Animal\r\nfeeding stuffs - Enzymatic determination of total starch content
\r\n\r\nLời nói đầu
\r\n\r\nTCVN 9587:2013 hoàn toàn tương\r\nđương với ISO 15914:2004;
\r\n\r\nTCVN 9587:2013 do Cục Chăn nuôi\r\nbiên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn\r\nĐo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.
\r\n\r\n\r\n\r\n
THỨC\r\nĂN CHĂN NUÔI - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG TINH BỘT BẰNG PHƯƠNG PHÁP ENZYM
\r\n\r\nAnimal\r\nfeeding stuffs - Enzymatic determination of total starch content
\r\n\r\n\r\n\r\nTiêu chuẩn này quy định phương pháp\r\nenzym để xác định hàm lượng tinh bột tổng số trong thức ăn chăn nuôi và nguyên\r\nliệu thức ăn chăn nuôi.
\r\n\r\nPhương pháp này có thể áp dụng để\r\nxác định độ tinh khiết của tinh bột.
\r\n\r\nĐối với phương pháp này, quan trọng\r\nlà nền mẫu không được chứa các thành phần gây triệt tiêu kết quả đo được ở bước\r\nsóng 340 nm.
\r\n\r\nPhương pháp này có thể áp dụng để\r\nphân tích hàm lượng tinh bột nằm trong dải từ 40 g/kg đến 1 000 g/kg. Tiêu\r\nchuẩn này có thể áp dụng tốt nhất cho hàm lượng tinh bột trong dải từ 200 g/kg\r\nđến 1000 g/kg. Đối với hàm lượng tinh bột trong dải từ 40 g/kg đến 200 g/kg thì\r\ncó thể áp dụng quy trình pha loãng khác đối với dung dịch glucoza chuẩn và mẫu\r\nthử.
\r\n\r\n\r\n\r\nCác tài liệu viện dẫn sau rất cần\r\nthiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm\r\ncông bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi\r\nnăm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung\r\n(nếu có).
\r\n\r\nTCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987) Nước\r\ndùng để phân tích trong phòng thí nghiệm - Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử.
\r\n\r\nTCVN 6952:2001 (ISO 6498:1998) Thức\r\năn chăn nuôi - Chuẩn bị mẫu thử.
\r\n\r\n\r\n\r\nTrong tiêu chuẩn này sử dụng các\r\nthuật ngữ và định nghĩa sau đây:
\r\n\r\n3.1. Tinh bột (starch)
\r\n\r\nCác polyme thực vật tự nhiên gồm có\r\ncác mạch thẳng dài của 1,4-a-D-glucoza\r\n(amyloza) và/hoặc các mạch nhánh a-1,6\r\ncủa liên kết a-1,4-glucoza\r\n(amylopectin).
\r\n\r\n3.2. Hàm lượng tinh bột (starch\r\ncontent)
\r\n\r\nPhần khối lượng tinh bột và các sản\r\nphẩm của tinh bột có khối lượng phân tử cao, không tan trong etanol 40 % và xác\r\nđịnh được bằng phương pháp quy định trong tiêu chuẩn này.
\r\n\r\nCHÚ THÍCH: Hàm lượng tinh bột được\r\nbiểu thị bằng gam trên kilogam.
\r\n\r\n\r\n\r\nMẫu thử đã nghiền được chiết bằng\r\netanol 40 % để loại bỏ các loại đường hòa tan. Hòa phần mẫu thử chiết được\r\ntrong dung dịch DMSO (90 % thể tích) ở 100 oC, sau đó thêm axit\r\nclohydric đậm đặc ở 60 oC để phân hủy mẫu và hòa tan tinh bột. Tinh\r\nbột hòa tan được chuyển thành glucoza bởi enzym amyloglucosidaza. Tiến hành\r\nđịnh lượng glucoza bằng phương pháp hexokinaza đã biết (xem [1], [2]).
\r\n\r\n\r\n\r\nChỉ sử dụng các thuốc thử đạt chất\r\nlượng tinh khiết phân tích.
\r\n\r\n5.1. Nước, phù hợp với loại\r\n3 quy định trong TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987).
\r\n\r\n5.2. Etanol (C2H5OH),\r\n40 % (thể tích)
\r\n\r\nLấy 417 ml etanol (96 % thể tích)\r\nvà pha loãng bằng nước đến 1 000 ml.
\r\n\r\n5.3. Axit clohydric, c(HCl)\r\n= 12 mol/l.
\r\n\r\n5.4. Natri hydroxit loãng, c(NaOH)\r\n= 4 mol/l.
\r\n\r\nHòa tan 40 g NaOH trong khoảng 50\r\nml nước trong cốc có mỏ. Sau khi nguội, chuyển định lượng sang bình định mức\r\n250 ml và pha loãng bằng nước đến vạch.
\r\n\r\nCẢNH BÁO - Thao tác này sẽ sinh\r\nnhiệt, do đó cần đeo kính an toàn.
\r\n\r\n5.5. Dung dịch axit axetic, c(CH3COOH)\r\n= 2 mol/l.
