CẢNH BÁO - Việc áp dụng tiêu chuẩn này\r\ncó thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm.\r\nTiêu chuẩn này không thể đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn\r\nliên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết\r\nlập các thao tác an toàn thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn\r\nquy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn.
\r\n\r\n\r\n\r\nTiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh\r\nlao bò do vi khuẩn Mycobacterium bovis gây ra.
\r\n\r\n\r\n\r\nTrong tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ và định\r\nnghĩa sau:
\r\n\r\nBệnh lao bò (Bovine tuberculosis\r\ndisease)
\r\n\r\nBệnh mạn tính do trực khuẩn Mycobacterium\r\nbovis gây ra. Đặc trưng của bệnh là hình thành các hạt lao, thường thấy\r\nở hạch phổi, hạch bạch huyết và các cơ quan nội tạng. Bệnh lao bò có thể lây\r\nnhiễm sang người.
\r\n\r\nTrong tiêu chuẩn này chỉ sử dụng các thuốc thử\r\ntinh khiết phân tích và sử dụng nước cất hoặc nước có chất lượng tương đương,\r\ntrừ khi có quy định khác.
\r\n\r\n- Etanol (C2H6O).
\r\n\r\n- Fuchsin basic (C20H20ClN3).
\r\n\r\n- Xanh metylen (C16H18N3SCl).
\r\n\r\n- Axit clohydric (HCl).
\r\n\r\n- Kali hydroxit (KOH).
\r\n\r\n- Thiophen-2-carbonic axit hydrazide (TCH).
\r\n\r\n- Natri pyruvat (C3H3NaO3)
\r\n\r\n- Axit oxalic (C2H2O4)
\r\n\r\n- Amoni sắt (II) sulfat ((NH4)2Fe(SO4)2)
\r\n\r\n- Pyrazinamid (C5H5N3O)
\r\n\r\n- Các môi trường nuôi cấy phân lập:\r\nLowenstein Jensen (LJ), Stonebrink, Coletsos base, Herrold egg yolk (HEY),\r\nMiddlebrook 7H10 hay 7H11.
\r\n\r\n- Tuberculin PPD bò.
\r\n\r\n- Tuberculin PPD gà.
\r\n\r\n\r\n\r\nSử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử\r\nnghiệm thông thường và cụ thể như sau: Tủ ấm, có thể duy trì nhiệt độ\r\n37oC
\r\n\r\n- Tủ sấy
\r\n\r\n- Nồi hấp
\r\n\r\n- Buồng cấy
\r\n\r\n- Kính hiển vi quang học
\r\n\r\n- Tủ lạnh
\r\n\r\n- Que cấy
\r\n\r\n- Đèn cồn
\r\n\r\n- Đĩa Petri để đổ môi trường
\r\n\r\n- Panh
\r\n\r\n- Kéo
\r\n\r\n- Lamen (coverlip)
\r\n\r\n- Phiến kính
\r\n\r\n- Pipet thủy tinh các cỡ
\r\n\r\n- Lọ thủy tinh, dung tích 100 ml, 200 ml, 500\r\nml và 1000 ml.
\r\n\r\n\r\n\r\n5.1. Chẩn đoán lâm sàng
\r\n\r\n5.1.1 Đặc điểm dịch tễ
\r\n\r\n- Trâu, bò có thể bị nhiễm lao do tiếp xúc với\r\ntrâu, bò bị bệnh hay từ vùng đã có dịch. Bệnh lao có ở khắp nơi trên thế\r\ngiới.
\r\n\r\n- Động vật non cảm thụ với vi khuẩn lao mạnh\r\nhơn động vật trưởng thành.
\r\n\r\n5.1.2 Triệu chứng lâm sàng
\r\n\r\n- Con vật bị bệnh gầy, yếu, lông dựng đứng,\r\nda khô, sốt nhẹ về chiều.
\r\n\r\n- Các triệu chứng của bệnh phụ thuộc vào vị\r\ntrí phân bố của các hạt lao.
\r\n\r\nNếu các hạt lao khu trú ở phổi: Con vật ho\r\nkhan, ho từng cơn và ho nhiều hơn khi thời tiết thay đổi.
