TIÊU CHUẨN VIỆT\r\nNAM

TCVN 6604:2000

ISO 4052:1983

CÀ\r\nPHÊ – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CAPHEIN (PHƯƠNG PHÁP CHUẨN)

Coffee –\r\nDetermination of caffeine content (Reference method)

Lời nói đầu

TCVN 6604:2000 hoàn toàn tương đương với ISO 4052:1983;

TCVN 6604:2000 thay thế cho TCVN 5703:1993;

TCVN 6604:2000 do Ban kỹ thuật TCVN/TC/F16 Cà\r\nphê và sản phẩm cà phê biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn – Đo lường – Chất lượng\r\nđề nghị, bộ Khoa học Công nghệ và Môi trường ban hành.

CÀ PHÊ – XÁC ĐỊNH HÀM\r\nLƯỢNG CAPHEIN (PHƯƠNG PHÁP CHUẨN)

Coffee –\r\nDetermination of caffeine content (Reference method)

0. Giới thiệu

Phương pháp mô tả trong tiêu chuẩn này đã\r\nđược chọn, qua nghiên cứu so sánh nhiều phương pháp, vì tính khả thi, độ tái\r\nlập, tính đặc trưng, tính dễ áp dụng và tính nhanh chóng của nó, sau khi đã\r\nchọn từ một số phương pháp và đã tiến hành nghiên cứu so sánh giữa các phương\r\npháp đó.

Tuy nhiên, phương pháp này đặc biệt nhậy đối\r\nvới các thay đổi trong việc vận dụng và do đó luôn phải tuân thủ các hướng dẫn\r\nthực hành trong mọi chi tiết.

1. Phạm vi và lĩnh\r\nvực áp dụng

Tiêu chuẩn này qui định phương pháp chuẩn để\r\nxác định hàm lượng caphêin trong cà phê.

Phương pháp này có thể áp dụng cho cà phê\r\nnhân, cà phê nhân đã loại bỏ caphêin, của hạt cà phê rang, cà phê rang đã loại\r\nbỏ caphêin, chất lỏng và chất khô chiết được từ cà phê, chất lỏng và chất khô\r\nchiết được từ cà phê đã loại bỏ caphêin.

Giới hạn dưới của phát hiện là 0,02% caphêin\r\ntrong chất khô.

2. Tiêu chuẩn trích\r\ndẫn

TCVN 6536:1999 (ISO 1447:1978) Cà phê nhân –\r\nXác định độ ẩm (phương pháp thông thường).

TCVN 5567:1991 (ISO 3726:1983) Cà phê tan –\r\nXác định khối lượng hao hụt khi sấy ở 70^oC dưới áp suất thấp.

TCVN 6539:1999 (ISO 4072:1982) Cà phê nhân\r\nđóng trong bao – Lấy mẫu.

TCVN 6605:2000 (ISO 6670:1983) Cà phê tan\r\nđựng trong thùng có lót – Lấy mẫu.

ISO 6673 Cà phê nhân – Xác định khối lượng\r\nhao hụt khi sấy ở 105 ^oC.

3. Nguyên tắc

Chiết caphêin từ phần mẫu thử trong môi\r\ntrường amoniac. Tinh chế tiếp bằng dietyl ete trên 2 cột sắc ký, cột thứ nhất\r\ncó môi trường kiềm, cột thứ 2 có môi trường axit, sau đó rửa giải caphêin bằng\r\ncloroform.

Đo phổ của chất rửa giải ở bước sóng hấp thụ\r\ncực đại (trong vùng cực tím).

4. Thuốc thử

Chỉ được dùng các thuốc thử đạt chất lượng\r\nphân tích. Nước dùng phải là nước cất hoặc nước ít nhất có độ tinh khiết tương\r\nđương.

4.1. Axit sunfuaric, 200 g/l [c(H₂SO₄)\r\n» 2 mol/l]

4.2. Dung dịch natri hydroxit, 80 g/l [c (NaOH) » 2 mol/l].

4.3. Đất Điatomit

Sản phẩm được dùng phải đảm bảo thu hồi ít\r\nnhất 98% caphêin từ phần mẫu thử.

Chú thích – Celite 545 là chất thích hợp.

