CẢNH BÁO - Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể\r\nliên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu\r\nchuẩn này không thể đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến\r\nviệc sử dụng chúng. Các phòng thí nghiệm sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập\r\ncác nguyên tắc bảo đảm an toàn sinh học để không phải bị nhiễm bệnh nghề nghiệp\r\nhoặc thất thoát các mầm bệnh từ phòng thí nghiệm ra môi trường.
\r\n\r\n\r\n\r\nTiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh\r\nsảy thai truyền nhiễm đối với gia súc.
\r\n\r\n\r\n\r\nTrong tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ và định\r\nnghĩa sau:
\r\n\r\nBệnh sảy thai truyền nhiễm\r\ndo Brucela (Brucellosis)
\r\n\r\nBệnh truyền nhiễm chung do vi khuẩn thuộc giống Brucella gây\r\nra trên nhiều loài gia súc và lây sang người, gây sảy thai, chết lưu thai và bất\r\ndục.
\r\n\r\nCHÚ THÍCH: Các vi khuẩn thuộc giống Brucella là\r\ncầu trực khuẩn bắt màu Gram âm. Đường truyền lây của bệnh sảy thai truyền\r\nnhiễm do brucela chủ yếu qua thức ăn nước uống, qua đường giao phối, qua sữa và\r\ncác sản phẩm từ thịt, sữa… bị nhiễm mầm bệnh.
\r\n\r\nChỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân\r\ntích và sử dụng nước cất hoặc nước đã khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết\r\ntương đương không có Rnase, trừ có quy định khác.
\r\n\r\n- Dung dịch EDTA-PBS pH 7,2
\r\n\r\n- Dung dịch tím tinh thể
\r\n\r\n- Dung dịch Gam’s Iodine để nhuộm vi khuẩn
\r\n\r\n- Metanol
\r\n\r\n- Bộ kit ELISA
\r\n\r\n- Thuốc nhuộm
\r\n\r\n- Thạch TSA (trypticase soy agar hoặc\r\ntryptone soy agar) - Thạch máu (oxoid)
\r\n\r\n- Kháng nguyên Rose Bengal Brucella (được\r\nbảo quản ở 2 0C đến 8 0C)
\r\n\r\n- Huyết thanh đối chứng dương (được bảo\r\nquản ở 2 0C đến 8 0C)
\r\n\r\n- Huyết thanh đối chứng âm (được bảo quản\r\nở 2 0C đến 8 0C)
\r\n\r\n- Bổ thể
\r\n\r\n- Dung dịch muối đệm Veronal
\r\n\r\n- Kháng nguyên chuẩn và kháng nguyên pha\r\nloãng để sử dụng.
\r\n\r\n- Hệ thống dung huyết: trộn một lượng bằng\r\nnhau của hồng cầu cừu (SRBC) 3 % và 5MHD dung huyết tố (MHD: liều dung huyết tối\r\nthiểu của bổ thể).
\r\n\r\n- Kháng nguyên Brucella làm phản\r\nứng vòng sữa (được bảo quản ở 2 0C đến 8 0C) - Bộ KIT huyết\r\nthanh hoặc sữa.
\r\n\r\n\r\n\r\nSử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử\r\nnghiệm thông thường và cụ thể như sau:
\r\n\r\n- Kính hiển vi
\r\n\r\n- Lam kính
\r\n\r\n- Ống nghiệm thủy tinh
\r\n\r\n- Đèn cồn
\r\n\r\n- Đĩa lồng petri
\r\n\r\n- Que cấy
\r\n\r\n- Buồng cấy sinh học
\r\n\r\n- Pipet đơn kênh, thể tích hút từ\r\n10 l đến 1000 l, từ 1 l đến 10 l, từ 5 l đến\r\n50 l - Pipet đa kênh, thể tích hút từ 25l đến 200 l
\r\n\r\n- Máy lắc, tủ ấm, tủ lạnh
\r\n\r\n- Nồi cách thủy
\r\n\r\n- Đĩa nhựa 96 giếng
\r\n\r\n- Lam kính, que trộn mẫu, đồng hồ phòng\r\nthí nghiệm - Máy đọc ELISA.
\r\n\r\n\r\n\r\n\r\n\r\n5.1.1. Đặc điểm dịch tễ
\r\n\r\nBệnh sảy thai truyền nhiễm là bệnh lây sang\r\nngười, ở nhiều loài động vật khác và động vật hoang dã. Có ba chủng chính\r\ngây bệnh là:
\r\n\r\n- Brucella abortus (biovars 1 - 6) gây bệnh\r\nchủ yếu ở gia súc, loài bò, hươu nai. - Brucella suis (biovars 1 - 5)\r\ngây bệnh chủ yếu ở lợn.
\r\n\r\n- Brucella melitensis (biovars 1 - 3)\r\ngây bệnh chủ yếu ở dê, cừu.
\r\n\r\nTất cả các chủng trên đều không có vật chủ\r\ntrung gian mà chúng có thể lây bệnh qua các loài động vật khác khi có điều kiện\r\nthích hợp như qua tiêu hóa, giao cấu, con bú mẹ...
\r\n\r\nBệnh có hầu hết ở các nước trên thế giới trừ\r\nnhững nước đã thanh toán được bệnh này.