\r\n\r\nNếu các hạt lao khu trú ở hạch: Các hạch bạch\r\nhuyết sưng, cứng, sờ thấy lổn nhổn, nhất là các hạch ở trước vai, trước\r\nđùi, dưới hàm.
\r\n\r\nNếu các hạt lao khu trú ở ruột: Con vật ỉa chảy,\r\nphân tanh khẳm hoặc ỉa chảy và táo bón luân phiên.
\r\n\r\n- Con vật gầy dần và có thể chết do suy nhược\r\nở giai đoạn cuối của bệnh.
\r\n\r\n5.1.3. Bệnh tích
\r\n\r\nBệnh tích đặc trưng là con vật có các hạt\r\nlao. Các hạt lao có thể ở trong các cơ quan nội tạng, màng treo ruột, ruột,\r\nmàng phổi, màng bụng, vú,… nhưng hay gặp nhất là ở hạch phổi, hạch vùng đầu và\r\ncác hạch bạch huyết ở xoang ngực.
\r\n\r\nCác hạt lao thường có màu vàng, hoặc màu trắng\r\nđục, dạng bã đậu hoặc dạng hạt xơ hay bị canxi hoá thành những khối tăng\r\nsinh thượng bì có kích thước như quả ổi. Trên cùng một cơ quan có thể thấy nhiều\r\ndạng hạt lao khác nhau.
\r\n\r\nNếu hạt lao có nhiều trong phổi thì khi nắn\r\ncác thuỳ phổi có cảm giác như phổi có trộn cát, cắt có tiếng kêu lạo xạo.
\r\n\r\nỞ giai đoạn đầu, bệnh lao có thể rất khó chẩn\r\nđoán qua mổ khám.
\r\n\r\n5.1.4 Phản ứng tiêm nội bì (tuberculin\r\ntest)
\r\n\r\nPhản ứng này dùng để chẩn đoán bệnh lao cho động\r\nvật sống.
\r\n\r\n5.1.4.1 Vật liệu
\r\n\r\n- Tuberculin PPD bò.
\r\n\r\n- Tuberculin PPD gà.
\r\n\r\n5.1.4.2 Vị trí tiêm
\r\n\r\nNếu chỉ tiêm 1 mũi tuberculin PPD cho bò thì\r\nchọn một vị trí da cổ hoặc ở giữa mặt trong của nếp gấp da đuôi.
\r\n\r\nNếu tiêm cả 2 mũi tuberculin PPD cho bò và\r\ntuberculin PPD cho gà thì chọn 2 vị trí khác nhau ở cùng một bên cổ của con vật,\r\nkhoảng cách giữa 2 vị trí là 12 cm đến 15 cm. Gia súc non có thể phải tiêm ở hai\r\nbên cổ.
\r\n\r\nTrước khi tiêm, cắt sạch lông ở vị trí tiêm,\r\nkiểm tra có tổn thương hay không.
\r\n\r\nĐánh dấu và đo độ dày của da trước khi tiêm\r\ntuberculin PPD bằng thước cặp.
\r\n\r\nTiêm tuberculin PPD bò/gà vào trong da (tiêm\r\nnội bì) tại vị trí tiêm đã chọn.
\r\n\r\nLiều tiêm: Dùng không ít hơn 2000 UI\r\ntuberculin PPD bò/gà và lượng tiêm không quá 0,2 ml.
\r\n\r\n5.1.4.3 Đọc kết quả
\r\n\r\nSau khi tiêm 72 h, đo độ dày nếp gấp của da\r\nvà đánh giá kết quả như sau: Trường hợp tiêm một mũi, kết quả cho thấy:
\r\n\r\n- Độ sưng da không lớn hơn 2 mm và con vật\r\nkhông có các triệu chứng lâm sàng: âm tính;
\r\n\r\n- Độ sưng da lớn hơn 2 mm và nhỏ hơn 4 mm,\r\ncon vật không có triệu chứng lâm sàng: nghi ngờ; Độ sưng da lớn hơn 2 mm\r\nvà nhỏ hơn 4 mm, con vật có triệu chứng lâm sàng: dương tính; Độ sưng da\r\nbằng hoặc lớn hơn 4 mm: dương tính.