4.4. Dung dịch amoniac 70g/l (1 thể tích\r\ndung dịch amoniac đậm đặc, P₂₀ »\r\n0,9 g/ml, + 2 thể tích nước).

4.5 Dietyl ete, tinh khiết hoặc đã\r\nđược làm tinh khiết lại (xem 7.5) bằng chạy sắc ký dưới đây, và cho bão hòa với\r\nnước.

Cho 800 ml dietyl ete chạy qua cột chứa 100g\r\noxit nhôm kiềm có hoạt tính độ 1. Dietyl ete sau khi được làm tinh chế như vậy\r\ncần phải bảo quản trong chai tối màu cho đến khi sử dụng.

(Hoặc là, dietyl ete vừa mới chưng cất và\r\nkhông chứa peroxit, có thể được dùng thay cho dietyl ete làm tinh chế bằng sắc\r\nký).

4.6. Caphêin, [1,3,7-trimetyl-2,6\r\ndioxopurine (C₈H₁₀N₄O₂)], tinh\r\nkhiết, khan.

4.7. Cloroform, tinh khiết hoặc được\r\nlàm tinh khiết (xem 7.5) bằng chạy sắc ký như qui định trong 4.5, và cho bão\r\nhòa với nước.

5. Thiết bị, dụng cụ

5.1. Cột sắc ký (xem hình 1), dài 250\r\nmm, đường kính trong 21 mm (cột I) và đường kính trong 17 mm (cột II), và có\r\nvan khóa thích hợp nhất là của PTFE.

5.2. Máy đo phổ tử ngoại, có độ chính xác tới\r\n0,004 đơn vị hấp thụ trong dải sử dụng.

5.3. Cuvet bằng silica với đường quang dài\r\n10 mm.

5.4. Các dụng cụ thí nghiệm thông thường, bao\r\ngồm

5.4.1. Cốc thí nghiệm, dung tích 100 ml.

5.4.2. Nồi cách thủy

5.4.3. Bình định mức 1 vạch, dung tích 50,100, 1\r\n000 ml

5.4.4. Pipet 1 vạch, dung dịch 2 ml và 5\r\nml.

5.4.5. Cân phân tích

5.5. Cối xay cà phê, thích hợp để xay hạt\r\ncà phê rang.

5.6. Máy xay kiểu đĩa có răng, có\r\nvỏ làm mát, hoặc máy xay phân tích có bộ phận cắt và vỏ làm mát, hoặc cối xay\r\ntương ứng thích hợp để xay hạt cà phê nhân.

5.7. Bộ rây thí nghiệm, đan bằng lưới kim\r\nloại kích thước tiêu chuẩn của mắt rây là 600 mm hoặc 630 mm,\r\nđáp ứng được các yêu cầu của ISO 3310/1.

6. Lấy mẫu

Việc lấy mẫu phải phù hợp với các phương pháp\r\nqui định ở các tiêu chuẩn thích hợp.

7. Cách tiến hành

7.1. Chuẩn bị mẫu thử

Nếu cần thiết, nghiền mẫu, sử dụng dụng cụ\r\nthích hợp được qui định tương ứng trong 5.5 hoặc 5.6 cho đến khi mẫu lọt được\r\nqua rây (5.7).

7.2. Xác định hàm lượng chất khô

Tính hàm lượng chất khô sau khi đã xác định\r\nđộ ẩm trong 1 phần của mẫu thử (7.1) theo các phương pháp được qui định trong\r\ncác tiêu chuẩn tương ứng.

7.3. Phần mẫu thử

7.3.1. Cà phê nhân và cà phê đã rang

Cân khoảng 1 g mẫu thử (7.1) chính xác tới\r\n0,1 g. Cho mẫu vào 1 cốc thí nghiệm 100 ml (5.4.1), thêm 5 ml dung dịch amoniac\r\n(4.4) và làm nóng trong nồi cách thủy (5.4.2) 2 phút. Để cho nguội sau đó\r\nchuyển sang bình định mức 100 ml (5.4.3), cho thêm nước đến vạch và khuấy. Để\r\ncho dung dịch đục này lắng xuống, sau đó dùng pipet (5.4.4) lấy 5,0 ml dung\r\ndịch chuyển vào 1 cốc thí nghiệm (5.4.1) cho thêm 6 g điatomit (4.3) và khuấy\r\nthật kỹ.