\r\n\r\n5.1.2 Triệu chứng lâm sàng
\r\n\r\n5.1.2.1 Bệnh sảy thai truyền nhiễm trên trâu\r\nbò (do Brucella abortus) Con cái: Sảy thai, đẻ non, sát nhau, bất dục.
\r\n\r\nCon đực: Viêm tinh hoàn và mào tinh hoàn, bao\r\ndịch hoàn sưng to, túi tinh sưng, sưng khớp gối.
\r\n\r\n5.1.2.2 Bệnh sảy thai truyền nhiễm trên dê\r\n(do Brucella melitensis) Con cái: Sảy thai ở giai đoạn cuối, chân đi\r\nkhập khiễng.
\r\nCon đực: Viêm tinh hoàn.
5.1.2.3 Bệnh sảy thai truyền nhiễm trên cừu\r\n(do Brucella ovis) Con cái: Sảy thai vào giai đoạn cuối, con sinh ra\r\nyếu hoặc chết.
\r\n\r\nCon đực: Bao dịch hoàn sưng to, gia súc sốt\r\ncao, ủ rũ, mào tinh hoàn sưng to và rắn, tinh hoàn teo nhỏ.
\r\n\r\n5.1.2.4 Bệnh sảy thai truyền nhiễm trên lợn\r\n(do Brucella suis) Con cái: Sảy thai, bất dục, tỷ lệ lợn con sinh ra\r\nbị chết cao.
\r\n\r\nCon đực: Viêm sưng hoặc hoại tử tinh hoàn,\r\nquè hoặc liệt chân sau, viêm tinh hoàn và mào tinh hoàn.
\r\n\r\n5.1.3 Bệnh tích đại thể
\r\n\r\nBệnh tích ở các loài đều gần giống nhau. Bệnh\r\ntích trên bào thai của những con thú sảy thai: vỏ bọc thai dày lên có nhiều\r\nđiểm xuất huyết. Trên núm nhau có nhiều điểm hoại tử. Nhau thai có những điểm hoại\r\ntử dạng hạt màu vàng trắng, bờ mặt đục. Núm nhau bị biến màu, sờ vào mềm nhũn\r\ncó mủ. Cuống rốn có mủ, điểm hoại tử lấm tấm.
\r\n\r\nCon đực: dịch thượng hoàn sưng to gấp 2 lần đến\r\n3 lần bình thường, lượng tinh giảm, màng ngoài đường sinh dục dày, có khi bị\r\nviêm khớp u mềm có mủ.
\r\n\r\nCơ quan phủ tạng: gan lách sưng hay hoại tử.
\r\n\r\n\r\n\r\n5.2.1. Lấy mẫu
\r\n\r\n5.2.1.1. Gia súc mới chết
\r\n\r\nBệnh phẩm có thể là nhau thai, thai bị sảy,\r\nnước ối, hạch vú, hạch vùng xoang chậu, tuyến sữa, tử cung, dịch tiết âm đạo,\r\ntinh hoàn, dịch khớp.
\r\n\r\n5.2.1.2 Gia súc sống
\r\n\r\nMáu: Lấy máu tĩnh mạch vào buổi sáng trước\r\nkhi cho gia súc ăn. Sữa: Lấy khoảng 10 ml sữa vào lọ vô trùng.
\r\n\r\nDịch bài xuất, bài tiết từ âm hộ: dùng tăm\r\nbông vô trùng để thấm dịch và cho vào lọ vô trùng.
\r\n\r\nTinh dịch: lấy khoảng 3 ml cho vào lọ vô\r\ntrùng.
\r\n\r\n5.2.2 Bảo quản và vận chuyển
\r\n\r\nMẫu bệnh phẩm gửi đi xét nghiệm phải được bảo\r\nquản trong thùng lạnh ở nhiệt độ 4 0C và vận chuyển ngay đến phòng thí\r\nnghiệm càng nhanh càng tốt. Tốt nhất là vận chuyển ngay trong ngày lấy mẫu.
\r\n\r\nGửi kèm theo cả biên bản mổ khám (nếu có).
\r\n\r\n5.3.1. Chẩn đoán huyết thanh học
\r\n\r\nLà phương pháp phổ biến nhất được áp dụng cho\r\nviệc đánh giá đàn gia súc được kiểm tra là có hay không bệnh sảy thai truyền\r\nnhiễm. Các phản ứng huyết thanh dùng để kiểm tra toàn đàn, kiểm tra định kỳ\r\nvà kiểm tra mẫu huyết thanh trong trường hợp có hiện tượng gia súc bị sảy thai.
\r\n\r\n5.3.1.1. Phản ứng ngưng kết hoa hồng (Phản ứng\r\nRBT - Rose Bengal Test)
\r\n\r\n5.3.1.1.1 Nguyên lý phản ứng
\r\n\r\nKháng thể có trong huyết thanh kết hợp với\r\nkháng nguyên Brucella đã được gắn màu để tạo thành phức hợp\r\nkháng nguyên kháng thể mà có thể quan sát thấy (phức hợp này là những hạt chấm\r\nmàu đỏ trong dung dịch trong suốt).
\r\n\r\n5.3.1.1.2 Tiến hành phản ứng
\r\n\r\n- Nguyên liệu phản ứng và mẫu huyết\r\nthanh để ở nhiệt độ phòng (22 0C ± 4 0C) khoảng 1 h trước\r\nkhi làm phản ứng.