\r\n\r\nVới những động vật cho kết quả nghi ngờ thì\r\nsau 42 ngày làm lại phản ứng. Sau khi kiểm tra lần hai, nếu cho kết quả nghi ngờ\r\nhoặc dương tính, kiểm tra lại bằng phản ứng tiêm nội bì hai mũi tuberculin PPD\r\nbò và tuberculin PPD gà.
\r\n\r\nĐối với vị trí tiêm ở đuôi, phản ứng là dương\r\ntính khi độ sưng da tại vị trí tiêm trừ độ dày da bên không tiêm bằng hoặc\r\nlớn hơn 4 mm. Nếu bò có một nếp gấp da đuôi, phản ứng dương tính khi độ sưng\r\nda tại vị trí tiêm bằng hoặc lớn hơn 8 mm.
\r\n\r\nTrường hợp tiêm hai mũi, kết quả cho thấy:
\r\n\r\n- Độ sưng da tại vị trí tiêm tuberculin PPD\r\nbò (mm) bằng hoặc nhỏ hơn độ sưng da tại vị trí tiêm tuberculin PPD gà (mm): âm\r\ntính;
\r\n\r\n- Độ sưng da tại vị trí tiêm tuberculin PPD\r\nbò (mm) lớn hơn độ sưng da tại vị trí tiêm tuberculin PPD gà (mm), chênh lệch\r\ngiữa hai độ sưng là từ 1 mm đến 4 mm: nghi ngờ;
\r\n\r\n- Độ sưng da tại vị trí tiêm tuberculin PPD\r\nbò (mm) lớn hơn độ sưng da tại vị trí tiêm tuberculin PPD gà (mm), chênh lệch\r\ngiữa hai độ sưng lớn hơn 4 mm: dương tính
\r\n\r\n5.1.4 Lấy mẫu, bảo quản, vận chuyển mẫu bệnh\r\nphẩm
\r\n\r\nLấy các mô nghi ngờ hoặc có bệnh tích với lượng\r\ntừ 10 g đến 200 g và đựng vào lọ miệng rộng hoặc túi nilon. Bệnh phẩm phải được\r\nlấy vô trùng, bảo quản trong điều kiện lạnh từ 2 oC đến 8 oC và gửi về phòng\r\nxét nghiệm chậm nhất 24 h sau khi lấy mẫu kèm theo giấy yêu cầu xét nghiệm có\r\nghi rõ triệu chứng, bệnh tích và các thông tin về dịch tễ.
\r\n\r\n5.2 Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm
\r\n\r\n5.2.1 Nuôi cấy, phân lập
\r\n\r\nNghiền bệnh phẩm thành huyễn dịch, sau đó được\r\nkhử tạp khuẩn bằng dung dịch axit oxalic 5 % hay dung dịch NaOH từ 2 % tới 4 %.\r\nHuyễn dịch được lắc trong 10 min ở nhiệt độ phòng (24 oC) rồi\r\nđem trung hoà với dung dịch HCl 2 N, sau đó ly tâm. Chất cặn được sử dụng\r\ncho nuôi cấy và kiểm tra kính hiển vi.
\r\n\r\nChất cặn được cấy lên các môi trường trứng và\r\nủ ở 37 oC trong vòng 8 tuần, tất cả các môi trường nên được bịt kín để\r\ntránh bị khô.
\r\n\r\nMột số môi trường được dùng để nuôi cấy vi\r\nkhuẩn lao như: Lowenstein Jensen (LJ), Stonebrink, Coletsos base, Herrold\r\negg yolk (HEY). Ngoài ra, có thể sử dụng môi trường Middlebrook 7H10 hay 7H11.
\r\n\r\n5.2.2 Giám định vi khuẩn
\r\n\r\n5.2.2.1 Giám định hình thái vi khuẩn từ môi\r\ntrường nuôi cấy
\r\n\r\nGiám định hình thái bằng phương pháp nhuộm\r\nZiehl-Neelsen theo quy định trong Phụ lục A. Vi khuẩn M.\r\nbovis hình gậy mảnh, bắt màu hồng trên nền xanh.