\r\n\r\nCho khoảng 200 ml nước vào bình\r\nđịnh mức 500 ml, sau đó thêm 59 ml axit axetic băng. Pha loãng bằng nước đến\r\nvạch.
\r\n\r\n5.6. Dung dịch natri axetat, c(CH3COONa)\r\n= 2 mol/l.
\r\n\r\nHòa tan 82,0 g natri axetat trong\r\nnước đựng trong bình định mức 500 ml và pha loãng bằng nước đến vạch.
\r\n\r\n5.7. Dung dịch đệm natri axetat,\r\nc(CH3COONa/H) = 2 mol/l, pH = 4,8.
\r\n\r\nTrộn 41 ml dung dịch axit axetic\r\n(5.5) với 59 ml dung dịch natri axetat (5.6). Kiểm tra pH bằng máy đo pH và\r\nchỉnh để thu được pH quy định bằng dung dịch natri axetat hoặc axit axetic, nếu\r\ncần.
\r\n\r\nChuẩn bị dung dịch đệm mới trong\r\nngày sử dụng.
\r\n\r\n5.8. Dung dịch dimethylsulfoxid,\r\n(sDMSO) = 90 % (thể\r\ntích).
\r\n\r\nTrộn DMSO tinh khiết với nước theo\r\ntỷ lệ thể tích 9:1.
\r\n\r\n5.9. Các dung dịch làm trong,\r\ntheo Carrez, được chuẩn bị như sau:
\r\n\r\n5.9.1. Dung dịch kali\r\nhexaxyanoferrat(II), c[K4Fe(CN)6] = 0,25\r\nmol/l.
\r\n\r\nHòa tan 106 g kali\r\nhexaxyanoferrat(II) ngậm ba phân tử nước [K4Fe(CN)6
5.9.2. Dung dịch kẽm axetat\r\ntrong axit axetic 0,5 mol/l, c[Zn(CH3CO2)2
5.10. Dung dịch iot trong kali\r\niodua
\r\n\r\nHòa tan 12,7 g iot (I2)\r\nvà 24,0 g kali iodua (KI) trong nước đựng trong bình định mức 1 lít. Pha loãng\r\nbằng nước đến vạch. Pha loãng dung dịch này 10 lần trước khi sử dụng.
\r\n\r\n5.11. Dung dịch chuẩn glucoza
\r\n\r\n5.11.1. Mẫu chứa tinh bột từ 200\r\ng/kg đến 1 000 g/kg
\r\n\r\nChuẩn bị ba dung dịch chuẩn glucoza\r\nriêng rẽ (c = 0,0194 mol/l). Hòa tan 350 mg glucoza (C6H12O6)\r\nkhan, được cân chính xác đến miligam, trong nước đựng trong các bình định mức\r\n100 ml riêng rẽ. Pha loãng bằng nước đến vạch.
\r\n\r\n5.11.2. Mẫu chứa tinh bột từ 40\r\ng/kg đến 200 g/kg
\r\n\r\nChuẩn bị ba dung dịch glucoza chuẩn\r\nđộc lập (c = 0,0039 mol/l). Hòa tan 350 mg ± 1 mg glucoza (C6H12O6) khan,\r\ntrong nước đựng trong bình định mức 500 ml riêng rẽ. Pha loãng bằng nước đến\r\nvạch.
\r\n\r\nChuẩn bị các dung dịch glucoza\r\nchuẩn mới trong ngày sử dụng.
\r\n\r\n5.12. Dung dịch\r\namyloglucosidaza, AMG 160 U/ml.
\r\n\r\nHòa tan 267 mg amyloglucosidaza\r\n(AMG) [EC 3.2.1.3 (Aspergillus niger; Roche Diagnostics, No. 1 202 367,6\r\nU/mg]
Khi sử dụng loại enzym khác, cần\r\nđánh giá hoạt tính của enzym theo chú thích 1. Khối lượng enzym cần tương thích\r\nvới hoạt độ đánh giá được.
\r\n\r\nCHÚ THÍCH 1: Các nhà cung cấp enzym\r\nkhác nhau sử dụng các định nghĩa khác nhau về đơn vị hoạt tính của enzym. Trong\r\ntiêu chuẩn này, định nghĩa về hoạt tính đối với AMG được sử dụng là: 1 đơn vị\r\namyloglucosidaza sẽ giải phóng 1 mmol\r\nglucoza trong 1 min ở 25 oC và pH = 4,75 từ glycogen.
\r\n\r\nCHÚ THÍCH 2: 10 ml dung dịch enzym\r\nlà đủ dùng cho khoảng 75 phép xác định.
\r\n\r\n5.13. Bộ thử D-glucoza UV, để\r\nđịnh lượng enzym glucoza, dùng phương pháp hexokinaza (R-Biopharm, No. 716251
5.13.1. Dung dịch đệm/cơ chất\r\n(Chai 1)
\r\n\r\nHòa tan lượng chứa trong Chai 1\r\nbằng 45 ml nước vừa mới được chưng cất. Bảo quản dung dịch này ở nơi mát (4 oC)\r\nvà tối không quá 4 tuần. Sử dụng một lượng cần thiết của dung dịch này ở nhiệt\r\nđộ môi trường.