\r\n\r\n- Lắc đều lọ kháng nguyên một cách nhẹ\r\nnhàng để kháng nguyên chắc chắn được đồng nhất.
\r\n\r\n- Nhỏ 30 µl mẫu huyết thanh lên trên phiến\r\nkính.
\r\n\r\n- Nhỏ 30 µl kháng nguyên lên huyết\r\nthanh.
\r\n\r\n- Trộn đều mẫu huyết thanh với kháng\r\nnguyên bằng que trộn.
\r\n\r\n- Lặp lại các bước trên với huyết thanh\r\nđối chứng âm, dương.
\r\n\r\n- Nhẹ nhàng lắc tròn phiến kính trong 2\r\nmin (có thể sử dụng máy lắc).
\r\n\r\nQuan sát sự ngưng kết sau 2 min kể từ lúc bắt\r\nđầu lắc là khoảng thời gian tốt nhất để đánh giá kết quả.
\r\n\r\n5.3.1.1.3 Đánh giá kết quả
\r\n\r\nPhản ứng âm tính: không có sự ngưng kết.
\r\n\r\nPhản ứng dương tính (có mặt kháng thể đặc hiệu):\r\ncó các hạt ngưng kết lấm tấm màu hồng.
\r\n\r\n5.3.1.2 Phản ứng vòng sữa (Milk Ring Test)
\r\n\r\n5.3.1.2.1 Nguyên lý phản ứng
\r\n\r\nKháng thể có trong sữa kết hợp với kháng\r\nnguyên Brucella đã được gắn màu để tạo thành phức hợp kháng\r\nnguyên kháng thể. Khi phức hợp này được tạo thành nó kéo theo lớp chất béo có\r\ntrong sữa nổi lên trên và tạo thành vòng xanh tím.
\r\n\r\n5.3.1.2.2 Tiến hành phản ứng
\r\n\r\nCho 10 ml mẫu sữa vào ống nghiệm.
\r\n\r\nThêm 50 µl kháng nguyên Brucella đã\r\ngắn màu và trộn đều một cách cẩn thận.
\r\n\r\nĐặt vào tủ ấm 37 0C trong 1 h hoặc tủ lạnh\r\n4 0C từ 18 h đến 20 h, sau đó đọc kết quả.
\r\n\r\n5.3.1.2.3 Đánh giá kết quả
\r\n\r\n- Dương tính: lớp kem phía trên có màu\r\nxanh tím bằng hoặc đậm hơn màu của lớp sữa phía dưới.
\r\n\r\n- Âm tính: lớp kem phía trên có màu xanh\r\ntím nhạt hơn màu của lớp sữa phía dưới.
\r\n\r\nCHÚ Ý: Hai phản ứng trên đây chỉ là phản ứng\r\nsàng lọc để phát hiện sự có mặt hay không của kháng thể. Nếu phản ứng cho\r\nkết quả dương tính thì phải tiến hành kiểm tra lại bằng các phản ứng huyết\r\nthanh học khác.
\r\n\r\n5.3.1.3 Phản ứng ngưng kết trong ống nghiệm\r\n(phản ứng EDTA-TAT - EDTA-Tube agglutination test)
\r\n\r\n5.3.1.3.1 Nguyên lý phản ứng
\r\n\r\nKháng thể có trong huyết thanh kết hợp với\r\nkháng nguyên Brucella để tạo thành phức hợp kháng nguyên kháng thể mà\r\ncó thể quan sát thấy.
\r\n\r\n5.3.1.3.2 Tiến hành phản ứng
\r\n\r\nPha loãng kháng nguyên với tỷ lệ 1:100 bằng\r\nEDTA-PBS
\r\n\r\nChuẩn bị 5 ống nghiệm thủy tinh vô trùng đánh\r\ndấu thứ tự từ 1 đến 5, lấy kháng nguyên đã pha loãng vào các ống theo thứ tự từ\r\n1 đến 5 như sau: 2,0; 1,0; 1,0; 1,0 và 1,0 ml.
\r\n\r\nCho 0,08 ml huyết thanh cần kiểm tra vào ống\r\n1.
\r\n\r\nTrộn đều và pha loãng bằng cách chuyển 1 ml\r\nhuyễn dịch ống 1 sang ống 2, trộn đều và chuyển 1 ml của ống 2 sang ống 3, tiếp\r\ntục đến ống thứ 5 và bỏ 1 ml cuối cùng. Như vậy các ống có độ pha loãng của\r\nhuyết thanh theo thứ tự là: 1:25, 1:50, 1:100, 1:200, 1:400.
\r\n\r\nỦ ở 37 0C, thời gian 48 h.
\r\n\r\nCác bước tiến hành được tóm tắt ở bảng dưới\r\nđây:
\r\n\r\n5.3.1.4 Kỹ thuật chẩn đoán bằng phương pháp\r\nELISA (phản ứng miễn dịch đánh dấu enzym- Enzyme-Linked Immunosorbent Assays)
\r\n\r\n5.3.1.4.1 Nguyên lý phản ứng
\r\n\r\nDùng kháng thể hoặc kháng kháng thể gắn enzym\r\nrồi cho kết hợp trực tiếp hay gián tiếp với kháng nguyên. Sau đó cho cơ chất\r\n(chất nền) vào, cơ chất sẽ kết hợp với enzym đã gắn tạo nên màu.
