Lời nói đầu
\r\n\r\nTCVN 9591:2013 hoàn toàn tương đương với ISO\r\n17372:2008;
\r\n\r\nTCVN 9591:2013 do Cục Chăn nuôi biên soạn, Bộ\r\nNông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất\r\nlượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.
\r\n\r\nTiêu chuẩn này dùng để phân tích zearalenon\r\ntrong thức ăn chăn nuôi và nguyên liệu thức ăn chăn nuôi, bao gồm lúa mạch,\r\nngô, yến mạch, lúa mạch đen, bột mì, bột đậu tương, bột hạt canola ép lấy dầu\r\n(hạt cải dầu), gluten ngô, bã rượu khô, hạt đậu lăng và bã củ cải đường. Giới\r\nhạn định lượng là 0,05 mg/kg (50 mg/kg).\r\nGiới hạn định lượng thấp hơn có thể có được tùy thuộc vào việc thực hiện đánh\r\ngiá thích hợp của người sử dụng phòng thử nghiệm.
\r\n\r\n\r\n\r\nCác tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho\r\nviệc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì\r\náp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố\r\nthì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).
\r\n\r\nTCVN 2230 (ISO 565), Sàng thử nghiệm - Lưới\r\nkim loại đan, tấm kim loại đột lỗ và lưới đột lỗ bằng điện - Kích thước lỗ danh\r\nnghĩa.
\r\n\r\nTCVN 4851 (ISO 3696), Nước dùng để phân tích\r\ntrong phòng thí nghiệm - Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử.
\r\n\r\nTCVN 6952 (ISO 6498), Thức ăn chăn nuôi -\r\nChuẩn bị mẫu thử.
\r\n\r\nTCVN 7151 (ISO 648), Dụng cụ thí nghiệm bằng\r\nthủy tinh - Pipet một mức.
\r\n\r\nTCVN 7153 (ISO 1042), Dụng cụ thí nghiệm bằng\r\nthủy tinh - Bình định mức.
\r\n\r\nTCVN 8488 (ISO 4788), Dụng cụ thí nghiệm bằng\r\nthủy tinh - Ống đong chia độ.
\r\n\r\n\r\n\r\nMẫu được chiết bằng axetonitril loãng và được\r\nlọc để làm sạch. Sau đó dịch chiết lỏng được pha loãng bằng nước hoặc bằng muối\r\nđệm phosphat (PBS) và được tinh sạch bằng sắc ký cột miễn nhiễm (IAC). Dịch\r\nchiết đã tinh sạch được phân tích bằng sắc ký lỏng hiệu nâng cao (HPLC) pha đảo\r\ncó detector huỳnh quang. Các mẫu nghi ngờ dương tính có thể được khẳng định\r\nbằng cách tính tỷ số bước sóng, dùng phép phân tích HPLC pha chuẩn, hoặc bằng\r\ncách dùng detector mảng diot.
\r\n\r\n\r\n\r\nChỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân\r\ntích, trừ khi có quy định khác.
\r\n\r\nCẢNH BÁO - Xử lý các dung môi và dung dịch\r\ntrong tủ hút. Đeo kính an toàn, mặc quần áo bảo vệ và tránh để tiếp xúc với da.
\r\n\r\n4.1 Nước, loại 1 phù hợp với quy định trong\r\nTCVN 4851 (ISO 3696).
\r\n\r\n4.2 Axetonitril
4.3 Metanol (CH3OH), loại dùng cho\r\nHPLC.
\r\n\r\n4.4 Natri clorua
4.5 Dung môi chiết
Trộn 900 ml axetonitril (4.2) với 100 ml nước\r\n(4.1). Trộn đều.
\r\n\r\n4.6 Axetonitril loãng
Trộn 1 phần thể tích axetonitril (4.2) với 1\r\nphần thể tích nước (4.1). Trộn đều. Dung dịch này được dùng cho xyranh lấy mẫu\r\ntự động, nếu có thể.
\r\n\r\n4.7 Metanol loãng
Trộn 75 ml methanol (4.3) với 175 ml nước\r\n(4.1). Trộn đều.
\r\n\r\n4.8 Dinatri hydrophosphat
4.9 Kali dihydrophosphat
4.10 Kali clorua
4.11 Natri hydroxit
4.12 Muối đệm phosphat
Hòa tan 8 g natri clorua (4.4), 1,16 g\r\ndinatri hydrophosphat (4.8), 0,2 g kali hydrophosphat (4.9) và 0,2 g kali\r\nclorua (4.10) trong 1 lít nước (4.1). Chỉnh pH đến 7,4 bằng dung dịch natri\r\nhydroxit (4.13). Ngoài ra, có thể mua PBS đậm đặc đã được chuẩn bị rồi pha\r\nloãng để sử dụng.
\r\n\r\n4.13 Dung dịch natri hydroxit,
Hòa tan 8 g natri hydroxit (4.11) trong 1 lít\r\nnước (4.1).
\r\n\r\n4.14 Pha động HPLC
\r\n\r\nCho 460 ml axetonitril (4.2) vào bình đựng\r\nthuốc thử dung tích 1 lít, thêm 460 ml nước (4.1) và 80 ml metanol (4.3). Trộn\r\nđều rồi lọc qua bộ lọc có cỡ lỗ 0,45 mm\r\n(5.14).