\r\n\r\n5.13.2. Dung dịch enzym (Chai 2)
\r\n\r\nDung dịch này đã chuẩn bị sẵn để sử\r\ndụng.
\r\n\r\n5.13.3. Dung dịch tạo màu
\r\n\r\nTrộn 22,5 ml dung dịch đệm/co chất\r\n(5.13.1) với 95 ml nước và 0,45 ml dung dịch enzym (5.13.2) rồi đồng hóa. Lượng\r\nthuốc thử này đủ cho một dãy khoảng 40 lần đo. Nếu cần thực hiện số lần đo\r\nnhiều hơn hoặc ít hơn thì trộn các thể tích tương ứng.
\r\n\r\nChỉ sử dụng các dung dịch tạo màu\r\nmới được chuẩn bị ở nhiệt độ phòng.
\r\n\r\n\r\n\r\nSử dụng các thiết bị, dụng cụ của\r\nphòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:
\r\n\r\n6.1. Cân phân tích, có thể\r\ncân chính xác đến 0,1 mg.
\r\n\r\n6.2. Máy ly tâm, có gia tốc\r\n(180 ± 10) g và 3 000 g,\r\nthích hợp để dùng cho các ống nghiệm 12 ml có nắp vặn (gia tốc g được\r\nghi ở đáy của ống nghiệm).
\r\n\r\n6.3. Nồi cách thủy, có thể\r\nđiều chỉnh đến nhiệt độ (100 ± 2) oC.
\r\n\r\n6.4. Nồi cách thủy, có thể\r\nđiều chỉnh đến nhiệt độ (60 ± 1) oC.
\r\n\r\n6.5. Máy đo pH, đã được hiệu\r\nchuẩn, có điện cực thủy tinh phức hợp, có thể đo được pH chính xác đến 0,01 đơn\r\nvị pH.
\r\n\r\n6.6. Pipet microlit, đã được\r\nhiệu chuẩn và có thể điều chỉnh được từ 40 ml\r\nđến 200 ml, từ 200
6.7. Máy đo phổ, có cuvet\r\ndòng chảy, có thể đo được ở bước sóng 340 nm.
\r\n\r\n6.8. Máy lắc quay, tốc độ 50\r\nr/min, dùng cho các ống ly tâm có nắp vặn kín (6.11).
\r\n\r\n6.9. Bộ phân phối/bộ pha loãng (Ví\r\ndụ: Hook & Tucker Compudil D
6.10. Tủ ấm, có lưu thông\r\nkhông khí cưỡng bức.
\r\n\r\n6.11. Ống ly tâm, kích thước\r\n100 mm x 16 mm, bằng thủy tinh, có nắp vặn được làm kín bằng cao su PTFE.
\r\n\r\n6.12. Bình đong, dung tích\r\n100 ml, cổ rộng, có khớp nối thủy tinh mài 14/23.
\r\n\r\nBình này phải cho phép đo được pH\r\nbên trong bình bằng điện cực thủy tinh kết hợp.
\r\n\r\n6.13. Máy trộn dạng ống, (ví\r\ndụ: máy trộn Vortex3)), đối với phương pháp thay thế để phân hủy và\r\nhòa tan tinh bột được mô tả trong 8.4.2. Cũng cần đến các dụng cụ sau đây.
\r\n\r\n6.14. Bể lắc điều nhiệt, có\r\nthể điều chỉnh đến nhiệt độ ở (100 ± 2)\r\noC, với dao động 2 cm và tần suất lắc từ 150 đến 200 lần lắc trên\r\nphút. Bể lắc cần được trang bị giá đỡ các ống nghiệm thẳng đứng trong nước.
\r\n\r\n6.15. Ống ly tâm, bằng thủy\r\ntinh, dung tích nhỏ nhất là 20 ml, có nắp vặn được làm kín bằng cao su PTFE.
\r\n\r\n6.16. Bi thủy tinh, đường\r\nkính 3 mm.
\r\n\r\n\r\n\r\nChuẩn bị mẫu thử theo TCVN 6952\r\n(ISO 6498).
\r\n\r\n\r\n\r\n8.1. Phần mẫu thử
\r\n\r\nTiến hành hai phép xác định song\r\nsong.
\r\n\r\nCân khoảng 200 mg mẫu thử (Điều 7),\r\nchính xác đến 0,1 mg, cho vào ống ly tâm (6.11). Cân khoảng 200 mg khác của mẫu\r\nđã xử lý (Điều 7), chính xác đến 0,1 mg cho vào ống ly tâm thứ hai.
\r\n\r\nLặp lại quy trình đối với mỗi ống\r\nly tâm.
\r\n\r\n8.2. Tách chiết đường
\r\n\r\nCho vào mỗi ống ly tâm 10 ml etanol\r\n(5.2). Chiết đường hòa tan bằng cách quay liên tục huyền phù trong 10 min trong\r\nmáy lắc quay (6.8). Sau đó ly tâm 10 min trong máy ly tâm (6.2) với gia tốc\r\nhướng tâm (180 ± 10) g và loại\r\nbỏ phần nổi phía trên. Lặp lại quy trình chiết này một lần nữa.
