Tiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh\r\nphù trên lợn (bệnh phù đầu) do vi khuẩn Escherichia coli (E. coli)\r\ngây ra.
\r\n\r\n\r\n\r\nTrong tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ và định\r\nnghĩa sau:
\r\n\r\nBệnh phù ở lợn (edema disease in pig)
\r\n\r\nBệnh do vi khuẩn E. coli có yếu tố\r\nbám dính Fimbriae 18 (F18) và có khả năng sản sinh độc tố Verotoxin 2e (VT2e)\r\ngây ra.
\r\n\r\nCHÚ THÍCH: Bệnh thường xảy ra vào giai đoạn\r\ncai sữa, khi thay đổi chế độ dinh dưỡng. Trong ruột non, những chủng E.\r\ncoli có nhân tố bám dính F18 nhân lên nhanh chóng, bám vào thành ruột\r\nvà sản sinh độc tố VT2e. Độc tố được hấp thu vào máu, tác động vào các tế\r\nbào biểu mô của các vi mạch quản làm tăng tính thẩm thấu qua thành mạch gây ra\r\nphù và các triệu chứng thần kinh điển hình như: đi lại loạng choạng, xiêu vẹo,\r\nco giật hay liệt.
\r\n\r\nChỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân\r\ntích và sử dụng nước cất hoặc nước đã khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết\r\ntương đương không có Rnase, trừ có quy định khác.
\r\n\r\n- Cồn etanol 70 %, 90 %.
\r\n\r\n- Thuốc thử Kovac’s.
\r\n\r\n- Máu bò, bê hoặc cừu.
\r\n\r\n- Môi trường (brain heart infusion ) BHI.
\r\n\r\n- Môi trường (Typtone Soy Broth) TSB.
\r\n\r\n- Thạch MacConkey hay thạch Brilliant green.
\r\n\r\n- Môi trường thạch nghiêng Kligler hay thạch\r\nTriple sugar iron (TSI).
\r\n\r\n- Maltose.
\r\n\r\n- Urê.
\r\n\r\n- Môi trường nước pepton.
\r\n\r\n- Môi trường Voges- Proskauer (VP).
\r\n\r\n- Etanol (C2H6O).
\r\n\r\n- Nguyên liệu cho PCR.
\r\n\r\n- Agarose.
\r\n\r\n- Etidi bromua (EtBr).
\r\n\r\n- Dung dịch TAE hoặc TBE.
\r\n\r\n\r\n\r\nSử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử\r\nnghiệm thông thường và cụ thể như sau:
\r\n\r\n- Tủ ấm, có thể duy trì nhiệt độ 37 oC.
\r\n\r\n- Buồng cấy.
\r\n\r\n- Tủ lạnh.
\r\n\r\n- Que cấy.
\r\n\r\n- Đĩa Petri để đổ môi trường.
\r\n\r\n- Panh.
\r\n\r\n- Kéo.
\r\n\r\n- Nồi hấp ướt (Autoclave).
\r\n\r\n- Tủ sấy khô.
\r\n\r\n- Lò vi sóng.
\r\n\r\n- Cân điện.
\r\n\r\n- Kính hiển vi.
\r\n\r\n- Pipet thủy tinh.
\r\n\r\n- Lọ thủy tinh, dung tích 100 ml, 200 ml, 500\r\nml và 1000 ml.
\r\n\r\n\r\n\r\n5.1 Chẩn đoán lâm sàng
\r\n\r\n5.1.1 Đặc điểm dịch tễ
\r\n\r\n- Bệnh thường xuất hiện ở lợn con sau khi cai\r\nsữa đôi khi ở nái.
\r\n\r\n- Bệnh xuất hiện lẻ tẻ, ít lây lan từ đàn này\r\nsang đàn khác
\r\n\r\n- Lợn bị bệnh thường là những con phát triển\r\nnhanh nhất trong đàn.
\r\n\r\n- Tỉ lệ chết khoảng 65 % đến 90 %.