\r\n\r\n5.3.1.4.2 Tiến hành phản ứng
\r\n\r\nTheo hướng dẫn của nhà sản xuất KIT.
\r\n\r\n5.3.1.4.3 Đánh giá kết quả
\r\n\r\nTheo hướng dẫn của nhà sản xuất KIT.
\r\n\r\n5.3.1.5 Phản ứng kết hợp bổ thể CFT (Kolmer\r\nCFT)
\r\n\r\n5.3.1.5.1 Nguyên lý phản ứng
\r\n\r\nKháng thể trong huyết thanh kết hợp với kháng\r\nnguyên và bổ thể sẽ không dung giải tế bào hồng cầu cừu vì vậy hiện tượng\r\ndung huyết không xảy. Nếu huyết thanh không có kháng thể, bổ thể sẽ gây\r\ndung giải hồng cầu và hiện tượng dung huyết tố sẽ xảy.
\r\n\r\n5.3.1.5.2 Tiến hành phản ứng
\r\n\r\nHuyết thanh vô hoạt ở 58 0C/50 min\r\n(trong bồn nước ấm), sau đó pha loãng với dung dịch VB ở hiệu giá 1:4.
\r\n\r\nMỗi mẫu huyết thanh cần 7 ống nghiệm: 6 ống để\r\npha loãng, 1 ống đối chứng huyết thanh kháng bổ thể. Cho 0,25 ml dung dịch VB\r\nvào tất cả các ống trừ ống số 1.
\r\n\r\nCho 0,25 ml mẫu huyết thanh 1:4 vào ống 1, ống\r\n2 và ống 7.
\r\n\r\nPha loãng mẫu huyết thanh từ ống 2 đến ống 6\r\nbằng cách trộn đều dung dịch trong ống 2 sau đó hút 0,25 ml chuyển sang ống\r\n3, trộn đều và hút 0,25 ml chuyển tiếp... cho tới ống 6 thì hút bỏ 0,25 ml.\r\nNhư vậy từ ống 1 cho tới ống 6 chứa 0,25 ml mẫu huyết thanh với độ pha\r\nloãng lần lượt là: 1/4, 1/8,… 1/128, ống số 7 sẽ là ống đối chứng huyết thanh\r\nkháng bổ thể.
\r\n\r\nCho 0,25 ml kháng nguyên chuẩn vào các ống từ\r\n1 đến 6 và 0,25 ml dung dịch VB vào ống 7. Cho 0,25 ml bổ thể 1,25 MHD vào\r\ntất cả các ống.
\r\n\r\nĐem ủ qua đêm (từ 18 h đến 20 h) ở 4 0C\r\nhoặc ủ ấm ở 37 0C trong 30 min. Nếu ủ qua đêm thì trước khi đem làm tiếp\r\nphải cho vào nồi cách thủy ở 37 0C trong khoảng 10 min.
\r\n\r\nLấy 3 ống nghiệm khác làm ống đối chứng bổ thể.
\r\n\r\nỐng 1 cho 0,25 ml bổ thể 1,25 MHD, ống 2 là\r\n0,25 ml bổ thể 1,25 MHD với 0,25 ml dung dịch VB (pha loãng 2 lần), ống 3\r\nchứa 0,25 ml bổ thể 1,25 MHD + 0,75 ml dung dịch VB (pha loãng 4 lần). Như vậy ống\r\n1 chứa 2 đơn vị bổ thể, ống 2 chứa 1 đơn vị bổ thể, ống 3 chứa 0,5 đơn vị bổ thể.
\r\n\r\nCho 0,5 ml dung dịch VB vào cả 3 ống.
\r\n\r\nĐể tất cả 10 ống trên vào nồi cách thủy 370C\r\ntrong 30 min hoặc 40C trong 14 h đến 18 h (phương pháp cố định lạnh). Khi lấy\r\nra khỏi tủ lạnh phải để ở nhiệt độ phòng 10 min.
\r\n\r\nCHÚ Ý: Phải có một mẫu đối chứng dương\r\n(dùng huyết thanh dương tính chuẩn có độ dương tính thấp) được tiến hành song\r\nsong với mẫu kiểm tra và cách làm tương tự như với mẫu huyết thanh.
\r\n\r\nChuẩn bị “hệ thống dung huyết” bằng cách trộn\r\n1 phần hồng cầu cừu 3 % với 1 phần dung huyết tố 5 MHD. Lắc nhẹ để trộn đều, để\r\nở nhiệt độ phòng trong 15 min và thỉnh thoảng lại lắc nhẹ lên.
\r\n\r\nKhi thời gian ủ đã hết thì cho 0,25 ml “hệ thống\r\ndung huyết” vào mỗi ống, trộn đều và ủ ấm ở 37 0C từ 30 min đến 1 h.\r\nCứ 10 min lắc 1 lần.
\r\n\r\nKhi hết thời gian phản ứng tiến hành đọc kết\r\nquả. Tiến hành trên đĩa 96 lỗ đáy chữ U:
\r\n\r\nCho 25 µl dung dịch VB vào các giếng (từ B đến\r\nH). Cho 25 µl mẫu huyết thanh 1:4 vào giếng A, B và G.