\r\n\r\n8.3. Mẫu trắng
\r\n\r\nTừ giai đoạn này của quy trình, đối\r\nvới mỗi mẻ phân tích phải phân tích một mẫu trắng. Sử dụng một ống ly tâm rỗng\r\nđựng mẫu trắng.
\r\n\r\n8.4. Hòa tan tinh bột
\r\n\r\n8.4.1. Yêu cầu chung
\r\n\r\nHòa tan tinh bột có thể được thực\r\nhiện theo 8.4.2 hoặc theo 8.4.3. Khi sử dụng quy trình thay thế (xem 8.4.3) thì\r\nphải sử dụng các ống ly tâm lớn hơn đựng thuốc thử bằng thủy tinh có nắp vặn\r\n(6.15).
\r\n\r\n8.4.2. Cách I
\r\n\r\nCho 10,0 ml dung dịch DMSO (5.8)\r\nvào ống ly tâm bằng bộ phân phối, trong khi vẫn khuấy trộn liên tục trên máy\r\ntrộn vortex (6.13) và trộn cho đến khi thu được huyền phù không còn vón cục.\r\nĐậy nắp ống nghiệm.
\r\n\r\nCHÚ THÍCH: Cần khuấy trộn mạnh\r\ntrong khi thêm DMSO để tránh tạo thành microgel và/hoặc cục vón. Microgel và\r\ncục vón sẽ dẫn đến kết quả của hàm lượng tinh bột thu được không chính xác.
\r\n\r\n- do microgel và cục vón làm cho\r\ndung dịch mẫu không đồng nhất.
\r\n\r\n- microgel và cục vón sẽ không được\r\nAMG thủy phân hoàn toàn glucoza, nên hàm lượng tinh bột xác định được là không\r\nchính xác (phần lớn là quá thấp).
\r\n\r\nNgay sau khi đồng hóa xong, đặt ống\r\nly tâm vào máy lắc quay (6.8) và phân hủy tinh bột trong khi quay liên tục 30\r\nmin trong tủ ấm (6.10) ở 100 oC. Làm nguội ống ly tâm và dùng pipet\r\n(6.6) để thêm 1,7 ml axit clohydric đậm đặc (5.3) và trộn kỹ. Đậy nắp ống và\r\nđặt vào bộ lắc quay. Thủy phân mẫu từng phần bằng cách đặt ống vào tủ (6.10) 30\r\nmin ở 60 oC trong khi vẫn khuấy liên tục.
\r\n\r\nTiến hành tiếp theo 8.4.4.
\r\n\r\n8.4.3. Cách II
\r\n\r\nCho 15 viên bi thủy tinh (6.16) vào\r\nphần còn lại trong ống ly tâm bằng thủy tinh (6.15). Dùng bộ phận phối/bộ pha\r\nloãng thêm 10,0 ml dung dịch DMSO (5.8) vào ống ly tâm, trong khi vẫn khuấy\r\ntrộn liên tục trên máy trộn vortex (6.13) và trộn cho đến khi thu được huyền\r\nphù không còn vón cục. Vặn nắp ống ly tâm.
\r\n\r\nCHÚ THÍCH: Cần khuấy trộn mạnh\r\ntrong khi thêm DMSO để tránh tạo thành microgel và/hoặc cục vón. Microgel và\r\ncục vón sẽ dẫn đến kết quả của hàm lượng tinh bột thu được không chính xác.
\r\n\r\n- do microgel và cục vón làm cho\r\ndung dịch mẫu không đồng nhất, và
\r\n\r\n- microgel và cục vón sẽ không thủy\r\nphân hoàn toàn AMG thành glucoza, nên hàm lượng tinh bột xác định được là không\r\nchính xác (phần lớn là quá thấp).
\r\n\r\nĐặt ống nghiệm thẳng đứng vào giá\r\nđựng của bể lắc điều nhiệt (6.14) và lắc 30 min trong nước đang sôi. Làm nguội\r\nống nghiệm và dùng pipet có thể điều chỉnh được (6.6) để thêm 1,7 ml axit\r\nclohydric đậm đặc (5.3) và trộn kỹ. Đậy nắp ống và đặt ống ly tâm vào nồi cách\r\nthủy được điều chỉnh ở nhiệt độ (60 ±\r\n1) oC. Thủy phân mẫu từng phần bằng cách lắc ống nghiệm 30 min trong\r\nnồi cách thủy được điều chỉnh ở nhiệt độ (60 ±\r\n1) oC.
\r\n\r\nTiến hành tiếp theo 8.4.4.