\r\n\r\n4.15 Dung dịch chuẩn gốc zearalenon 50 mg/ml.
CẢNH BÁO - Zearalenon là một oestrogen. Việc\r\nxử lý có ảnh hưởng đến hoạt tính sinh học của thuốc thử này.
\r\n\r\nCân 5,0 mg zearalenon, chính xác đến 0,1 mg.\r\nChuyển vào bình định mức một vạch 100 ml (5.1.2). Hòa tan trong axetonitril\r\n(4.2) và thêm axetonitril đến vạch.
\r\n\r\nHiệu chuẩn dung dịch chuẩn như sau: dùng\r\npipet (5.1.3) lấy 4,0 ml chất chuẩn gốc cho vào bình định mức một vạch 25 ml\r\n(5.1.2) và thêm axetonitril đến vạch (khoảng 8 mg zearalenon trên mililit).
\r\n\r\nĐo độ hấp thụ tia cực tím (UV), dùng cuvet\r\nthạch anh có chiều dài đường quang 10 mm.
\r\n\r\nXác định nồng độ,
(1)
trong đó
\r\n\r\nMr là khối lượng phân tử\r\ntương đối của zearalenon bằng 318,4;
\r\n\r\nA là độ hấp thụ UV;
\r\n\r\ne là\r\nđộ phát xạ, ở bước sóng 274 nm, bằng 12 623 ±\r\n111.
\r\n\r\nBáo cáo kết quả đến ba chữ số có nghĩa.
\r\n\r\nDung dịch chuẩn gốc bền trong ít nhất 1 năm\r\nnếu được bảo quản ở điều kiện lạnh và kín khí. Hiệu chỉnh lại khi chuẩn bị các\r\ndung dịch chuẩn pha loãng mới (4.16 và 4.17).
\r\n\r\n4.16 Dung dịch thêm chuẩn
Pha loãng 10,0 ml dung dịch chuẩn gốc (4.15)\r\nđến 100 ml bằng dung môi chiết (4.5). Bảo quản dung dịch trong tủ lạnh. Chuẩn\r\nbị dung dịch mới 6 tháng một lần.
\r\n\r\n4.17 Dung dịch chuẩn HPLC
\r\n\r\nChuẩn bị năm dung dịch chuẩn zearalenon có\r\nnồng độ cho trong Bảng 1 bằng cách pha loãng dung dịch thêm chuẩn (4.16) hoặc\r\ndung dịch chuẩn HPLC (4.17.1) có pha động HPLC (4.14)
\r\n\r\n| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
Bảo quản tất cả dung dịch chuẩn HPLC trong tủ\r\nlạnh. Chuẩn bị dung dịch mới 6 tháng một lần.
\r\n\r\n\r\n\r\nSử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử\r\nnghiệm thông thường và cụ thể sau:
\r\n\r\n5.1 Dụng cụ thủy tinh thông thường của phòng\r\nthí nghiệm.
\r\n\r\n5.1.1 Ống đong
5.1.2 Bình định mức một vạch
5.1.3 Pipet, phù hợp với loại A quy định trong\r\nTCVN 7151 (ISO 648).
\r\n\r\n5.2 Máy đo quang phổ UV
5.3 Ống hút chân không
5.4 Bình nón
5.5 Giấy lọc
5.6 Ống thủy tinh
5.7 Ống ly tâm
5.8 Phễu thủy tinh
5.9 Giấy lọc vi sợi thủy tinh
5.10 Cột miễn nhiễm
5.11 Máy lắc
5.12 Xyranh bằng chất dẻo
5.13 Bộ lọc xyranh dùng một lần
5.14 Hệ thống lọc dung môi
5.15 Hệ thống HPLC
5.15.1 Bơm, loại không xung, lưu lượng 0,5\r\nml/min đến 1,5 ml/min.
\r\n\r\n5.15.2 Hệ thống bơm mẫu
5.15.3 Cột phân tích
5.15.4 Detector huỳnh quang
5.15.5 Bộ tích phân
5.15.6 Detector mảng diot
5.16 Bộ lọc vi sợi thủy tinh
5.17 Bình hứng
5.18 Thủy tinh frit
5.19 Sàng, phù hợp với quy định trong TCVN 2230\r\n(ISO 565).
\r\n\r\n5.20 Bộ cô mẫu bằng nitơ
5.21 Máy trộn Vortex.
\r\n\r\n\r\n\r\nMẫu được gửi đến phòng thử nghiệm phải là mẫu\r\nđại diện. Mẫu không bị hư hỏng hoặc thay đổi trong suốt quá trình bảo quản hoặc\r\nvận chuyển.
\r\n\r\nViệc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn\r\nnày. Nên lấy mẫu theo TCVN 4325 (ISO 6497) [1].
\r\n\r\nCác mẫu cần được bảo quản đông lạnh để tránh\r\nlàm thay đổi các mức độc tố vi nấm do sự phát triển của nấm mốc.
\r\n\r\n\r\n\r\nChuẩn bị mẫu thử theo TCVN 6952 (ISO 6498).
\r\n\r\nNghiền toàn bộ mẫu phòng thử nghiệm sao cho\r\nlọt hết qua sàng có cỡ lỗ danh nghĩa 1 mm (5.19). Trộn kỹ.