\r\n\r\n5.1.2 Triệu chứng lâm sàng
\r\n\r\n- Một hoặc nhiều lợn bị chết đột ngột mà\r\nkhông biểu hiện triệu chứng lâm sàng.
\r\n\r\n- Có biểu hiện rối loạn thần kinh bao gồm: đi\r\nlại loạng choạng, xiêu vẹo, co giật hay bị liệt.
\r\n\r\n- Phù ở mí mắt, ở mặt, phần bụng phù và sưng\r\nto.
\r\n\r\n- Thở khó, kêu khàn khàn do thanh quản bị\r\nphù.
\r\n\r\n- Bỏ ăn, bỏ bú.
\r\n\r\n- Lợn thường chết trong vòng từ 4 h đến 48 h\r\nsau khi có triệu chứng lâm sàng.
\r\n\r\n5.1.3 Bệnh tích đại thể
\r\n\r\n- Phù dưới da toàn thân.
\r\n\r\n- Phù ở mí mắt, kết mạc, đường cong lớn dạ\r\ndày.
\r\n\r\n- Có dịch nhầy ở dưới niêm mạc dạ dày.
\r\n\r\n- Tràn dịch màng tim, màng phổi, xoang bụng\r\ntích nước.
\r\n\r\n5.1.4 Lấy mẫu
\r\n\r\nBệnh phẩm gồm: ruột non (phần hồi tràng), ruột\r\nkết
\r\n\r\nLấy vô trùng khoảng 50 g đến 100 g mỗi loại bệnh\r\nphẩm, cho vào từng lọ hay túi ni lon vô trùng riêng biệt, đậy kín, bảo quản\r\ntrong điều kiện lạnh từ 2 oC đến 8 oC và gửi về phòng thí nghiệm chậm\r\nnhất 24 h sau khi lấy mẫu.
\r\n\r\nGửi kèm theo bệnh phẩm giấy yêu cầu xét nghiệm\r\ncó ghi rõ triệu chứng, bệnh tích và đặc điểm dịch tễ.
\r\n\r\n5.2 Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm
\r\n\r\n5.2.1 Phân lập vi khuẩn
\r\n\r\nLấy một vòng que cấy chất chứa của ruột (dịch\r\nnhày của niêm mạc ruột), tại ba vị trí khác nhau, cấy vào môi trường thạch\r\nmáu và thạch MacConkey hoặc thạch Brilliant green. Nuôi cấy ở 37 oC trong\r\nđiều kiện hiếu khí từ 18 h đến 24 h.
\r\n\r\nTrên môi trường thạch MacConkey khuẩn lạc E.\r\ncoli có dạng tròn màu hồng đậm, nhám hoặc trơn đường kính 2 - 4 mm.
\r\n\r\nTrên môi trường thạch Brilliant green khuẩn lạc E.\r\ncoli có dạng tròn màu vàng chanh.
\r\n\r\nTrên Thạch máu: Khuẩn lạc màu trắng xám, tròn,\r\nbóng và thường gây dung huyết.
\r\n\r\nChọn khuẩn lạc nghi ngờ cấy vào môi trường thạch\r\nthường hay nước thịt BHI hoặc môi trường TSB để kiểm tra đặc tính sinh hóa và\r\ngiám định độc lực.
\r\n\r\n5.2.2 Giám định vi khuẩn
\r\n\r\n5.2.2.1 Giám định đặc tính sinh hóa
\r\n\r\nCó thể dựa vào một số đặc tính sinh hóa quy định\r\ntại Bảng 1 hoặc Bảng 2 để xác định vi khuẩn E. coli.
\r\n\r\nBảng 1 - Đặc tính sinh hóa của E. coli
\r\n\r\n| \r\n Vi khuẩn \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n E. coli \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
- Xác định đặc tính lên men đường sucrose,\r\nlactose, sinh H2S theo quy định tại Phụ lục A.
\r\n\r\n- Xác định đặc tính lên men đường manitol\r\ntheo quy định tại Phụ lục A.