\r\n\r\n5.2.2.2 Giám định tính chất mọc trên các môi\r\ntrường
\r\n\r\nVi khuẩn M. bovis sẽ mọc trong vòng\r\n3 tuần tới 6 tuần nuôi cấy.
\r\n\r\nKhuẩn lạc mọc chậm ở 37oC, nhưng không mọc ở\r\n22oC hay 45oC.
\r\n\r\nKiểm tra sự phát triển của vi khuẩn bị ức chế\r\nbởi glyxerol: Cấy vi khuẩn lên cả 2 môi trường có và không có glyxerol.\r\nTrên môi trường có glyxerol vi khuẩn mọc yếu. Có thể sử dụng môi trường trứng\r\n(Lowenstein Jensen).
\r\n\r\nKiểm tra sự phát triển của vi khuẩn trong môi\r\ntrường có 0,4 % natri pyruvat: Cấy vi khuẩn lên môi trường Lowenstein\r\nJensen (không có glyxerol) có và không bổ sung 0,4 % natri pyruvat. Vi khuẩn M.\r\nbovis mọc tạo thành khuẩn lạc có dạng trơn, màu trắng nhạt.
\r\n\r\nKiểm tra sự mẫn cảm của vi khuẩn với\r\nthiophen-2-carbonic axit hydrazide (TCH): Cấy vi khuẩn lên môi trường\r\nLowenstein Jensen có bổ sung TCH 10 µg/ml: Vi khuẩn M .bovis không mọc.
\r\n\r\n5.2.2.3. Giám định các đặc tính sinh hóa
\r\n\r\nCác đặc tính sinh hoá đặc trưng của vi khuẩn M.\r\nbovis được trình bày ở bảng sau:
\r\n\r\n| \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Sản sinh niacin \r\n | \r\n \r\n âm tính \r\n | \r\n
| \r\n Phân giải nitrat \r\n | \r\n \r\n âm tính \r\n | \r\n
| \r\n Pyrazinamidase \r\n | \r\n \r\n âm tính \r\n | \r\n
| \r\n Urease \r\n | \r\n \r\n dương tính \r\n | \r\n
Phương pháp tiến hành: theo Phụ lục B.
\r\n\r\n\r\n\r\nBò bị bệnh lao khi có các đặc điểm sau:
\r\n\r\n- Con vật có các đặc điểm dịch tễ, triệu chứng\r\nvà bệnh tích của bệnh.
\r\n\r\n- Kết quả nuôi cấy, phân lập, giám định vi\r\nkhuẩn xác định là vi khuẩn Mycobacterium bovis.
\r\n\r\n\r\n\r\n
A.1. Thuốc nhuộm
\r\n\r\nA.1.1. Carbon fuchsin đặc
\r\n\r\n- Chuẩn bị thuốc nhuộm
\r\n\r\nFuchsin\r\nbasic 1,0\r\ng
\r\n\r\nEtanol 95 % (phần thể\r\ntích) 10,0\r\nml
\r\n\r\nPhenol 5,0\r\ng
\r\n\r\nNước 100,0\r\nml
\r\n\r\n- Fuchsin basic được hoà tan trong etanol,\r\nphenol được hoà tan trong nước. Trộn 2 dung dịch này với nhau và để vài\r\nngày rồi lọc qua giấy lọc, cho vào 1 chai sạch.
\r\n\r\nA.1.2. Dung dịch axit - alcohol
\r\n\r\nAxit clohydric đặc 8,0\r\nml
\r\n\r\nEtanol 95 % (phần thể\r\ntích) 97,0\r\nml
\r\n\r\nNên cho axit HCl vào cồn etanol.
\r\n\r\nA.1.3. Dung dịch xanh metylen
\r\n\r\nXanh\r\nmetylen 8,0\r\ng
\r\n\r\nEtanol 95 % (phần thể\r\ntích) 300,0\r\nml
\r\n\r\nNước 1300,0\r\nml
\r\n\r\nKali\r\nhydroxit 0,13\r\ng
\r\n\r\nA.2. Cách tiến hành
\r\n\r\nCho carbon fushin ngập tiêu bản đã được cố định\r\nvà được đặt trên giá. Dùng ngọn lửa đèn cồn đốt phía dưới tiêu bản để thuốc nhuộm\r\nbốc hơi trong 10 min nhưng không được sôi.