\r\n\r\nCác nghiên cứu đối với các độc tố vi nấm khác\r\ncho thấy các mẫu nghiền lọt qua sàng lỗ tròn cỡ lỗ 0,5 mm và sàng cỡ lỗ 1,0 mm\r\nlàm giảm độ biến thiên của phép phân tích lặp lại và làm tăng hiệu quả chiết.\r\nNên sử dụng thiết bị nghiền tạo cỡ hạt nhỏ hơn 1 mm; tuy nhiên, cần cẩn thận\r\ntránh làm mẫu bị quá nhiệt vì lỗ sàng tròn quá nhỏ. Nên dùng sàng lỗ tròn cỡ lỗ\r\n0,75 mm; hầu hết mẫu nghiền lọt qua sàng có cỡ lỗ danh định 0,5 mm.
\r\n\r\n\r\n\r\nNên dùng mẫu kiểm soát chất lượng; các kết\r\nquả phân tích phải đáp ứng yêu cầu về độ thu hồi, nghĩa là
Tiến hành từng phần mẫu thử như sau:
\r\n\r\nCân 50,00 g mẫu thử, chính xác đến 0,01g, cho\r\nvào bình nón 500 ml (5.4).
\r\n\r\nCân và thêm 5 g natri clorua (4.4).
\r\n\r\nThêm 150 ml dung môi chiết (4.5). Lắc trong 1\r\nh. Tiến hành qui trình làm sạch IAC (8.3).
\r\n\r\nCác chất nền như thức ăn gia súc ủ xilô khô\r\ncó thể hấp thụ gần hết 150 ml dung môi chiết. Trong trường hợp đó, tăng thể\r\ntích dung môi chiết đến 200 ml hoặc 250 ml.
\r\n\r\nBước lắc có thể được bắt đầu vào cuối ngày,\r\ndùng máy lắc (5.11) có thiết bị hẹn giờ, nếu cần, lắc đến đầu buổi sáng của\r\nngày hôm sau, rồi tiến hành bước 8.3.
\r\n\r\nTiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất\r\nIAC, nhưng dùng bình hứng (5.17) có thủy tinh frit (5.18), bộ lọc GF/D (5.16)\r\ndùng cho cột ZearalaTest 1) (8.3.1) và dùng cho cột EASI-EXTRACT 1)\r\n(8.3.2), rửa giải bằng 2,0 ml chất rửa giải. Đối với các loại cột khác, tiến\r\nhành theo 8.3.1 hoặc 8.3.2.
\r\n\r\nĐối với phép phân tích các nền mẫu được nhuộm\r\nmàu ở mức cao và các chất nền có mặt gây nhiễu sắc đồ, thì tùy chọn phương án.\r\nDùng methanol 30 % thể tích (4.7) rửa giải các chất gây nhiễu mà không làm biến\r\ntính kháng thể; methanol không vượt quá 35% thể tích. Đối với tất cả các loại\r\nIAC, để đạt được giới hạn định lượng 0,05 mg/kg, để giảm sự biến thiên và tăng\r\nsắc ký HPLC, thì làm bay hơi các chất rửa giải cột rồi hòa tan trong một thể\r\ntích tối thiểu (2,0 ml) của pha động (4.14).
\r\n\r\nCHÚ THÍCH 1: Có thể bổ sung nhiều hơn 10 ml\r\ndịch lọc pha loãng vào cột trong các bước 8.3.1.4 và 8.3.2.5 với điều kiện\r\nkhông được vượt quá khả năng nạp của cột. Khi sử dụng thể tích lớn hơn có thể\r\ngây tắc thủy tinh frit và cột; lúa mạch được biết đến là nguyên nhân gây tắc,\r\nmặc dù sử dụng hai bộ lọc trên thủy tinh frit để tránh hiện tượng này. Cột có\r\nlỗ rộng ít gây tắc hơn.
\r\n\r\nCHÚ THÍCH 2: Việc tinh sạch dịch lọc dùng cho\r\nIAC ảnh hưởng đến hiệu suất của cột. Ngoài nguyên nhân gây tắc cột, các hạt có\r\nthể ngăn cản sự hấp thụ zearalenon vào các kháng thể, dẫn đến độ thu hồi không\r\nổn định và thấp.
\r\n\r\n8.3.1 Cột miễn nhiễm ZearalaTest 1)\r\n[dạng chuẩn và lỗ rộng (WB)]
\r\n\r\n8.3.1.1 Lọc nhiều hơn 10 ml dịch chiết qua\r\ngiấy lọc gấp nếp (5.5) vào trong bình nón 125 ml (5.4).
\r\n\r\n8.3.1.2 Dùng pipet (5.1.3) lấy 10 ml dịch\r\nchiết đã lọc cho vào bình định mức một vạch 50 ml (5.1.2) và thêm nước đến\r\nvạch. Trộn đều. Lọc dịch chiết đã pha loãng (khoảng 25 ml) qua giấy lọc vi sợi\r\nthủy tinh (5.9) vào ống ly tâm 50 ml (5.7).
\r\n\r\n8.3.1.3 Nối IAC vào ống hút chân không (5.3).\r\nLắp bình hứng (5.17) có thủy tinh frit (5.18) lên đỉnh cột. Cần một ống nối cho\r\ncột WB. Gắn bộ lọc vi sợi thủy tinh (5.16).
\r\n\r\nĐối với cột dạng chuẩn thì cần đến hai bộ lọc\r\nvi sợi thủy tinh cho một số chất nền, ví dụ lúa mạch. Nếu dung dịch đã lọc\r\n(8.3.1.2) sạch thì không cần thủy tinh frit hoặc bộ lọc.