\r\n\r\n- Khả năng phân giải ure theo quy định tại Phụ\r\nlục A.
\r\n\r\nBảng 2: Đặc tính sinh hóa của E.\r\ncoli (ph n ng IMViC)
\r\n\r\n| \r\n Vi khuẩn \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n E. coli \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
Xác định đặc tính sinh hóa theo quy định tại\r\nPhụ lục A.
\r\n\r\n5.2.3 Xác định gene quy định yếu tố độc lực\r\nF18 và VT2e
\r\n\r\nSử dụng phương pháp PCR (Polymerase Chain\r\nReaction) với các cặp mồi đặc hiệu để phát hiện genemã hóa cho yếu tố bám dính\r\nF18 và toxin VT2e như trong Bảng 3.
\r\n\r\nBảng 3 - Các cặp mồi và chu trình nhiệt cho\r\nPCR
\r\n\r\n| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n Chu | \r\n
| \r\n F18 \r\n | \r\n \r\n Fed A1 \r\n | \r\n \r\n GTGAAAAGACTAGTGTTTATTTC \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n 94oC, 5 min ; \r\n | \r\n
| \r\n FedA2 \r\n | \r\n \r\n CTTGTAAGTAACCGCGTAAGC \r\n | \r\n \r\n Chu trình 30 vòng: \r\n | \r\n ||
| \r\n VT2e a) \r\n | \r\n \r\n VTe-a \r\n | \r\n \r\n CCTTAACTAAAAGGAATATA \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n (94oC, 1 min; \r\n | \r\n
| \r\n VTe-b \r\n | \r\n \r\n CTGGTGGTGTATGATTAATA \r\n | \r\n \r\n 55oC, 1 min; \r\n | \r\n ||
| \r\n VT2e a) \r\n | \r\n \r\n STII-Bv1 \r\n | \r\n \r\n ATGAAGAAGATGTTTATAGCG \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n 72oC, 1 min) \r\n | \r\n
| \r\n STII-Bv2 \r\n | \r\n \r\n GTTAAACTTCACCTGGGCAAAG \r\n | \r\n \r\n 72oC, 7 min. Giữ: 4oC \r\n | \r\n ||
| \r\n | \r\n \r\n \r\n | \r\n |||
Tiến hành phản ứng PCR theo quy định tại Phụ\r\nlục B.
\r\n\r\n\r\n\r\nLợn được xác định là mắc bệnh phù (phù đầu)\r\nkhi:
\r\n\r\nCó đặc điểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng, bệnh\r\ntích điển hình của bệnh và phân lập được vi khuẩn
\r\n\r\nE. coli mang yếu tố độc lực F18 và VT2e.
\r\n\r\n\r\n\r\n
A.1 Đặc tính lên men đường sucrose, lactose,\r\nmanitol, sinh H2S và phân giải ure
\r\n\r\nA.1.1 Lên men đường sucrose, lactose, sinh\r\nH2S
\r\n\r\nA.1.1.1 Môi trường
\r\n\r\nChuẩn bị môi trường TSI hay Kligler (theo hướng\r\ndẫn của nhà sản xuất).
\r\n\r\nThạch nghiêng chế từ Kligler hoặc TSI. Thạch\r\nmàu đỏ và có 2 phần: phần thạch đứng bên dưới để kiểm tra khả năng lên men\r\nđường glucoza, sinh hơi, sinh H2S, phần thạch nghiêng để kiểm tra khả năng lên\r\nmen đường lactoza.
\r\n\r\nA.1.1.2 Tiến hành
\r\n\r\nLấy khuẩn lạc nghi ngờ cấy thẳng (chính giữa\r\nphần thạch đứng) xuống đáy ống nghiệm, rút dần que lên và tiếp tục cấy trên bề\r\nmặt nghiêng, nuôi cấy ở 37 oC trong điều kiện hiếu khí, sau 24 h kiểm tra.