\r\n\r\n8.4.4. Chỉnh pH
\r\n\r\nLàm nguội ống ly tâm và chuyển định\r\nlượng lượng chứa sang bình định mức 100 ml (6.12). Thêm 5,0 ml dung dịch natri\r\nhydroxit (5.4) và 2,5 ml dung dịch đệm natri axetat (5.7) rồi đồng hóa dung\r\ndịch. Dùng máy đo pH (6.5) để đo độ pH của dung dịch. Chỉnh pH đến 4,8
8.5. Chuyển tinh bột thành\r\nglucoza bằng phương pháp enzym
\r\n\r\nDùng pipet điều chỉnh được lấy\r\n(ngay sau khi đồng hóa kỹ) 5,00 ml (= V1 ở phép tính trong\r\n9.2) dung dịch đồng nhất của tinh bột đã hòa tan và phân hủy một phần (8.4.4)\r\ncho vào ống nghiệm thủy tinh sạch và khô (6.11). Dùng pipet (6.6) thêm 0,125 ml\r\nenzym AMG (5.12). Đậy nắp ống rồi đồng hóa kỹ. Làm ấm dung dịch trong nồi cách\r\nthủy ở 60 oC qua đêm, ít nhất 16 h. Làm bất hoạt AMG bằng cách đặt\r\nống nghiệm trong nước sôi 15 min. Làm nguội ống đến nhiệt độ môi trường rồi\r\ndùng pipet thêm 0,125 ml dung dịch kali hexaxyanoferrat(II) (5.9.1) và lắc\r\ntrong 1 min. Dùng pipet thêm tiếp 0,125 ml dung dịch kẽm axetat (5.9.2) và lắc\r\nlại 1 min. Ống nghiệm này chứa 5,375 ml dung dịch (= V2 ở\r\nphép tính trong 9.2). Sau đó ly tâm 10 min với gia tốc hướng tâm nhỏ nhất là 3\r\n000 g. Chuyển phần nổi phía trên sang ống nghiệm khô và sạch.
\r\n\r\nKiểm tra sự có mặt của tinh bột\r\nbằng cách thêm vài mililit nước vào ống ly tâm, đun sôi trong 10 min, làm nguội\r\nvà thêm 0,2 ml dung dịch iot (5.10). Dung dịch có màu xanh cho thấy vẫn còn\r\ntinh bột và do đó quá trình chuyển đổi chưa kết thúc. Cần loại bỏ dung dịch\r\nchứa phần mẫu thử và bắt đầu lại phép phân tích mẫu (xem 8.1).
\r\n\r\n8.6. Xác định hàm lượng glucoza\r\nbằng enzym
\r\n\r\n8.6.1. Mẫu chứa từ 200 g/kg đến\r\n1 000 g/kg tinh bột
\r\n\r\nDùng bộ phân phối/bộ pha loãng\r\n(6.9) để pha loãng 0,5 ml phần nổi phía trên của các dung dịch tinh bột đã thủy\r\nphân (8.5), mẫu trắng (8.3), ba dung dịch chuẩn glucoza (5.11) và mẫu trắng là\r\nnước (5.1) tương ứng với 9,5 ml nước (5.1) và đồng hóa.
\r\n\r\n8.6.2. Mẫu chứa từ 40 g/kg đến\r\n200 g/kg tinh bột
\r\n\r\nDùng bộ phân phối/bộ pha loãng\r\n(6.9) để pha loãng 0,5 ml phần nổi phía trên của các dung dịch tinh bột đã thủy\r\nphân (8.5), mẫu trắng (8.3), ba dung dịch chuẩn glucoza (5.11) và mẫu trắng là\r\nnước (5.1) với 1,5 ml nước (5.1) và đồng hóa.
\r\n\r\nNếu hàm lượng tinh bột dự kiến thấp\r\n(nhỏ hơn 200 g/kg), thì nên tăng độ nhạy của phép xác định bằng cách sử dụng\r\nmột tỷ lệ pha loãng khác đối với phép chuyển đổi tinh bột thành glucoza bằng\r\nenzym. Nên sử dụng cùng tỷ lệ pha loãng đối với dung dịch mẫu trắng. Nên chuẩn\r\nbị các dung dịch glucoza chuẩn ở mức nồng độ thấp hơn có thể so sánh được và để\r\npha loãng các dung dịch chuẩn này theo cùng phương thức như đã thực hiện với\r\ndung dịch mẫu và mẫu trắng.
\r\n\r\nCác phép đo màu của các dung dịch\r\nmẫu trắng (8.3), mẫu trắng là nước (5.1) và ba dung dịch glucoza chuẩn cần được\r\nlặp lại hai lần. Các mẫu chứa tinh bột thủy phân phải được đo một lần.
\r\n\r\n8.6.3. Dùng pipet (6.6) lấy\r\n0,4 ml dung dịch đã pha loãng cho vào ống ly tâm khô, sạch. Dùng pipet (6.6) bổ\r\nsung 2,62 ml dung dịch tạo màu (5.13.3) và trộn kỹ. Đo độ hấp thụ (xem 6.7) của\r\ndung dịch ở bước sóng 340 nm dựa vào nước.
\r\n\r\n9. Tính và biểu\r\nthị kết quả
\r\n\r\n9.1. Đường chuẩn
\r\n\r\nTính độ hấp thụ đã hiệu chính đối\r\nvới từng dung dịch glucoza chuẩn theo công thức sau:
\r\n\r\nE1gs\r\n= (E0gs - E0wb)
\r\n\r\nTrong đó:
\r\n\r\n| \r\n E1gs \r\n | \r\n \r\n là độ hấp thụ đã hiệu chính của\r\n dung dịch glucoza chuẩn; \r\n | \r\n
| \r\n E0gs \r\n | \r\n \r\n là độ hấp thụ của dung dịch\r\n glucoza chuẩn; \r\n | \r\n
| \r\n E0wb \r\n | \r\n \r\n là giá trị trung bình độ hấp thụ\r\n của mẫu trắng là nước. \r\n | \r\n
Giá trị độ hấp thụ đã hiệu chính\r\ntrung bình của mẫu trắng là nước (theo định nghĩa) bằng zero.