\r\n\r\n8.3.1.4 Dùng pipet (5.1.3) lấy 10 ml dịch lọc\r\n(8.3.1.2) cho vào bình hứng. Rót dịch chiết qua cột ở tốc độ dòng cố định cho\r\nđến khi không khí đi qua cột; tốc độ dòng phải tạo thành các giọt nhỏ (từ 1\r\ngiọt đến 2 giọt mỗi giây).
\r\n\r\n8.3.1.5 Đối với các sản phẩm có chất nhuộm\r\nmàu và các mẫu có các pic gây nhiễu thì rửa cột bằng 15 ml metanol 30 % 0 (4.7)\r\nở tốc độ 1 giọt đến 2 giọt mỗi giây cho đến khi không khí đi qua cột. Đối với\r\ntất cả các loại mẫu khác, rửa cột bằng 10 ml nước (4.1) ở tốc độ 1 giọt đến 2\r\ngiọt mỗi giây cho đến khi không khí đi qua cột.
\r\n\r\n8.3.1.6 Tháo bình hứng rồi lắp bình không có\r\nthủy tinh frit (không yêu cầu đối với cột WB) và rửa giải zearalenon bằng cách\r\ncho 2,0 ml metanol (4.3) đi qua cột ở tốc độ khoảng 1 giọt mỗi giây, thu lấy\r\ndịch rửa giải vào trong ống nghiệm 5 ml (5.6).
\r\n\r\nCHÚ THÍCH: Có thể loại bỏ thủy tinh frit ra\r\nkhỏi bình hứng đã sử dụng bằng cách dùng que khuấy hoặc đũa khuấy cho qua đáy\r\ncủa bình hứng, bình hứng có thể được làm sạch và được dùng lại.
\r\n\r\n8.3.1.7 Làm bay hơi dung dịch rửa giải đến\r\nkhô, dùng bộ cô mẫu bằng nitơ với nhiệt độ nồi cách thủy 50 0C
8.3.1.8 Có thể lọc dung dịch thử qua bộ lọc\r\nPVDF (5.13), dùng xyranh bằng chất dẻo. Dãy dịch lọc phải được kiểm tra để xác\r\nnhận không có mặt các pic gây nhiễu. Với việc sử dụng thủy tinh frit (5.18) và\r\nbộ lọc trong bình hứng (5.17), dung dịch thử phải trong và không cần phải lọc.
\r\n\r\n8.3.2 Cột miễn nhiễm EASI-EXTRACT
8.3.2.1 Lọc nhiều hơn 10 ml dịch chiết qua\r\ngiấy lọc gấp nếp (5.5) vào bình nón 125 ml (5.4).
\r\n\r\n8.3.2.2 Dùng pipet (5.1.3) lấy 10 ml dịch\r\nchiết đã lọc cho vào trong bình định mức một vạch dung tích 50 ml (5.1.2) và\r\nthêm dung dịch đệm PBS (4.12) đến vạch. Trộn đều.
\r\n\r\n8.3.2.3 Lọc dịch chiết đã pha loãng (khoảng\r\n25 ml) qua giấy lọc vi sợi thủy tinh (5.9) vào ống ly tâm 50 ml (5.7).
\r\n\r\n8.3.2.4 Nối IAC vào ống hút chân không (5.3).\r\nLắp bình hứng (5.17) có thủy tinh frit lên đỉnh của cột, dùng ống nối. Gắn bộ\r\nlọc vi sợi thủy tinh (5.16). Rửa cột bằng 10 ml đến 20 ml dung dịch đệm PBS.
\r\n\r\nNếu dung dịch lọc (8.3.2.3) đã trong thì\r\nkhông cần thủy tinh frit hoặc bộ lọc.
\r\n\r\n8.3.2.5 Dùng pipet (5.1.3) lấy 10 ml dịch lọc\r\n(8.3.2.3) cho vào bình hứng. Rót dịch chiết qua cột với tốc độ dòng cố định cho\r\nđến khi không khí đi qua cột; tốc độ dòng phải tạo thành các giọt nhỏ (1 giọt\r\nđến 2 giọt mỗi giây).
\r\n\r\n8.3.2.6 Đối với các sản phẩm có chất nhuộm\r\nmàu và các mẫu có các pic gây nhiễu, rửa cột bằng 15 ml metanol 30 % thể tích\r\n(4.7) ở tốc độ 1 giọt đến 2 giọt mỗi giây cho đến khi không khí đi qua cột. Đối\r\nvới tất cả các loại mẫu khác thì rửa cột bằng 20 ml nước (4.1) ở tốc độ 1 giọt\r\nđến 2 giọt mỗi giây cho đến khi không khí đi qua cột.
\r\n\r\n8.3.2.7 Tháo bình hứng và rửa giải zearalenon\r\nbằng cách cho 2,0 ml axetonitril (4.2) đi qua cột ở tốc độ khoảng 1 giọt mỗi\r\ngiây, thu lấy dịch rửa giải vào trong ống nghiệm 5 ml (5.6).