\r\n\r\nA.1.1.3 Đọc kết quả
\r\n\r\nLên men đường lactoza:
\r\n\r\n- Dương tính: Mặt nghiêng màu vàng;
\r\n\r\n- Âm tính: Mặt nghiêng màu hồng.
\r\n\r\nLên men đường glucose:
\r\n\r\n- Dương tính: Phần thạch đứng màu vàng;
\r\n\r\n- Âm tính: Phần thạch đứng màu hồng.
\r\n\r\nKhả năng sinh H2S:
\r\n\r\n- Dương tính: đáy ống nghiệm có màu đen;
\r\n\r\n- Âm tính: đáy ống nghiệm không có màu đen.
\r\n\r\nKhả năng sinh hơi:
\r\n\r\n- Dương tính: Thạch trong ống nghiệm bị nứt\r\nhay có bọt khí;
\r\n\r\n- Âm tính: Thạch trong ống nghiệm không bị nứt\r\nhay có bọt khí.
\r\n\r\nA.1.2 Lên men đường manitol
\r\n\r\nA.1.2.1 Chuẩn bị môi trường
\r\n\r\nPha nước pepton theo chỉ dẫn của nhà sản xuất
\r\n\r\nChuẩn bị chỉ thị màu Andrade
\r\n\r\nThành phần:
\r\n\r\nFuchsin\r\naxit 0,\r\n5 g
\r\n\r\nNước 100\r\nml
\r\n\r\nNaOH 1 N
\r\n\r\nCách pha: Nghiền fuchsin, hoà vào nước cho\r\ntan hết. Cho từ từ lượng dung dịch NaOH 1 N, vừa cho vừa lắc đến khi chuyển\r\nmàu từ đỏ tươi sang đỏ nâu, đến vàng úa, vàng thẫm thì dừng (thường từ 12 ml đến\r\n17 ml). Để lắng từ 1 h đến 2 h, lọc qua giấy lọc. Hấp 120 oC trong 15 min.
\r\n\r\nCho 1 ml chỉ thị màu Andrade vào 100 ml môi\r\ntrường nước pepton, chia ra các ống (4 ml mỗi ống). Hấp 120 0C trong 30\r\nmin.
\r\n\r\nChuẩn bị đường: pha đường thành dung dịch 10\r\n% (trong nuước cất) hấp 110 0C trong 15 min đến 20 min hoặc hấp cách quãng\r\n3 lần 100 oC trong 30 min hoặc lọc qua màng lọc 0,45 µm.
\r\n\r\nCho đường vào các ống môi trường: cho 0,3 ml\r\ndung dịch đường 10 % vào ống chứa 4 ml môi trường.
\r\n\r\nA.1.2.2 Phương pháp kiểm tra và đọc kết quả
\r\n\r\nCấy vi khuẩn đã nuôi cấy thuần khiết vào các ống\r\nmôi trường nước pepton có đường, để vào tủ ấm 37 oC, sau 24 h đọc kết quả.
\r\n\r\n- Phản ứng âm tính: môi trường không thay đổi\r\nmàu.
\r\n\r\n- Phản ứng dương tính: môi trường chuyển màu\r\nđỏ.
\r\n\r\nA.1.3 Phân giải urê
\r\n\r\nCó thể sử dụng môi trường urê cơ bản (Urea\r\nagar base - Christensen) chế môi trường và bổ sung urê theo chỉ dẫn của\r\nnhà sản xuất.
\r\n\r\nCấy vi khuẩn vào môi trường có urê, nuôi cấy ở\r\n37oC, đọc kết quả sau 24 h.
\r\n\r\n- Phản ứng âm tính: môi trường không thay đổi\r\nmàu.
\r\n\r\n- Phản ứng dương tính: môi trường chuyển màu\r\ntím.
