80 V đến 100 V trong 30 min đến 40 min.
\r\n\r\nD.3\r\nĐọc kết quả
\r\n\r\nĐặt\r\ngel đã điện di vào máy chiếu UV (UV transilluminator) có bước sóng 590 nm. Các\r\nmẫu có hiển thị band sản phẩm kích thước 269 bp là dương tính.
\r\n\r\nPhụ\r\nlục E
\r\n\r\n(Quy\r\nđịnh)
\r\n\r\nKỹ\r\nthuật làm phản ứng rRT-PCR
\r\n\r\n\r\n\r\n
E.1\r\nChiết tách RNA
\r\n\r\nXem\r\nPhụ lục D.
\r\n\r\nE.2\r\nCách tiến hành
\r\n\r\nE.2.1\r\nChuẩn bị cặp mồi
\r\n\r\nCác\r\nmồi xuôi và mồi ngược và mẫu dò được thiết kế đặc hiệu để phát hiện gen RNA pol\r\ncủa vi rút Calici thuộc họ Caliciviridae.
\r\n\r\n| \r\n Cặp\r\n mồi \r\n | \r\n \r\n Trình\r\n tự \r\n | \r\n
| \r\n Mồi\r\n xuôi \r\n | \r\n \r\n 5’-d\r\n ACYTYACTAAACTYATTGACG -3’ \r\n | \r\n
| \r\n Mồi\r\n ngược \r\n | \r\n \r\n 5’-d\r\n TCAGACATAAGAAAAGAAATTGG- 3’ \r\n | \r\n
| \r\n Mẫu\r\n dò \r\n | \r\n \r\n FAM\r\n - CCAARAGCACRCTCGTGTTCAACCT- TAMRA \r\n | \r\n
Cặp\r\nmồi này được sử dụng ở nồng độ 10 µM
\r\n\r\nCông\r\nthức pha hỗn hợp mẹ (master mix) có thể thay đổi cho phù hợp với từng loại cặp\r\nmồi và từng loại kít rRT-PCR khác nhau. Dưới đây quy trình giới thiệu 1 bộ kit.
\r\n\r\nCông\r\nthức áp dụng cho kít RT-PCR của hãng Invitrogen
\r\n\r\n\r\n\r\n
| \r\n Hỗn\r\n hợp mẹ \r\n | \r\n \r\n Lượng\r\n cho 01 phản ứng, µl \r\n | \r\n
| \r\n Nước \r\n | \r\n \r\n 5,5 \r\n | \r\n
| \r\n 2X\r\n Reaction buffer \r\n | \r\n \r\n 12,5 \r\n | \r\n
| \r\n Enzym\r\n mix \r\n | \r\n \r\n 0,5 \r\n | \r\n
| \r\n Mồi\r\n xuôi \r\n | \r\n \r\n 0,5 \r\n | \r\n
| \r\n Mồi\r\n ngược \r\n | \r\n \r\n 0,5 \r\n | \r\n
| \r\n Mẫu\r\n dò \r\n | \r\n \r\n 0,5 \r\n | \r\n
| \r\n Mẫu\r\n RNA \r\n | \r\n \r\n 5 \r\n | \r\n
| \r\n Tổng\r\n cộng \r\n | \r\n \r\n 25 l \r\n | \r\n
\r\n\r\n
E.2.2\r\nThực hiện phản ứng PCR
\r\n\r\nĐặt\r\nống phản ứng vào máy chu kỳ nhiệt và chọn chương trình chạy PCR bằng phần mềm\r\ntrên máy vi tính. Nhập ký hiệu mẫu kiểm tra cùng với mẫu đối chứng dương tính,\r\nâm tính vào phần Ký hiệu mẫu trong bảng kết quả. Lưu chương trình chạy máy. Cài\r\nđặt chương trình phân tích dữ liệu cho máy chu kỳ nhiệt (ví dụ: máy Cepheid\r\nSmart Cycler hoặc Biorad IQ5) và chạy chương trình.
\r\n\r\nChạy\r\nphản ứng theo chu trình nhiệt như sau:
\r\n\r\n| \r\n Chu | \r\n \r\n Chu | \r\n \r\n Chu | \r\n
| \r\n 50oC,\r\n 30 min; \r\n | \r\n \r\n 45\r\n x (94oC, 3 s; 55oC, 45 s) \r\n | \r\n \r\n 68oC,\r\n 45 s; \r\n | \r\n
| \r\n 94oC,\r\n 2 min \r\n | \r\n \r\n Giữ\r\n ở 4oC \r\n | \r\n
\r\n\r\n
E.3\r\nPhân tích kết quả
\r\n\r\nCác\r\ngiá trị mặc định đã được thiết lập trong chương trình chạy của máy Realtime\r\nRT-PCR để phát hiện vi rút xuất huyết thỏ. Mẫu đối chứng dương tính (được\r\nchuẩn độ trước) phải có giá trị Ct như đã biết (± 2 Ct) và mẫu đối chứng\r\nâm tính phải có Ct = 0 thì kết quả rRT-PCR mới được công nhận.
\r\n\r\nMẫu\r\ncó giá trị Ct ≤ 35 được coi là dương tính. Mẫu không có Ct được coi là âm\r\ntính. Mẫu có giá trị Ct trong khoảng từ 35 đến 40 được coi là nghi ngờ.\r\nNhững mẫu nghi ngờ này cần được xác chẩn bằng phương pháp phân lập vi rút trước\r\nkhi có kết luận chẩn đoán cuối cùng.
\r\n\r\n\r\n\r\n
\r\n\r\n
Từ khóa: Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN8400-6:2011, Tiêu chuẩn Việt Nam số TCVN8400-6:2011, Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN8400-6:2011 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, Tiêu chuẩn Việt Nam số TCVN8400-6:2011 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN8400 6:2011 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, TCVN8400-6:2011
File gốc của Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8400-6:2011 về bệnh động vật – quy trình chẩn đoán – phần 6: bệnh xuất huyết thỏ do Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn ban hành đang được cập nhật.
Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8400-6:2011 về bệnh động vật – quy trình chẩn đoán – phần 6: bệnh xuất huyết thỏ do Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn ban hành
Tóm tắt
| Cơ quan ban hành | Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn |
| Số hiệu | TCVN8400-6:2011 |
| Loại văn bản | Tiêu chuẩn Việt Nam |
| Người ký | Đã xác định |
| Ngày ban hành | 2011-01-01 |
| Ngày hiệu lực | |
| Lĩnh vực | Nông nghiệp |
| Tình trạng | Còn hiệu lực |