7.3.2. Chất chiết khô của cà phê

Tiến hành như qui định trong 7.3.1, nhưng lấy\r\n0,5 g phần mẫu thử, và lấy 2 ml dung dịch đục, và 3 g đất điatomit.

7.3.3. Chất chiết lỏng của cà phê

Tiến hành như qui định trong 7.3.1, nhưng lấy\r\n1 đến 2,5 g phần mẫu thử tương ứng khoảng 0,5g cà phê tan khô, và lấy 2 ml hỗn\r\nhợp dung dịch đục, và 3 g đất điatomit.

7.3.4. Cà phê nhân đã loại caphêin và cà phê\r\nrang đã loại caphêin

Cân lấy 1g mẫu thử (7.1) chính xác tới 0,1 g.\r\ncho mẫu vào 1 cốc thí nghiệm 100 ml (5.4.1), thêm 5 ml dung dịch amoniac (4.4)\r\nvà hâm nóng trong nồi cách thủy (5.4.2) 2 phút, cho thêm 6 g đất điatomit (4.3)\r\nvà khuấy kỹ.

7.3.5. Chất chiết khô của cà phê đã loại\r\ncaphêin

Tiến hành như qui định trong 7.3.4, nhưng lấy\r\n0,5 g mẫu thử.

7.3.6. Chất chiết lỏng của cà phê đã loại\r\ncaphêin

Tiến hành như qui định trong 7.3.4, nhưng lấy\r\n1 đến 2,5 g mẫu thử, tương ứng khoảng 0,5 g cà phê tan khô, và 7 đến 8 g đất\r\nđiatomit.

7.4. Tiến hành xác định

7.4.1. Nhồi đầy các cột

7.4.1.1. Cột I (Cột kềm)

7.4.1.1.1. Lớp A

Trộn cẩn thận 3 g điatomit (4.3) và 2 ml dung\r\ndịch hyđroxit natri (4.2.) bằng dao trộn mềm, cho đến khi đồng nhất (xem chú\r\nthích). Thu được bột hơi ướt. Cho 1 phần , khoảng 2 mg bột lên cột sắc ký đường\r\nkính 21 mm (5.1), đầu dưới của cột được nhồi bằng bông hoặc len thủy tinh. Sau\r\nmỗi lần đưa bột lên cột, dùng đũa thủy tinh có 1 đầu phẳng khít với đường kính\r\ntrong của cột lèn nhẹ lên để có một lớp đồng nhất và kết chặt với nhau. Có thể\r\ndùng 1 miếng bông hoặc len thủy tinh nhỏ để phủ lên trên mặt lớp A.

Chú thích – Chất liệu nhồi cột có thể được\r\nchuẩn bị trước và bảo quản trong vật chứa kín. Mỗi cột kiềm cần 5,16 g.

7.4.1.1.2. Lớp B

Chuyển hỗn hợp đất diatomit và mẫu thử (7.3)\r\nvào cột lên trên mặt lớp A. Làm khô cốc thí nghiệm 2 lần, với khoảng 1 g đất\r\nđiatomit (4.3) rồi cho điatomit này vào cột. Lèn nhẹ xuống để có được 1 lớp\r\nđồng nhất và phủ 1 miếng bông hoặc len thủy tinh lên trên mặt lớp B.

7.4.1.2. Cột II (Cột axit)

Cho lên cột sắc ký đường kính 17 mm (5.1),\r\nđầu dưới của cột được nhồi bằng len thủy tinh, 3 g điatomit (4.3) và 3 ml dung\r\ndịch axit sunphuric (4.1) trộn cẩn thận và nhồi vào cột như đã mô tả đối với\r\nlớp A của cột I trong 7.4.1.1. Dùng 1 miếng len thủy tinh để phủ lên trên mặt\r\nlớp này.

Chú thích – Chất liệu nhồi cột có thể được chuẩn\r\nbị trước và bảo quản trong vật chứa kín. Mỗi cột kiềm cần 6,36 g.