\r\n\r\nSử dụng phép phân tích hồi quy\r\ntuyến tính, để xác định đường chuẩn của giá trị độ hấp thụ hiệu chính theo hàm\r\nlượng glucoza (tính bằng gam trên lít) của các dung dịch glucoza chuẩn chưa pha\r\nloãng.
\r\n\r\nTính giá trị độ hấp thụ đã hiệu\r\nchính của từng dung dịch mẫu theo công thức sau:
\r\n\r\nE1s\r\n= (E0s - E0sb)
\r\n\r\nTrong đó:
\r\n\r\n| \r\n E1s \r\n | \r\n \r\n là độ hấp thụ đã hiệu chính của\r\n dung dịch mẫu; \r\n | \r\n
| \r\n E0s \r\n | \r\n \r\n là độ hấp thụ của dung dịch mẫu\r\n thử; \r\n | \r\n
| \r\n E0sb \r\n | \r\n \r\n là giá trị trung bình độ hấp thụ\r\n của mẫu trắng. \r\n | \r\n
Từ đường chuẩn (9.1), tính hàm\r\nlượng glucoza (rg)\r\ncủa các dung dịch mẫu chưa pha loãng (8.5), tính bằng gam trên lít.
\r\n\r\nXem Phụ lục A.
\r\n\r\n9.2. Hàm lượng tinh bột
\r\n\r\nTính hàm lượng tinh bột của mẫu thử\r\ntheo công thức sau:
\r\n\r\nTrong đó:
\r\n\r\n| \r\n ws \r\n | \r\n \r\n là hàm lượng tinh bột của mẫu\r\n thử, tính bằng gam trên kilogam (g/kg); \r\n | \r\n
| \r\n rg \r\n | \r\n \r\n là hàm lượng glucoza của dung\r\n dịch mẫu, tính được theo 9.1, tính bằng gam trên lít (g/l); \r\n | \r\n
| \r\n V1 \r\n | \r\n \r\n là thể tích của dung dịch tinh\r\n bột trong 8.5 được lấy bằng pipet, tính bằng mililit (= 5,00 ml); \r\n | \r\n
| \r\n V2 \r\n | \r\n \r\n là tổng thể tích của tinh bột sau\r\n khi chuyển thành glucoza trong 8.5, tính bằng mililit (= 5,375 ml); \r\n | \r\n
| \r\n m0 \r\n | \r\n \r\n là khối lượng phần mẫu thử, tính\r\n bằng gam (g). \r\n | \r\n
Để tính hàm lượng tinh bột theo\r\ncông thức trên, thì cần sử dụng các độ pha loãng tương ứng đối với cả mẫu trong\r\n8.6.1 lẫn các dung dịch glucoza chuẩn trong 5.11.
\r\n\r\n\r\n\r\n10.1. Phép thử liên phòng thử\r\nnghiệm
\r\n\r\nChi tiết của phép thử liên phòng\r\nthử nghiệm về độ chụm của phương pháp được nêu trong Phụ lục B. Các giá trị thu\r\nđược từ phép thử liên phòng thử nghiệm này có thể không áp dụng được cho các\r\ndải nồng độ và chất nền khác với các dải nồng độ và chất nền đã nêu.
\r\n\r\n10.2. Độ lặp lại
\r\n\r\nChênh lệch tuyệt đối giữa hai kết\r\nquả thử độc lập, riêng rẽ, thu được khi sử dụng cùng một phương pháp thử trên\r\nvật liệu thử giống hệt nhau, thực hiện trong cùng một phòng thử nghiệm, do cùng\r\nmột người phân tích, sử dụng cùng một thiết bị, trong một khoảng thời gian\r\nngắn, không được quá 5 % các trường hợp vượt quá giới hạn lặp lại sau đây:
\r\n\r\n- 14 g/kg đối với đậu Hà lan, thức\r\năn hỗn hợp cho động vật lấy sữa và bột sắn,
\r\n\r\n- 17 g/kg đối với thức ăn cho lợn\r\ncon,
\r\n\r\n- 48 g/kg đối với thức ăn cho gà đẻ\r\n(xem Phụ lục B).
\r\n\r\n10.3. Độ tái lập
\r\n\r\nChênh lệch tuyệt đối giữa hai kết\r\nquả thử riêng rẽ, thu được khi sử dụng cùng một phương pháp thử trên vật liệu\r\nthử giống hệt nhau, thực hiện trong các phòng thử nghiệm khác nhau, do những\r\nngười phân tích khác nhau, sử dụng các thiết bị khác nhau, không được quá 5 %\r\ncác trường hợp lớn hơn giới hạn tái lập sau đây:
\r\n\r\n- 25 g/kg đối với thức ăn cho lợn\r\ncon,
\r\n\r\n- 34 g/kg đối với bột sắn,
\r\n\r\n- 36 g/kg đối với hỗn hợp cho động\r\nvật lấy sữa,
\r\n\r\n- 48 g/kg đối với thức ăn cho gà\r\nđẻ,
\r\n\r\n- 50 g/kg đối với đậu Hà lan (xem\r\nPhụ lục B).