\r\n\r\nPha loãng mẫu từ giếng B đến F sau đó thì bỏ\r\nđi 25 µl. Pha loãng mẫu huyết thanh trong giếng G sang H rồi bỏ đi 25 µl (2 giếng\r\nG, H để làm đối chứng huyết thanh kháng bổ thể).
\r\n\r\nThêm 25 µl kháng nguyên 1:30 vào các giếng từ\r\nA đến F, 25 µl dung dịch VB vào các giếng G, H. Lặc đĩa một cách nhẹ nhàng\r\nvà giữ ở nhiệt độ phòng.
\r\n\r\nThêm 25 µl bổ thể 1,25 MHD vào tất cả các giếng\r\ntừ A đến H.
\r\n\r\nLắc nhẹ đĩa và ủ qua đêm (từ 18 h đến 20 h) ở\r\n4 0C hoặc ủ ấm ở 37 0C trong 1 h.
\r\n\r\nChuẩn bị “hệ thống dung huyết” bằng cách trộn\r\n1 phần hồng cầu cừu 3 % với 1 phần dung huyết tố 5 MHD. Lắc nhẹ để trộn đều, để\r\nở nhiệt độ phòng trong 15 min và thỉnh thoảng lại lặc nhẹ lên.
\r\n\r\nKhi thời gian ủ đã hết thì cho 25 µl “hệ thống\r\ndung huyết” vào tất cả các giếng từ A đến H, trộn đều và ủ ấm trong ở\r\n370 C từ 30 min đến 1 h. Cứ 10 min lắc một lần.
\r\n\r\nKhi hết thời gian phản ứng thì tiến hành đọc\r\nkết quả.
\r\n\r\n5.3.1.5.3 Đánh giá kết quả
\r\n\r\nKhông có dung huyết (ngưng kết) phản ứng được\r\nđánh dấu ++++, dung huyết ít hơn (ngưng kết ít hơn) +++ …, dung huyết hoàn toàn\r\n(không ngưng kết) đánh dấu (-). Phản ứng được đọc ở độ pha loãng cao nhất mà tại\r\nđó phản ứng vẫn xảy ra.
\r\n\r\nỐng đối chứng huyết thanh kháng bổ thể phải\r\ndung huyết hoàn toàn.
\r\n\r\nCác ống đối chứng bổ thể sẽ dung huyết hoàn\r\ntoàn ở ống 1 và ống 2 hoặc ++ hoặc +++ ở ống 3. Độ nhạy của phản ứng phải\r\nđược kiểm tra bằng cách kiểm tra phản ứng của ống kháng huyết thanh chuẩn.
\r\n\r\n0: không kết hợp (không ngưng kết) (100 %\r\ndung huyết)
\r\n\r\n+ : 25 % kết hợp (75 % dung huyết)
\r\n\r\n++ : 50 % kết hợp (50 % dung huyết)
\r\n\r\n+++ : 75 % kết hợp (25 % dung huyết).
\r\n\r\n++++ : 100 % kết hợp (không dung huyết).
\r\n\r\nĐối với phương pháp cố định ở\r\n37 0C:
\r\n\r\n- Hiệu giá 1:4: dương tính hoặc nghi ngờ.
\r\n\r\n- Hiệu giá 1:8 hoặc lớn hơn: dương tính.\r\nPhương pháp cố định lạnh:
\r\n\r\n- Hiệu giá 1:8: nghi ngờ.
\r\n\r\n- Hiệu giá 1:16 hoặc lớn hơn: dương\r\ntính.
\r\n\r\n5.3.1.5 Kết luận
\r\n\r\nKiểm tra toàn đàn gia súc và kiểm tra định kỳ\r\ndùng phương pháp Rose Bengal, phương pháp ngưng kết trong ống nghiệm, phương\r\npháp ELISA, phương pháp vòng sữa.
\r\n\r\nĐể kết luận có bệnh sảy thai truyền nhiễm\r\ntrong đàn dùng phương pháp CFT và có thể phân lập (tùy điều kiện của từng phòng\r\nthí nghiệm).
\r\n\r\nĐàn đó tiêm phòng phải dùng phương pháp ELISA\r\nkết hợp với phương pháp CFT.
\r\n\r\n5.3.2 Phát hiện kháng nguyên
\r\n\r\n5.3.2.1 Kiểm tra bằng kính hiển vi
\r\n\r\n5.3.2.1.1 Phết và cố định tiêu bản
\r\n\r\nBệnh phẩm lấy từ tổ chức (thai bị sảy, nhau\r\nthai, lách, hạch vú, hạch vùng xoang chậu): cắt một miếng nhỏ, phiết lên\r\nphiến kính sạch, để khô.
\r\n\r\nBệnh phẩm lấy từ các dịch tiết (nước ối, dịch\r\nnhờn âm hộ, sữa, máu, tinh dịch): lấy một giọt nhỏ lên phiến kính sạch sau đó\r\ndàn mỏng đều bằng phiến khác, để khô.
\r\n\r\nCố định tiêu bản: dùng cồn Methanol nhỏ ngập\r\ntiêu bản, để khô rồi đem nhuộm.