7.4.2. Chạy sắc ký

Dựng các cột chồng lên nhau, sao cho khi chất\r\nchảy ra từ cột I sẽ giọt trực tiếp vào cột II. Cho 150 ml đietyl ete (4.5) chảy\r\nqua cả 2 cột. Điều chỉnh van khóa của cột 2 sao cho còn 1 lượng chất lỏng trên\r\nbề mặt lớp (cột II). Tháo cột I ra. Cho 50 ml đietyl ete (4.5) chảy qua cột II,\r\ndùng 1 phần đietyl ete để rửa miệng cột I rồi cho nốt phần này lên cột II. Cho\r\nchất lỏng chảy hết khỏi cột II.

Chú thích – Đietyl ete đã dùng có thể tái\r\nsinh bằng cách lắc khuấy trong sắt (II) sunphat.

Thổi luồng không khí từ đỉnh xuống đáy cột II\r\n(thí dụ dùng quả bóp cao su), cho đến khi không còn đietyl ete nhỏ giọt từ cột\r\nvà luồng không khí từ van khoá chỉ thoang thoảng có mùi đietyl ete (xem cảnh\r\nbáo sau). Dùng 45 đến 50 ml cloroform (4.7) để làm thôi chất hấp thụ trên cột\r\nII.  Thu chất thôi ra vào bình thể tích 50 ml một vạch (5.4.3), dùng cloroform\r\npha loãng tới vạch (4.7) và khuấy kỹ.

Tốc độ chảy của đietyl ete và của cloroform\r\ndưới điều kiện chảy tự nhiên phải nằm trong khoảng từ 1,5 ml/phút đến 3 ml/phút.\r\nNếu vượt quá tốc độ này phải nghi ngờ có chảy xói và tiến hành xác định lại.

Cảnh báo – Việc cho đietyl ete và cloroform\r\nphải được thực hiện trong tủ hút thông gió tốt để đề phòng cả khả năng hít phải\r\nhơi dung môi và lẫn cả khả năng nổ.

7.4.3. Đo quang phổ (xem hình 2)

7.4.3.1. Đo dung dịch thử

Để tránh sai sót do cloroform bay hơi, dùng\r\ncuvet silica (5.3) đo độ hấp thụ của dung dịch caphêin trong cloroform (7.4.2)\r\nđối chiếu với cloroform (4.7) trên máy đo quang phổ được dùng ở bước sóng hấp\r\nthụ cực đại (khoảng 276 nm), và ở các bước sóng trên và dưới bước sóng này 30\r\nnm nhằm kiểm tra độ tinh khuyết của caphêin thu được.

Nếu như độ hấp thụ cực đại vượt quá khả năng\r\nđo chính xác của máy sử dụng thì tiến hành đo lại với một phần thử khác của\r\ndung dịch caphêin được pha loãng trong cloroform (7.4.2). Trong trường hợp đó\r\nkhi tính kết quả cần chú ý đến hệ số pha loãng; những thừa số thích hợp của\r\ncông thức nêu trong 8.1.1, 8.1.2 và 8.1.3 cũng phải được điều chỉnh cho phù\r\nhợp. Nếu độ hấp thụ cực đại thấp hơn 0,2 thì tiến hành lại trên phần thử khác\r\ncó khối lượng lớn hơn.

7.4.3.2. Chuẩn bị và đo dung dịch chuẩn (đối\r\nchứng)

Chuẩn bị dung dịch caphêin chuẩn theo cách\r\nnhư sau:

Cân lấy 100 mg ± 20 mg caphein khan tinh khiết (4.6),\r\nchính xác tới 0,1 mg. Cho vào bình định mức dung tích 1 000 ml (5.4.3) hòa tan\r\ntrong cloroform và pha loãng đến vạch. Dung pipet (5.4.4) chuyển 5,0 ml dung\r\ndịch này vào bình định mức dung tích 50 ml (5.4.3) và pha loãng đến vạch bằng\r\ncloroform.

Đo độ hấp thụ của dung dịch này theo mô tả\r\ntrong 7.4.3.1. Độ hấp thụ đúng của dung dịch chuẩn (xem 8.1.1 và hình 2) phải\r\nnằm trong vùng 0,4.