\r\n\r\nA.2 Các phản ứng IMViC
\r\n\r\nA.2.1 Phản ứng sinh indol
\r\n\r\nThành phần thuốc thử Kovac’s
\r\n\r\nParadimetylaminobenzaldehyde 5\r\ng
\r\n\r\nAmyl alcohol (cồn\r\namyl) 75\r\nml
\r\n\r\nHCl đặc 25\r\nml
\r\n\r\nCách pha: cho Paradimetylaminobenzaldehyde\r\nvào cồn để vào nước ấm 50 đến 55 oC, lắc đều cho tan, để nguội hoàn toàn,\r\nhay lạnh (4 oC), cho từ từ HCl đặc, vừa cho vừa lắc.
\r\n\r\nBảo quản thuốc thử ở nhiệt độ lạnh khoảng\r\n4 oC trong lọ màu.
\r\n\r\nCấy vi khuẩn vào môi trường nước pepton hoặc\r\nmôi trường nước pepton có bổ sung tryptophan, ủ ở 37 oC. Sau 24 h, nhỏ 0,2\r\nml đến 0,3 ml dung dịch thuốc thử Kovac’s vào môi trường, lắc nhẹ.
\r\n\r\n- Phản ứng dương tính: trên bề mặt môi trường\r\nvòng thuốc thử chuyển màu đỏ.
\r\n\r\n- Phản ứng âm tính: vòng thuốc thử không chuyển\r\nmàu
\r\n\r\nA.2.2 Phản ứng MR
\r\n\r\nThuốc thử phản ứng MR
\r\n\r\nĐỏ\r\nmetyl 0,04\r\ng
\r\n\r\nCồn 95 độ 60\r\nml
\r\n\r\nNước 40\r\nml
\r\n\r\nMôi trường VP-MR pha chế theo hướng dẫn của\r\nnhà sản xuất.
\r\n\r\nCấy vi khuẩn vào môi trường nước VP-MR, nuôi ở\r\n37oC sau 24 h nhỏ vào môi trường đã nuôi cấy vi khuẩn mẫu 5 giọt dung dịch\r\nthuốc thử, đọc kết quả sau 5 min.
\r\n\r\n- Phản ứng dương tính: môi trường chuyển màu\r\nđỏ
\r\n\r\n- Phản ứng âm tính: môi trường có màu vàng.
\r\n\r\nA.2.3 Phản ứng VP
\r\n\r\nPha môi trường VP-MR: Theo chỉ dẫn của nhà sản\r\nxuất. Pha thuốc thử
\r\n\r\n- Dung dịch 1:
\r\n\r\nAlpha naphthol\r\n(C10H7OH) 5\r\ng
\r\n\r\nCồn 96\r\n% 100\r\nml
\r\n\r\n- Dung dịch 2:
\r\n\r\nKOH 40\r\ng
\r\n\r\nNước 100\r\nml
\r\n\r\nTiến hành phản ứng: Cấy vi khuẩn cần kiểm tra\r\nvào môi trường VP-MR, nuôi cấy ở 37 oC, sau 48 h nhỏ vào môi trường nuôi cấy\r\ntrên 0,6 ml dung dịch 1 và 0,2 ml dung dịch 2. Đọc kết quả sau 15 min và 1 h.
\r\n\r\n- Phản ứng dương tính: Môi trường có màu đỏ hồng\r\nđậm.
\r\n\r\n- Phản ứng âm tính: Môi trường có màu vàng hoặc\r\nkhông biến màu.
\r\n\r\nA.2.4 Sử dụng xitrat
\r\n\r\nPha chế môi trường (thạch simon xitrat) theo\r\nquy định của nhà sản xuất. Cấy vi khuẩn vào thạch simon xitrat nuôi ở\r\n37 0C từ 18 h đến 24 h. Vi khuẩn sử dụng xitrat (dương tính) làm môi trường\r\nchuyển từ màu xanh lá cây sang màu xanh nước biển. Âm tính khi môi trường giữ\r\nnguyên màu xanh lá cây.
\r\n\r\n\r\n\r\n
B.1 Chuẩn bị mẫu
\r\n\r\nMẫu kiểm tra có thể là khuẩn lạc hay canh khuẩn\r\nnuôi cấy từ 18 h đến 24 h. Hòa khuẩn lạc nghi ngờ trực tiến vào hỗn hợp phản ứng\r\nPCR hoặc cho 2 µl nước canh khuẩn.