\r\n\r\n5.3.2.1.2 Nhuộm tiêu bản
\r\n\r\nCó thể nhuộm theo phương pháp Gram hoặc\r\nphương pháp Ziehl - Neelsen (xem Phụ lục B)
\r\n\r\n5.3.2.1.3 Quan sát hình thái vi khuẩn
\r\n\r\nTiêu bản sau khi nhuộm để khô, xem trên kính\r\nhiển vi với độ phóng đại 100. Nếu bệnh phẩm có Brucella sẽ thấy:
\r\n\r\nVi khuẩn bắt màu hồng (màu của vi khuẩn Gram\r\nâm) khi nhuộm bằng phương pháp nhuộm Gram. Vi khuẩn sẽ bắt màu đỏ trên nền xanh\r\nda trời nhuộm bằng phương pháp Ziehl - Neelsen.
\r\n\r\nLà cầu trực khuẩn nhỏ hoặc đa hình thái (hình\r\ntrứng, hình gậy,…). Chúng thường nằm dải rác thành những tế bào đơn như những hạt\r\ncát mịn đôi khi tập trung thành từng cắp hoặc chuỗi nhỏ.
\r\n\r\nKích thước của Brucella vào khoảng\r\n(từ 0,5 µm đến 0,7 µm) x (từ 0,6 µm đến 1,5 µm), không hình thành nha bào và\r\ngiáp mô.
\r\n\r\n5.3.2.2 Phân lập vi khuẩn
\r\n\r\n5.3.2.2.1 Yêu cầu chung
\r\n\r\nPhương pháp này ít áp dụng do thời gian quá\r\ndài (từ 10 ngày đến 2 tháng) nhưng khi bắt buộc phân lập cần phải chú ý đến các\r\nbiện pháp an toàn sinh học vì đây là bệnh lây sang người.
\r\n\r\n5.3.2.2.2 Chuẩn bị mẫu và môi trường
\r\n\r\nSữa: cho vào ống kín đem ly tâm ở\r\n2000 g trong 15 min. Hớt bỏ váng sữa vào dung dịch sát trùng (tránh bị\r\nxáo trộn lớp kem). Lớp kem còn lại và lớp chất lắng dưới đáy được trộn lẫn với\r\nnhau.
\r\n\r\nMáu: dùng để cấy vào môi trường lỏng là chủ yếu.\r\nLấy khoảng 10 ml máu vào xi lanh hoặc ống đựng mẫu chân không.
\r\n\r\nMôi trường cơ bản: Có thể sử dụng các môi trường\r\nsau đây để phân lập Brucella: thạch TSA, thạch máu, thạchColumbia.
\r\n\r\nCHÚ THÍCH 1: Việc phân lập và nuôi cấy vi khuẩn Brucella được\r\nthực hiện chủ yếu trên môi trường thạch. Đây là dạng môi trường tốt nhất để vi\r\nkhuẩn phát triển một cách thuần khiết và hạn chế khả năng tạp nhiễm vi khuẩn\r\nkhác. Tuy nhiên cũng có thể sử dụng các môi trường lỏng để phân lập vi khuẩn với\r\nnhững mẫu là tổ chức hoặc cho mục đích làm giàu vi khuẩn.
\r\n\r\nNhững loại môi trường trên thường được bổ\r\nsung từ 2 % đến 5 % huyết thanh trâu, bò hoặc ngựa.
\r\n\r\nCác môi trường chuyên biệt khác như thạch huyết\r\nthanh-dextroza (SDA - serum-dextrose agar) để quan sát hình thái học vi khuẩn\r\nhoặc thạch glycerol dextroza (glycerol dextrose agar).
\r\n\r\n5.3.2.2.3 Tiến hành
\r\n\r\nCấy bệnh phẩm vào môi trường và ủ ấm ở\r\n37 0C trong tủ ấm CO2 với 5 % đến 10 % khí trong thời gian từ 1\r\ntuần đến 2 tháng. Nếu có vi khuẩn, trên mặt thạch sẽ hình thành những khuẩn lạc\r\ntròn cong lồi, trong suốt, mặt nhẵn, rìa gọn, nhuộm bắt màu Gram âm và vi\r\nkhuẩn có dạng cầu trực khuẩn hoặc hình gậy ngắn.
\r\n\r\n5.3.2.2.4 Đọc kết quả
\r\n\r\nCác đặc trưng của các loài Brucella:
\r\n\r\n| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n B. abortus \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n B. suis \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n B. melitensis \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n B. ovis \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n B. canis \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n B. neotomae \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n CHÚ THÍCH: S: khuẩn lạc nhẵn, R: khuẩn\r\n lạc nhám. \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
5.3.2.3 Giám định sinh hoá và định typ huyết\r\nthanh - Phản ứng oxidase (xem Phụ lục C).
\r\n\r\n- Phản ứng urease dương tính (xem Phụ lục\r\nC).
\r\n\r\n- Nếu phân lập được vi khuẩn, đem thử lại\r\nbằng phản ứng ngưng kết với kháng huyết thanh đặc hiệu của từng chủng\r\nriêng biệt và làm các phản ứng sinh hóa.