7.4.4. Số lần xác định

Tiến hành hai phép xác định trên các phần thử\r\nriêng rẽ lấy từ cùng một mẫu thử.

7.5. Thử trắng

Tiến hành thử trắng trên các thuốc thử, sử\r\ndụng qui trình đã mô tả ở trên, nhưng bỏ qua phần mẫu thử.

Trước khi sử dụng các thuốc thử đã tái tinh\r\nchế (xem 4.5 và 4.7), cần lặp lại thử trắng để kiểm tra độ tinh khiết của\r\nchúng.

8. Biểu thị kết quả

8.1. Phương pháp và công thức tính

8.1.1. Cà phê nhân và cà phê đã rang

Hàm lượng caphêin của mẫu, biểu thị bằng gam\r\ntrên 100 gam chất khô, bằng:

trong đó

c là nồng độ của caphêin trong dung dịch\r\nchuẩn (7.4.3.2), bằng gam trên mililit;

A₁ là độ hấp thụ đúng của chất\r\ncafein (7.4.2) chất chiết tinh khiết thu được trong 7.4.3.1, nghĩa là

(A₁)_l -

trong đó:

l\r\nchỉ bước sóng hấp thụ cực đại (khoảng 276 nm);

A₂ là độ hấp thụ đúng của dung\r\ndịch caphêin chuẩn (7.4.3.2), nghĩa là

(A₂)_l -

m là khối lượng của phần mẫu thử, tính bằng\r\ngam;

P là hàm lượng chất khô của mẫu, tính bằng\r\nphần trăm khối lượng (xem 7.2).

8.1.2. Chất chiết từ cà phê dạng khô và dạng\r\nlỏng

Hàm lượng caphêin của mẫu, tính bằng gam trên\r\n100 gam chất khô, theo công thức:

Trong đó các ký hiệu giống như trong 8.1.1.

8.1.3. Cà phê nhân, cà phê rang đã loại\r\ncaphêin, chất chiết khô của cà phê đã loại caphêin và chất chiết lỏng của cà\r\nphê đã loại caphêin

Hàm lượng caphêin của mẫu, tính bằng gam trên\r\n100 gam chất khô, theo công thức:

Trong đó các ký hiệu giống như trong 8.1.1.

8.1.4. Kết quả

Lấy kết quả là trung bình cộng của các giá\r\ntrị thu được với điều kiện thỏa mãn yêu cầu về độ lặp lại (xem 8.2).

8.2. Độ lặp lại

Chênh lệch giữa các kết quả thử độc lập,\r\nriêng rẽ thu được khi tiến hành đồng thời hay sau một khoảng thời gian ngắn, áp\r\ndụng một phương pháp, tiến hành trên cùng một mẫu thử, ở một phòng thí nghiệm,\r\ndo cùng một kỹ thuật viên thực hiện, dùng cùng một loại dụng cụ không được vượt\r\nquá giá trị nêu trong bảng.

8.3. Độ tái lập

Chênh lệch giữa các kết quả thu được của hai\r\nphép thử riêng rẽ khi áp dụng cùng một phương pháp, trên cùng một mẫu thử, thực\r\nhiện ở các phòng thí nghiệm khác nhau, do các kỹ thuật viên khác nhau, sử dụng\r\ncác dụng cụ khác nhau không được vượt quá giá trị nêu trong bảng.

9. Báo cáo kết quả

Báo cáo kết quả phải chỉ ra phương pháp đã sử\r\ndụng và kết quả thu được. Cũng phải đề cập đến tất cả các chi tiết thao tác\r\nkhông quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc tuỳ ý lựa chọn, cùng với các chi tiết\r\nbất thường nào khác có thể ảnh hưởng tới kết quả.

Báo cáo kết quả cũng bao gồm tất cả các thông\r\ntin cần thiết về việc nhận biết hoàn toàn mẫu thử.

Bảng – Độ lặp lại và độ\r\ntái lập

* Các trị số của độ lặp lại và độ tái lập là\r\ncác hiệu số tới hạn ở mức xác suất 95%

Hình 1 – Cột sắc ký

Hình 2 – Thí dụ về đo\r\nphổ