\r\n\r\n8.3.2.8 Làm bay hơi dịch rửa giải đến khô,\r\ndùng bộ cô mẫu bằng nitơ với nhiệt độ nồi cách thủy 50 0C
8.3.2.9 Có thể lọc dung dịch thử qua bộ lọc\r\nPVDF (5.13), dùng xyranh bằng chất dẻo. Lô dịch lọc cần được kiểm tra để xác\r\nnhận không có mặt các pic gây nhiễu. Với việc sử dụng thủy tinh frit và bộ lọc\r\ntrong bình hứng dung dịch thử phải trong và không cần lọc.
\r\n\r\n\r\n\r\n8.4.1 Các điều kiện vận hành HPLC
\r\n\r\nPha động xem 4.14
\r\n\r\nTốc độ dòng 1,0 ml/min
\r\n\r\nThể tích bơm 100
Cột xem\r\n5.15.3, có cột bảo vệ C18
\r\n\r\nBước sóng detector Bước sóng kích\r\nthước: 274 nm
\r\n\r\nBước\r\nsóng phát xạ: 440 nm (đối với detector có bước sóng biến thiên)
\r\n\r\n418\r\nnm (đối với detetor có bộ lọc phát xạ)
\r\n\r\n8.4.2 Sự tương thích của hệ thống
\r\n\r\n8.4.2.1 Quá trình phân giải
\r\n\r\nBơm dung dịch chuẩn HPLC nồng độ 0,050
8.4.2.2 Hệ số không đối xứng
\r\n\r\nHệ số không đối xứng theo dược điển Hoa Kỳ,\r\ntương đương hệ số đối xứng theo dược điển châu Âu, F, phải nhỏ hơn 1,6.
\r\n\r\n8.4.3 Xác định
\r\n\r\n8.4.3.1 Bơm 100
8.4.3.2 Bơm 100
8.4.3.3 Nếu nồng độ khối lượng của zearalenon\r\ntrong mẫu thử vượt quá 3 mg/kg, để đảm bảo rằng IAC không bị quá tải, thì pha\r\nloãng dịch chiết (8.2) 10 lần bằng dung môi chiết (4.5), rồi lặp lại qui trình\r\nquy định trong 8.3.
\r\n\r\n8.4.3.4 Có thể khẳng định các mẫu dương tính\r\nnghi ngờ sử dụng bước sóng phát xạ 236 nm (quan sát được độ nhạy tăng lên) hoặc\r\ndùng detector mảng diot. Sử dụng bất kỳ kỹ thuật nào được nêu trong 8.4.3.4.1,\r\n8.4.3.4.2 hoặc 8.4.3.4.3.
\r\n\r\n8.4.3.4.1 Nếu dùng detector huỳnh quang có đèn\r\nderteri, thì sử dụng dung dịch thử 8.3.1.7 hoặc 8.3.2.8. Chỉnh dải detector\r\nhoặc tắt dần máy tích phân để thu được pic tương tự như trong 8.4.3.1. Sự đồng\r\nnhất của các pic được khẳng định nếu tỷ lệ diện tích pic của dung dịch chuẩn và\r\ndung dịch thử ở bước sóng 236 nm và 274 nm không đổi. Đối với diện tích pic của\r\ndung dịch chuẩn tương ứng, tỷ lệ diện tích pic của dung dịch mẫu thử phải trong\r\nphạm vi 5%.
\r\n\r\n8.4.3.4.2 Nếu dùng detector huỳnh quang có đèn\r\nflash xenon thì việc xác định tỷ lệ pic sử dụng sắc ký pha đảo có thể không khả\r\nthi, vì cường độ của đèn quá thấp ở 236 nm. Xác nhận lại nếu áp dụng 8.4.3.4.1\r\ncho detector này; còn nếu không thì sử dụng các điều kiện pha chuẩn (xem Phụ\r\nlục A) để khẳng định các mẫu nghi ngờ dương tính. Thực hiện lại 8.3 đối với mẫu\r\nthử và mẫu kiểm soát nhưng ở giai đoạn bay hơi (8.3.1.7 hoặc 8.3.2.8), thêm 2,0\r\nml hỗn hợp chloroform,hexan và propan-2-ol, tỷ lệ thể tích tương ứng là 50+50+3\r\n(A.1.2). Tiến hành theo Điều A.3, dùng cột silica LC (Điều A.2).
\r\n\r\n8.4.3.4.3 Nếu dùng detector mảng diot thì sử\r\ndụng dung dịch thử 8.3.1.7 hoặc 8.3.2.8. Ghi lại phổ (bước sóng từ 200 nm đến\r\n400 nm) của pic tại thời gian lưu zearalenon và so sánh với phổ của dung dịch\r\nchuẩn tương tự. Đối với mẫu và dung dịch chuẩn, phải quan sát được ba độ hấp\r\nthụ tối đa (236 nm, 274 nm và 316 nm) và cường độ tương đối phải như nhau. Bước\r\nsóng hấp thụ tối đa của mẫu phải trong phạm vi ± 2nm của bước sóng hấp thụ tối đa của chất chuẩn. Đối với\r\nphổ pic tương tự có giá trị giới hạn > 950 nằm ngoài 1 000 cũng khẳng định\r\nsự có mặt của zearalenon.
\r\n\r\nCHÚ THÍCH: Có thể detector mảng diot không đủ\r\nnhạy đối với các mức gần giới hạn của phép định lượng. Có thể cần thêm thời\r\ngian chạy, để tránh các pic rửa giải chậm và có thể cần điều chỉnh pha động\r\n(4.14) để thu được độ chọn lọc thích hợp vì các pic bổ sung có thể xuất hiện\r\ncùng với phép xác định UV.