\r\n\r\nNhỏ dung dịch axit-alcohol trong 15 min (tẩy\r\nnhiều lần).
\r\n\r\nNhỏ xanh metylen lên tiêu bản trong 20 s.
\r\n\r\nRửa tiêu bản bằng nước, để khô.
\r\n\r\nA.3. Xem tiêu bản
\r\n\r\nNhỏ 1 giọt dầu vào tiêu bản và xem tiêu bản bằng\r\nkính hiển vi quang học bằng với vật kính độ phóng đại 100 lần.
\r\n\r\n\r\n\r\n
B.1. Phân giải nitrat
\r\n\r\nCho vài giọt nước vô trùng vào 1 ống nghiệm\r\ncó nắp vặn (16 mm x 125 mm) và cấy vào 1 vòng que cấy vi khuẩn lao. Dùng một ống\r\nnghiệm có nước cất vô trùng khác không cấy gì làm đối chứng âm. Cho 2 ml\r\ndung dịch NaNO3 (pha dung dịch NaNO3 0,01 M trong đệm phosphat 0,022\r\nM, pH 7). Lắc rồi ủ trong nồi đun cách thuỷ ở 37oC trong 2 h.
\r\n\r\nCho tiếp vao ống nghiệm 1 giọt axít HCl đặc\r\npha loãng 1/2, 2 giọt dung dịch sulphanilamid 0,2%, 2 giọt dung dịch\r\nN-(1-naphthyl) etylendiamin dihydroclorua 0,1%.
\r\n\r\nKiểm tra sự phát triển của màu hồng cho tới đỏ\r\nvà so sánh với đối chứng âm: màu đỏ sậm là phản ứng dương tính.
\r\n\r\nB.2. Kiểm tra sự mẫn cảm với pyrazinamid
\r\n\r\nDùng môi trường nước thịt Dubos có bổ sung\r\n0,1 g pyrazinamid, 2,0 g axit pyruvic và 15 g agar (cho 1 lít môi trường).\r\nChia vào ống nghiệm có nắp vặn 15 ml/ống. Hấp ở 121 oC trong 15 min rồi để\r\nrắn thạch ở vị trí thẳng.
\r\n\r\nCấy vào thạch một lượng vi khuẩn M.\r\nbovis đặc và ủ 37 oC trong 4 ngày. Sử dụng một ống không cấy và\r\nmột ống cấyM. avium làm đối chứng âm và dương.
\r\n\r\nCho 1 ml dung dịch amoni sắt (II) sulfat mới\r\nchuẩn bị vào ống và để vào tủ lạnh 4 h. Phản ứng dương tính nếu có một vạch\r\nmàu hồng trong thạch.
\r\n\r\nB.3. Urease
\r\n\r\nTrộn 1 phần thạch urê cơ bản với 9 phần nước\r\ncất vô trùng. Chia vào ống nghiệm có nắp (16 mm x 125 mm), mỗi ống 4 ml.
\r\n\r\nTrộn một vòng que cấy vào trong ống, ủ ở\r\n37oC.
\r\n\r\nMàu môi trường chuyển từ vàng sang hồng hoặc\r\nđỏ là dương tính.
\r\n\r\nB.4. Sản sinh niacin
\r\n\r\nNên sử dụng kít thương phẩm (ví dụ sản phẩm của\r\nDifco) vì chuẩn bị phản ứng này cần sử dụng dung dịch BrCN là chất độc đối\r\nvới cơ thể.
\r\n\r\n\r\n\r\n
File gốc của Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8400-10:2011 về bệnh động vật – quy trình chẩn đoán – phần 10: bệnh lao bò đang được cập nhật.
Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8400-10:2011 về bệnh động vật – quy trình chẩn đoán – phần 10: bệnh lao bò
Tóm tắt
| Cơ quan ban hành | Đã xác định |
| Số hiệu | TCVN8400-10:2011 |
| Loại văn bản | Tiêu chuẩn Việt Nam |
| Người ký | Đã xác định |
| Ngày ban hành | 2011-01-01 |
| Ngày hiệu lực | |
| Lĩnh vực | Nông nghiệp |
| Tình trạng | Hết hiệu lực |