\r\n\r\n\r\n\r\nBáo cáo thử nghiệm phải nêu rõ:
\r\n\r\n- mọi thông tin cần thiết để nhận\r\nbiết đầy đủ về mẫu thử;
\r\n\r\n- phương pháp lấy mẫu đã sử dụng,\r\nnếu biết;
\r\n\r\n- phương pháp thử đã sử dụng và\r\nviện dẫn tiêu chuẩn này;
\r\n\r\n- tất cả các chi tiết thao tác\r\nkhông quy định trong tiêu chuẩn này, cùng với các chi tiết bất thường nào khác\r\ncó thể ảnh hưởng tới kết quả thử;
\r\n\r\n- kết quả thử nghiệm thu được hoặc\r\nnếu đáp ứng yêu cầu về độ lặp lại thì nêu hai kết quả thử thu được.
\r\n\r\n\r\n\r\n
(Tham\r\nkhảo)
\r\n\r\nA.1. Từ số liệu thống kê, có\r\nthể biết rằng độ tin cậy của đường chuẩn, tính được bằng cách sử dụng phép phân\r\ntích hồi quy tuyến tính, dựa trên mẫu trắng và dung dịch chuẩn, mỗi dung dịch\r\nđược đo ba lần, tốt hơn đường chuẩn được xây dựng dựa trên mẫu trắng và năm\r\ndung dịch chuẩn có nồng độ khác nhau, mỗi dung dịch đo một lần (xem [5]).
\r\n\r\nA.2. Trong phương pháp này\r\ngiả định rằng mẫu nền không ảnh hưởng đến độ hấp thụ của mẫu trắng. Điều này\r\ncần để kiểm soát tất cả các mẫu nền mới được thử nghiệm bằng phương pháp này.\r\nĐiều này có thể được thực hiện theo cách sau.
\r\n\r\nChuẩn bị một lượng thuốc thử tạo màu\r\ntheo 5.13.3, không có dung dịch enzym. Dùng pipet lấy 0,4 ml các dung dịch mẫu\r\nđã pha loãng (được chuẩn bị theo 8.6.1) để thử nghiệm và cũng lấy tương tự đối\r\nvới mẫu trắng đã pha loãng vào ống thủy tinh đựng thuốc thử. Dùng pipet lấy 2,6\r\nml thuốc thử tạo màu không có enzym cho vào các ống này.
\r\n\r\nSau 30 min đến 60 min, đo độ hấp\r\nthụ của tất cả các dung dịch này ở bước sóng 340 nm. Chênh lệch độ hấp thụ giữa\r\ncác dung dịch mẫu và các mẫu trắng không được quá 0,002. Đối với một số nền mẫu\r\ncụ thể chênh lệch này lớn hơn, thì không sử dụng phương pháp này cho các mẫu\r\nnền đó. Các mẫu nền được nghiên cứu trong tiêu chuẩn này, là tinh bột, thức ăn\r\nchăn nuôi, ngũ cốc (ngô, lúa mì và quinoa) và bột khoai tây đông khô, tất cả\r\ncác đáp ứng điều kiện này.
\r\n\r\n\r\n\r\n
(Tham\r\nkhảo)
\r\n\r\nPhép thử liên phòng thử nghiệm (xem\r\n[6]) đã được thực hiện năm 1998 phù hợp với TCVN 6910-2 (ISO 5725-2) (xem [4]).\r\nMười hai phòng thử nghiệm tham gia. Mẫu điều tra là sắn khô, thức ăn cho gà đẻ,\r\nđậu Hà Lan, thức ăn lợn con và thức ăn hỗn hợp cho động vật lấy sữa. Các dữ\r\nliệu về độ chụm được nêu trong Bảng B.1.