\r\n\r\n\r\n\r\nTính phần khối lượng của mẫu zearalezone, ws,\r\nbằng miligam trên kilogam, dùng Công thức (1) hoặc Công thức (2):
\r\n\r\n (1)
(2)
Trong đó:
\r\n\r\nAt là diện tích pic của zearalenon\r\ntrong dung dịch thử;
\r\n\r\nAst là diện tích pic của\r\nzearalenon trong dung dịch chuẩn HPLC (trung bình của dãy chất chuẩn);
\r\n\r\nrst là nồng độ zearalenon trong dung dịch chuẩn HPLC, tính\r\nbằng microgam trên mililit (mg/ml);
\r\n\r\nm là khối lượng của phần mẫu thử, tính bằng\r\ngam (g);
\r\n\r\nV là thể tích của dịch lọc trong 8.3.1.4 hoặc\r\n8.3.2.5, tính bằng mililit (ml);
\r\n\r\nfd là hệ số pha loãng (bằng 1, trừ\r\nkhi thể tích cuối cùng khác 2 ml).
\r\n\r\nBáo cáo kết quả đến 3 chữ số có nghĩa.
\r\n\r\nVÍ DỤ
\r\n\r\nAt 65\r\n224
\r\n\r\nAst 72\r\n578
\r\n\r\nrst
m 50,10\r\ng
\r\n\r\nThể tích cuối cùng 2,0\r\nml
\r\n\r\nV (8.3.1.4) 10\r\nml
\r\n\r\nfd 1
\r\n\r\n10.1 Phép thử liên phòng thử nghiệm
\r\n\r\nCác giá trị độ lặp lại và độ tái lập thu được\r\ntừ kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm thực hiện năm 2005 được tiến hành\r\ntheo các Tài liệu tham khảo [6] và [7] (xem Phụ lục B). Việc kiểm tra xác nhận\r\nphòng thử nghiệm đơn lẻ cho thấy rằng phương pháp có thể áp dụng cho tất cả các\r\nloại thức ăn chăn nuôi và các loại hạt ngũ cốc, bột đậu tương, bột hạt của cây\r\ncó dầu (cây dải dầu), gluten ngô, các loại bã rượu khô, đậu lăng và củ cải\r\nđường.
\r\n\r\n10.2 Độ lặp lại
\r\n\r\nChênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả của hai\r\nphép thử nghiệm độc lập, riêng lẻ, được biểu thị theo phần trăm giá trị trung\r\nbình xác định được, thu được khi sử dụng cùng phương pháp trên vật liệu thử\r\ngiống hệt nhau, trong một phòng thử nghiệm, do một người thực hiện, sử dụng\r\ncùng thiết bị, trong một khoảng thời gian ngắn, không được quá 5 % các trường\r\nhợp vượt quá giới hạn lặp lại tương đối, rrel, được tính bằng Công\r\nthức (4):
\r\n\r\n (4)
trong đó CV(r) là hệ số biến thiên lặp lại.
\r\n\r\n10.3 Độ tái lập
\r\n\r\nChênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử\r\nriêng lẽ, được biểu thị theo phần trăm giá trị trung bình xác định được, thu\r\nđược khi sử dụng cùng phương pháp, trên vật liệu giống thử giống hệt nhau,\r\ntrong các phòng thử nghiệm khác nhau, do những người khác nhau thực hiện, sử\r\ndụng các thiết bị khác nhau, không vượt quá 5% các trường hợp vượt quá giá trị\r\ngiới hạn tái lập tương đối, Rrel, được tính bằng công thức (5):
\r\n\r\nTrong đó CV(R) là hệ số biến thiên tái lập.
\r\n\r\nTiêu chí về độ lặp lại và độ tái lặp được lấy\r\ntừ Bảng B.2 cho trong Bảng 2.
\r\n\r\n| \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n CV(r), tối đa \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n CV(r), giá trị trung bìnha \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n rrel, tối đa \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n rrel, trung bìnha \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n CV(R), tối đa \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n CV (R), giá trị trung bình a \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Rrel, tối đa \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Rrel, trung bìnha \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n a Được xác định bằng phép phân tích phương\r\n sai. Các nghiên cứu cho thấy rằng độ biến thiên của phép phân tích phụ thuộc\r\n vào nồng độ của chất nền và nồng độ của zearalenon. \r\n | \r\n |
10.4 Giới hạn của phép định lượng
\r\n\r\nGiới hạn của phép định lượng là 0,05 mg/kg\r\n(50 m
Báo cáo thử nghiệm phải nêu rõ:
\r\n\r\na) thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về\r\nmẫu;
\r\n\r\nb) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;
\r\n\r\nc) phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu\r\nchuẩn này;
\r\n\r\nd) mọi chi tiết thao tác không quy định trong\r\ntiêu chuẩn này hoặc tùy chọn cũng như các sự cố bất kỳ có thể ảnh hưởng đến kết\r\nquả thử nghiệm;
\r\n\r\ne) kết quả thử nghiệm thu được và nếu kiểm\r\ntra độ lặp lại thì nêu kết quả cuối cùng thu được.