\r\n\r\n\r\n\r\n
A.1 Dung dịch EDTA-PBS pH 7,2
\r\n\r\nNatri clorua\r\n(NaCl) 8,0\r\ng
\r\n\r\nKali clorua (KCl) 0,20\r\ng
\r\n\r\nDinatri hydrophosphat\r\n(Na2HPO4) 1,15\r\ng
\r\n\r\nKali dihydrophosphat\r\n(KH2PO4) 0,20\r\ng
\r\n\r\nEDTA 3,72\r\ng
\r\n\r\nNước 1 000 ml
\r\n\r\n\r\n\r\n
B.1 Phương pháp nhuộm Ziehl-Neelsen
\r\n\r\nBước 1: Hơ tiêu bản đã được cố định bằng lửa
\r\n\r\nBước 2: Nhỏ ngập tiêu bản bằng Carbol Fuchsin.\r\nHãy đảm bảo thuốc nhuộm luôn được phủ kín trong suốt quá trình nhuộm.
\r\n\r\nBước 3: Sử dụng đèn Bun-sen (đèn khí đốt hình\r\nống như dùng trong phòng thí nghiệm), làm nóng tiêu bản một cách từ từ cho\r\ntới khi nóng và duy trì trong 5 min bằng cách sử dụng nhiệt độ thấp hoặc\r\nlàm nóng gián đoạn.
\r\n\r\nCHÚ Ý: Nếu hơ lửa quá nóng có thể làm vỡ\r\nphiến kính. Bước 4: Rửa tiêu bản bằng nước.
\r\n\r\nBước 5: Nhỏ ngập tiêu bản với axit-alcohol 3\r\n% trong 5 min (tẩy màu). Trong 5 min đó, có thể nhỏ thêm axit-alcohol 3 %\r\ncho tới khi tiêu bản được tẩy sạch.
\r\n\r\nBước 6: Rửa sạch tiêu bản với nước và sau đó\r\nlàm khô tiêu bản.
\r\n\r\nBước 7: Nhỏ ngập tiêu bản bằng phẩm màu xanh\r\nmetylen và giữ trong khoảng 1 min.
\r\n\r\nBước 8: Rửa sạch tiêu bản bằng nước. Toàn bộ\r\ncác bước được thực hiện đúng và chính xác, kiểm tra dưới kính hiển vi với vật\r\nkính dầu thấy vi khuẩn bắt màu đỏ trên nền xanh da trời.
\r\n\r\nB.2 Phương pháp nhuộm Gram
\r\n\r\nBước 1: Nhỏ ngập tiêu bản đã cố định bằng\r\ndung dịch tím tinh thể trong 1 min. Rửa sạch tiêu bản nhanh dưới vòi nước\r\n(không quá 5 s). Lau khô.
\r\n\r\nBước 2: Nhỏ ngập tiêu bản bằng dung dịch\r\nGam's Iodine (dung dịch iôt 2 % và kali iôt 3 % trong cồn 70 %) trong khoảng\r\n1 min. Rửa sạch tiêu bản dưới vòi nước. Lau khô.
\r\n\r\nBước 3: Nhỏ ngập tiêu bản với cồn 95 % trong\r\n10 s (có thể lâu hơn nếu tiêu bản bắt màu quá đậm) và rửa sạch bằng vòi nước.\r\nLau khô tiêu bản.
\r\n\r\nBước 4: Nhỏ ngập tiêu bản bằng dung dịch hữu\r\ncơ màu đỏ trong 30 s. Rửa sạch dưới vòi nước. Lau khô tiêu bản bằng giấy\r\nthấm nước nhưng không làm bay mất lớp cố định.
\r\n\r\nBước 5: Kiểm tra tiêu bản dưới kính hiển vi với\r\nvật kính dầu.
\r\n\r\n\r\n\r\n
C.1 Phân giải urê
\r\n\r\nCó thể sử dụng môi trường urê cơ bản (urea\r\nagar base - Christensen) (chuẩn bị môi trường và bổ sung urê theo chỉ dẫn của\r\nnhà sản xuất).
\r\n\r\nCấy vi khuẩn vào môi trường có urê, nuôi cấy ở\r\n37 0C, sau 24 h đọc kết quả. - Phản ứng âm tính: môi trường\r\nkhông thay đổi màu.
\r\n\r\n- Phản ứng dương tính: môi trường chuyển\r\nmàu tím.
\r\n\r\nC.2 Phản ứng oxidaza
\r\n\r\nPhản ứng được tiến hành trên giấy có tẩm dung\r\ndịch 1 % tetra methyl p-phenyl diamin HCl. Dùng que cấy lấy khuẩn lạc từ\r\nmôi trường thạch chà sát lên trên mặt giấy. Phản ứng dương tính khi xuất hiện\r\nmàu đen tím sau 30 s. Phản ứng âm tính khi giấy tẩm giữ nguyên màu.
\r\n\r\n\r\n\r\n
D.1 Chuẩn độ kháng nguyên Brucella
\r\n\r\nCho 50 m
Pha loãng từ cột 1 đến cột 12 bằng cách trộn\r\nđều và hút 50 ml ở cột 1 cho vào cột 2, tiếp tục trộn đều và\r\nhút từ cột 2 sang cột 3…. hút bỏ 50 l ở cột 12.
\r\n\r\nDùng 8 ống nghiệm pha loãng kháng nguyên cần\r\nkiểm tra bắt đầu từ hiệu giá 1/ 2,5 fi 1/ 5
Cho 50 m
Đọc kết quả: Nếu ở độ huyết thanh pha\r\nloãng nhất vẫn ngưng kết với các nồng độ kháng nguyên khác nhau thì bất cứ\r\nnồng độ kháng nguyên nào trong khoảng đó đều có thể chọn làm nồng độ chuẩn\r\ncho phản ứng. Thông thường chọn độ pha loãng hơi đậm hơn so với độ pha\r\nloãng cao nhất của kháng nguyên làm dung dịch kháng nguyên chuẩn cho chẩn đoán.