\r\n\r\nBảng\r\nB.1 - Kết quả thống kê của phép thử nghiệm liên phòng
\r\n\r\n| \r\n \r\n | \r\n \r\n Mẫu \r\n | \r\n ||||
| \r\n 1 \r\n | \r\n \r\n 2 \r\n | \r\n \r\n 3 \r\n | \r\n \r\n 4 \r\n | \r\n \r\n 5 \r\n | \r\n |
| \r\n Số phòng thử nghiệm tham gia sau\r\n khi trừ ngoại lệ \r\n | \r\n \r\n 9 \r\n | \r\n \r\n 10 \r\n | \r\n \r\n 9 \r\n | \r\n \r\n 8 \r\n | \r\n \r\n 10 \r\n | \r\n
| \r\n Số lượng kết quả được chấp nhận \r\n | \r\n \r\n 18 \r\n | \r\n \r\n 20 \r\n | \r\n \r\n 18 \r\n | \r\n \r\n 16 \r\n | \r\n \r\n 20 \r\n | \r\n
| \r\n Hàm lượng tinh bột trung bình,\r\n g/kg \r\n | \r\n \r\n 456 \r\n | \r\n \r\n 447 \r\n | \r\n \r\n 233 \r\n | \r\n \r\n 704 \r\n | \r\n \r\n 394 \r\n | \r\n
| \r\n Độ lệch chuẩn lặp lại, sr,\r\n g/kg \r\n | \r\n \r\n 5 \r\n | \r\n \r\n 6 \r\n | \r\n \r\n 5 \r\n | \r\n \r\n 5 \r\n | \r\n \r\n 17 \r\n | \r\n
| \r\n Hệ số biến thiên lặp lại, % \r\n | \r\n \r\n 1,1 \r\n | \r\n \r\n 1,3 \r\n | \r\n \r\n 2,1 \r\n | \r\n \r\n 0,7 \r\n | \r\n \r\n 4,3 \r\n | \r\n
| \r\n Giới hạn lặp lại , (r)\r\n [2,8 x sr] g/kg \r\n | \r\n \r\n 14 \r\n | \r\n \r\n 17 \r\n | \r\n \r\n 14 \r\n | \r\n \r\n 14 \r\n | \r\n \r\n 48 \r\n | \r\n
| \r\n Độ lệch chuẩn tái lập sR,\r\n g/kg \r\n | \r\n \r\n 18 \r\n | \r\n \r\n 9 \r\n | \r\n \r\n 13 \r\n | \r\n \r\n 12 \r\n | \r\n \r\n 17 \r\n | \r\n
| \r\n Hệ số biến thiên tái lập, % \r\n | \r\n \r\n 3,9 \r\n | \r\n \r\n 2,0 \r\n | \r\n \r\n 5,6 \r\n | \r\n \r\n 1,7 \r\n | \r\n \r\n 4,3 \r\n | \r\n
| \r\n Giới hạn tái lập, (R) [2,8\r\n x sR], g/kg \r\n | \r\n \r\n 50 \r\n | \r\n \r\n 25 \r\n | \r\n \r\n 36 \r\n | \r\n \r\n 34 \r\n | \r\n \r\n 48 \r\n | \r\n
| \r\n 1: đậu Hà lan \r\n2: thức ăn cho lợn con \r\n3: thức ăn cho trâu bò \r\n4: sắn khô \r\n5: thức ăn cho gà đẻ. \r\n | \r\n |||||
\r\n\r\n
THƯ\r\nMỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO
\r\n\r\n[1] BRUNT K., SANDERS P. and ROZEMA\r\nT. The enzymatic determination of starch in food, feed and raw materials of the\r\nstarch industry. Starch/Starke, 50, 1998, pp. 413-419
\r\n\r\n[2] Method of enzymatic\r\nbioanalysis and food analysis. Boehringer Mannheim, 1995, pp. 46-49 and\r\n126-129
\r\n\r\n[3] TCVN 6910-1:2001 (ISO\r\n5725-1:1994) Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả\r\nđo - Phần 1: Nguyên tắc và định nghĩa chung.
\r\n\r\n[4] TCVN 6910-2:2001 (ISO\r\n5725-2:1994) Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả\r\nđo - Phần 2: Phương pháp cơ bản xác định độ lặp lại và độ tái lập của phương\r\npháp đo tiêu chuẩn.
\r\n\r\n[5] MILLER J.C. and MILLER J.N. Statistics\r\nfor analytical chemistry, 2nd edition, 1992, pp. 112-115, Ellis\r\nHorwood, New York, London, Toronto, Sydney, Tokyo, Singapore
\r\n\r\n[6] BRUNT K. Collaborative study\r\nconcerning the enzymatic determination of starch in food, feed, and raw\r\nmaterial for the starch industry. Starch/Starke, 52, 2000, pp. 73-75
\r\n\r\n\r\n\r\n
\r\n\r\n
1) Roche\r\nDiagnostics, No. 1 202 367 là ví dụ về sản phẩm thích hợp có bán sẵn. Thông tin\r\nnày đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn không ấn định phải sử\r\ndụng sản phẩm này.
\r\n\r\n2) R-Biopharm, AG\r\nNo. 716251 là ví dụ về sản phẩm thích hợp có bán sẵn. Thông tin này đưa ra tạo\r\nthuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và tiêu chuẩn không ấn định phải sử\r\ndụng sản phẩm này.
\r\n\r\nFile gốc của Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 9587:2013 (ISO 15914:2004) về Thức ăn chăn nuôi – Xác định hàm lượng tinh bột bằng phương pháp enzym đang được cập nhật.
Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 9587:2013 (ISO 15914:2004) về Thức ăn chăn nuôi – Xác định hàm lượng tinh bột bằng phương pháp enzym
Tóm tắt
| Cơ quan ban hành | Đã xác định |
| Số hiệu | TCVN9587:2013 |
| Loại văn bản | Tiêu chuẩn Việt Nam |
| Người ký | Đã xác định |
| Ngày ban hành | 2013-01-01 |
| Ngày hiệu lực | |
| Lĩnh vực | Nông nghiệp |
| Tình trạng | Còn hiệu lực |