\r\n\r\nA.1 Thuốc thử
\r\n\r\nA.1.1 Pha động HPLC
\r\n\r\nChuẩn bị bằng cách bổ sung các thể tích của\r\ndiclorometan, hexan, propan-2-ol và axit axetic với tỷ lệ tương ứng\r\n485+484+50+1 rồi trộn đềm
\r\n\r\nA.1.2 Dung môi dùng cho các chất chuẩn HPLC
\r\n\r\nChuẩn bị bằng cách bổ sung các thể tích của\r\ncloroform, hexan và propan-2-ol với tỷ lệ tương ứng 50+50+3 rồi trộn đều.
\r\n\r\nA.1.3 Các dung dịch chuẩn HPLC để khẳng định
\r\n\r\nChuẩn bị năm dung dịch chuẩn zearalenon có\r\nnồng độ nêu trong Bảng A.1 bằng cách pha loãng dung dịch thêm chuẩn (4.16) hoặc\r\ndung dịch chuẩn (A.1.3.1) với dung môi (A.1.2).
\r\n\r\n| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
Bảo quản tất cả các chất chuẩn HPLC trong tủ\r\nlạnh. Chuẩn bị chất chuẩn mới sáu tháng một lần.
\r\n\r\nA.2 Cột
\r\n\r\nNgoài thiết bị HPLC được quy định trong 5.15,\r\nthì dùng cột Zorbax SIL
A.3 Phân tích HPLC
\r\n\r\nA.3.1 Các điều kiện vận hành HPLC
\r\n\r\nPha động xem\r\nA.1.1
\r\n\r\nTốc độ dòng 1,0\r\nml/min
\r\n\r\nThể tích bơm 100\r\nm
Cột bảo vệ silica
\r\n\r\nBước sóng của detector (dùng cho detector của\r\nmáy đơn sắc đôi)
\r\n\r\nbước sóng kích thích 236 nm
\r\n\r\nbước sóng phát xạ 440 nm
\r\n\r\nA.3.2 Sự phù hợp của hệ thống
\r\n\r\nBơm 100 ml\r\ndung dịch chuẩn 0,050 m
Bơm hai lần hoặc nhiều hơn dung dịch chuẩn để\r\nđảm bảo độ lặp lại của diện tích pic là ~2%.
\r\n\r\nXác định độ tuyến tính bằng cách bơm 100
A.3.3 Xác định
\r\n\r\nBơm 100 ml\r\ndung dịch thử nghiệm (đã pha loãng theo nồng độ được xác định bằng pha đảo, nếu\r\ncần). So sánh mỗi lần bơm hai dung dịch thử nghiệm với lần bơm 100
Sự đồng nhất của các pic được khẳng định nếu\r\ntỷ lệ diện tích pic của dung dịch chuẩn và dung dịch thử ở bước sóng 236 nm và\r\n274 nm không đổi. Đối với diện tích pic của dung dịch chuẩn tương ứng, thì tỷ\r\nlệ diện tích pic của dung mẫu thử phải trong phạm vi 5 %.
\r\n\r\nB.1 Cách tiến hành và các mẫu
\r\n\r\nMột phép thử liên phòng thử nghiệm đã được tổ\r\nchức thực hiện theo Tài liệu tham khảo [6] và [7], trong đó chín vật liệu được\r\nchọn làm mẫu thử. Mỗi vật liệu từ 2,5 kg đến 5 kg đã được nghiền, dùng máy\r\nnghiền Retsch SR3
Tổng số 20 phòng thử nghiệm từ 13 nước châu\r\nÂu, Canada, Mỹ, Nhật và Uruguay được mời tham gia vào phép thử liên phòng thử\r\nnghiệm. Việc nghiên cứu đã được tiến hành trong hai giai đoạn: một giai đoạn\r\nnghiên cứu phổ biến gồm có phép phân tích, phép khẳng định mẫu thêm chuẩn và\r\nhai mẫu bị nhiễm và một giai đoạn nghiên cứu cộng tác gồm có phép phân tích mẫu\r\nkép mù. Tổng số 13 phòng thử nghiệm đã được chọn cho nghiên cứu cộng tác trên\r\ncơ sở các kết quả từ phép nghiên cứu phổ biến. Trong tổng số 20 mẫu phòng thử\r\nnghiệm đã được cung cấp thì chín mẫu trong Bảng B.1 là mẫu mù hai lần, một mẫu\r\nngô trắng mù và một mẫu bột mì trắng mù. Mẫu bột mì trắng được cung cấp để\r\nchuẩn bị mẫu kiểm soát. Tất cả các phòng thử nghiệm đã gửi trả lại dữ liệu có\r\nthể chấp nhận được trong khoảng thời gian được yêu cầu. Hai phòng thử nghiệm đã\r\ncó kinh nghiệm về các pic nhiễu trong sắc đồ, nhận biết các chất nhiễm bẩn.\r\nKhông thể nhận biết được nguồn gây nhiễu, nhưng sự thay đổi pha động hoặc sự thay\r\nđổi cột HPLC được đề cập trong báo cáo kết quả. Vì vậy một số dữ liệu từ các\r\nphòng thử nghiệm này đã bị loại bỏ trong đánh giá thống kê. Đối với tất cả các\r\nphòng thử nghiệm, hai mẫu trắng được báo cáo là "không phát hiện được\r\nzearalenon" hoặc ở mức vết (<0,01 mg/kg). Đối với hai mẫu kiểm soát bột\r\nmì thêm chuẩn (89 % đến 116 % khối lượng), tất cả các phòng thử nghiệm đã báo\r\nvề độ thu hồi có thể chấp nhận được (độ thu hồi trung bình 102,6%; Srel,\r\n6,88 %).