\r\n\r\nMẫu đối chứng dương: Chủng vi khuẩn E.\r\ncoli đã biết có mang gene F18 và VT2e.
\r\n\r\nMẫu có thể là DNA tách chiết từ khuẩn lạc hay\r\ncanh trùng nuôi cấy. Có thể tách chiết DNA bằng các kit thương mại hay bằng nhiệt.\r\nNếu sử dụng kit thì các bước tiến hành theo chỉ dẫn của nhà sản xuất.
\r\n\r\nTách chiết bằng phương pháp shock nhiệt: Lấy\r\ntừ 3 khuẩn lạc đến 4 khuẩn lạc hòa vào 100 l nước vô trùng không chứa\r\nmen Rnase và Dnase (nuclease free water). Đun sôi cách thủy trong 10 min, rồi\r\nlàm lạnh nhanh huyễn dịch trong đá 5 min. Ly tâm huyễn dịch 12000 r/min\r\ntrong 5 min. Thu hoạch nước trong để làm phản ứng PCR.
\r\n\r\nB.2 Tiến hành phản ứng PCR
\r\n\r\nCó thể dùng các kit PCR thương mại và sử dụng\r\nkết hợp với hướng dẫn của nhà sản xuất.
\r\n\r\nNếu sử dụng Taq DNA polymerase của hãng\r\nQIAGEN thì thành phần cho 1 phản ứng PCR với tổng thể tích là 50
Đối chứng dương: Vi khuẩn hay DNA tách chiết\r\ntừ vi khuẩn E. coli đã biết có mang gene F18 và VT2e.
\r\n\r\nĐối chứng âm: bao gồm đầy đủ thành phần của một\r\nphản ứng PCR, nhưng không có DNA tách chiết từ mẫu hay vi khuẩn.
\r\n\r\nB.3 Chạy điện di
\r\n\r\nSản phẩm PCR được chạy điện di trên thạch\r\nagarose1,5 % đến 2 % trong dung dịch đệm TAE hoặc TBE.
\r\n\r\nCho 2 ml dung dịch loading dye vào 8
Bản thạch được điện di trong môi trường dung\r\ndịch đệm TAE hoặc TBE (tùy thuộc vào loại đệm sử dụng khi pha thạch),\r\ntrong thời gian 30 min đến 40 min, ở 100 V, sau đó nhuộm bằng dung dịch\r\nethidi bromua 0,2 mg/100ml.
\r\n\r\nCó thể dùng các sản phẩm có sẵn chất nhuộm\r\nDNA để pha chế thạch agarose (ví dụ như SYBR safe DNA gel stain của hãng\r\nInvitrogen) và sử dụng theo quy định của nhà sản xuất.
\r\n\r\nB.4 Đọc kết quả
\r\n\r\nPhản ứng dương tính khi:
\r\n\r\n- Mẫu đối chứng dương có một vạch duy nhất\r\nđúng kích cỡ của sản phẩm.
\r\n\r\n- Mẫu đối chứng âm: không xuất hiện vạch.
\r\n\r\n- Mẫu kiểm tra có vạch giống mẫu đối chứng\r\ndương.
\r\n\r\n\r\n\r\n
File gốc của Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8400-16:2011 về bệnh động vật – quy trình chẩn đoán – phần 16: bệnh phù ở lợn do vi khuẩn E. Coli đang được cập nhật.
Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8400-16:2011 về bệnh động vật – quy trình chẩn đoán – phần 16: bệnh phù ở lợn do vi khuẩn E. Coli
Tóm tắt
| Cơ quan ban hành | Đã xác định |
| Số hiệu | TCVN8400-16:2011 |
| Loại văn bản | Tiêu chuẩn Việt Nam |
| Người ký | Đã xác định |
| Ngày ban hành | 2011-01-01 |
| Ngày hiệu lực | |
| Lĩnh vực | Nông nghiệp |
| Tình trạng | Còn hiệu lực |