\r\n\r\nVÍ DỤ: Ở độ pha loãng huyết thanh 1/1280, tất\r\ncả các nồng độ pha loãng kháng nguyên từ 1/5
D.2 Chuẩn độ dung huyết tố
\r\n\r\nPha loãng dung huyết tố ở nồng độ 1/10 ( (0,1\r\ndung huyết tố + 0,9 ml VBS). Từ nồng độ 1/10, pha một dãy các nồng độ khác\r\nnhau như sau:
\r\n\r\n| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n 1 \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n 0,2 của nồng độ 1/10 \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n 2 \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n 0,2 của nồng độ 1/100 \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n 3 \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n 0,4 của nồng độ 1/100 \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n 4 \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n 0,2 của nồng độ 1/100 \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n 5 \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n 0,2 của nồng độ 1/100 \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n 6 \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n 0,2 của nồng độ 1/500 \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n 7 \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n 0,2 của nồng độ 1/500 \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n 8 \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n 0,2 của nồng độ 1/500 \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n 9 \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n 0,2 của nồng độ 1/1000 \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n 10 \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n 0,2 của nồng độ 1/1000 \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n 11 \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n 0,2 của nồng độ 1/1000 \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n 12 \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n 0,2 của nồng độ 1/1000 \r\n | \r\n \r\n | \r\n
Chuyển 30 m
Trộn đều và đặt vào nồi chưng cách thuỷ đun\r\nnóng tới 37 0C trong 1 h cùng máy lắc. Cho vào đĩa 96:\r\n25 ml\r\nbổ thể 1/10 và 50 ml VBS.
\r\n\r\nTrộn đều và thêm 50
Đánh giá kết quả chuẩn độ dung huyết tố.
\r\n\r\nVÍ DỤ: Từ lỗ 1 đến lỗ 9 có nhiều dung huyết tố\r\nlàm tan hết hồng cầu cừu. Từ lỗ 10 đến lỗ 12 ít dung huyết tố do đó không\r\ntan hết hồng cầu cừu. Do vậy, lấy lỗ thứ 8 vì tại lỗ thứ 8 hồng cầu cừu\r\ntan hết. Lỗ thứ 8 tương ứng với độ pha loãng 1/2500 = MHD (Minimum Haemolytic\r\nDose - liều tối thiểu gây dung huyết), làm phản ứng cần 5 MHD, do đó:
\r\n\r\n1/2500 x 5 = 1/500 (lấy haemolysin ở nồng độ\r\npha loãng 1/500 để làm phản ứng).
\r\n\r\nD.3 Chuẩn độ bổ thể
\r\n\r\nBổ thể pha loãng ở nồng độ 1/10 (0,5 ml bổ thể\r\n+ 4,5 ml dung dịch muối đệm Veronal). Từ nồng độ pha loãng 1/10 tiến hành\r\npha loãng một dãy bổ thể như sau:
\r\n\r\n| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n 1 \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n 2 \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n 3 \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n 4 \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n 5 \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n 6 \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n 7 \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n 8 \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n 9 \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n 10 \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n 11 \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
Lấy 25
Thêm 25 m
Trộn đều và đặt vào tủ ấm 37 0C\r\ntrong 30 min.
\r\n\r\nThêm 25 m
Để ở nhiệt độ phòng một số thời gian (hoặc đặt\r\ntrong tủ lạnh một đêm) trước khi đọc kết quả. Đánh giá kết quả chuẩn độ bổ\r\nthể:
\r\n\r\nÂm tính: 100 % dung huyết (không có sự kết hợp).\r\n
\r\n\r\n+: 75 % dung huyết, 25 % có sự kết hợp.
\r\n\r\n+: 50 % dung huyết, 50 % có sự kết hợp.
\r\n\r\n+++: 25 % dung huyết, 75 % có sự kết hợp.
\r\n\r\n++++: không có hiện tượng dung huyết.
\r\n\r\nKết quả chuẩn độ bổ thể:
\r\n\r\n| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Độ pha loãng \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Kết quả \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
Từ bảng trên: 1 MHD = 1/60 pha loãng bổ thể.
\r\n\r\nSử dụng trong phản ứng dùng:
\r\n\r\n(1 + 1/4) MHD = 5/4 x 1/60 = 1/48 pha loãng bổ\r\nthể.
\r\n\r\nFile gốc của Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8400-13:2011 về bệnh động vật – quy trình chẩn đoán – phần 13: bệnh sảy thai truyền nhiễm do Brucela đang được cập nhật.
Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8400-13:2011 về bệnh động vật – quy trình chẩn đoán – phần 13: bệnh sảy thai truyền nhiễm do Brucela
Tóm tắt
| Cơ quan ban hành | Đã xác định |
| Số hiệu | TCVN8400-13:2011 |
| Loại văn bản | Tiêu chuẩn Việt Nam |
| Người ký | Đã xác định |
| Ngày ban hành | 2011-01-01 |
| Ngày hiệu lực | |
| Lĩnh vực | Nông nghiệp |
| Tình trạng | Hết hiệu lực |