\r\n\r\n| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n ||
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n ||
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n ||
| \r\n 1. Lúa mạch \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n 2. Lúa mạch \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n 3. Ngô \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n 4. Ngô \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n 5. Ngô \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n 6. Thức ăn ngô \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n 7. Bã rượu khô \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n 8. Thức ăn cho lợn \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n 9. Bột mì \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
B.2 Phân tích thống kê các kết quả
\r\n\r\nCác kết quả của phép phân tích mẫu kép mù đã\r\nđược kiểm tra về dấu hiệu lỗi hệ thống riêng rẽ bằng quy trình mô tả trong Tài\r\nliệu tham khảo [6] và [7], dùng phép thử tịnh tiến Cochran và Grubbs, sử dụng\r\nchương trình thống kê AOAC năm 2001 đối với Bảng tính phân tích lặp lại mẫu mù.\r\nPhép tính về độ lặp lại, r, và độ tái lập R được tiến hành sau khi loại trừ\r\nngoại lệ như đã xác định theo các hướng dẫn. Các giá trị HorRat, tỷ lệ của hệ\r\nsố biến thiên về độ tái lập với hệ số của độ biến thiên tái lập được dự đoán,\r\nđã được tính toán. Các giá trị HorRat từ 0,5 đến 1,5 là các giới hạn chấp nhận\r\nđược (Tài liệu tham khảo [6] và [7]). Dữ liệu tính được về hiệu năng của phương\r\npháp (độ lặp lại, độ tái lập, các giá trị HorRat) được nêu trong Bảng B.2.
\r\n\r\n| \r\n | \r\n \r\n | \r\n ||||||||
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n |
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n |
| \r\n Số lượng các phòng thử nghiệm được giữ lại\r\n sau khi trừ ngoại lệ \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Phần khối lượng zearalenon đích, | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Phần khối lượng zearalenon trung bình, | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Độ lệch chuẩn lặp lại, sr, | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Hệ số biến thiên lặp lại, CV(r), % \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Giới hạn lặp lại, r, | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Giới hạn lặp lại tương đối, rrel\r\n của hàm lượng trung bình đã xác định được, % \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Độ lệch chuẩn tái lập, sR, | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Hệ số biến thiên tái lập, CV(R), % \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Giới hạn tái lập, R, | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Giới hạn tái lập tương đối của hàm lượng đã\r\n xác định được, Rrel, % \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Giá trị HorRat \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
[1] TCVN 4325:2007 (ISO 6497:2002), Thức ăn\r\nchăn nuôi - Lấy mẫu.
\r\n\r\n[2] JOSEPHS, R.D., KRSKA, R., MACDONAL, S.,\r\nWILON, P., PETTERSSON. H, preparation of a caliabarant as certified reference\r\nmaterial for determination of the Fusarium mycotoxin zearaloeone j. AOAC int\r\n2003, 86, p. 50-60.
\r\n\r\n[3] VICAM, Zearala TestTM Instruction manual, p. 31,\r\np.34. Vicam watertown, MA, 1998
\r\n\r\n[4] KRUGER, S.C., KOHN, B., RAMSEY.CS., PRIOLI, RA. Rapid\r\nimmunoaffinity-based method for the determination of zearaleone in corn by\r\nfluorometry and liquid chromatography . J. AOAC int. 1999, 82, p. 1964-1368
\r\n\r\n[5] R-BIOPHARM RHONE, EASI-EXTRACT ® ZEARALEONE\r\ninstructions for use (supplied with the immunoaffinity columns). R-Biopharm\r\nRhone Ltd. Glasgow, 2003.
\r\n\r\n[6] FAZEKAS, B. TAR, A. Determination of zearaleone content in\r\ncereals and feedstuff by immunoaffinity column couples with chromatography.,\r\nJ. AOAC int. 2001, 84, p. 1453-1459.
\r\n\r\n[7] AOAC. Collaborative study guidelien. J..AOAC Int., 1995, 78, p\r\n143A-160A.
\r\n\r\n[8] AOAC, Apendix D: Guideline for collaborative study procedure to\r\nvalidate characteristics of a method of analysis. In: Offcial methods analaysis\r\nof AOAC international, 17 th edition. Association of Official analyutical\r\nchemists. Gaitherburg, MD, 2000 12 p Available (2008-01014) at: http://www.aoac.org/vmeth/manual_part_6.pdf
\r\n\r\n\r\n\r\n
\r\n\r\n
File gốc của Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 9591:2013 (ISO 17372:2008) về Thức ăn chăn nuôi – Xác định zearalenon bằng sắc ký cột miễn nhiễm và sắc ký lỏng hiệu năng cao đang được cập nhật.
Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 9591:2013 (ISO 17372:2008) về Thức ăn chăn nuôi – Xác định zearalenon bằng sắc ký cột miễn nhiễm và sắc ký lỏng hiệu năng cao
Tóm tắt
| Cơ quan ban hành | Đã xác định |
| Số hiệu | TCVN9591:2013 |
| Loại văn bản | Tiêu chuẩn Việt Nam |
| Người ký | Đã xác định |
| Ngày ban hành | 2013-01-01 |
| Ngày hiệu lực | |
| Lĩnh vực | Nông nghiệp |
| Tình trạng | Còn hiệu lực |