Animal\r\nfeeding stuffs – Qualitative determination of zearalennone
\r\n\r\n\r\n\r\nTiêu chuẩn này quy định phương pháp\r\nđịnh tính zearalenone trong thức ăn chăn nuôi và đặc biệt là trong ngô. Phương\r\npháp này chỉ dùng cho mục đích sàng lọc.
\r\n\r\nGiới hạn của phép xác định zearalenone\r\nlà khoảng 50 μg/kg.
\r\n\r\nCHÚ THÍCH Mặc dù lúa miến cho các\r\nvết huỳnh quang nhiễu giống các vết huỳnh quang của zearalenone, nhưng phương\r\npháp này vẫn có thể áp dụng cho thức ăn chăn nuôi vì giá trị Rf khác\r\nnhau sau khi phát triển sắc phổ theo chiều thứ hai. Các vết chấm này không được\r\ntriển khai bằng kỹ thuật khẳng định riêng.
\r\n\r\n\r\n\r\nPhần mẫu thử được chiết bằng hỗn\r\nhợp của axetonitril và dung dịch kali clorua sau đó được lọc và phần dịch lọc\r\nđược khử béo bằng isooctan, sau đó được tinh sạch bằng hỗn hợp axetonitril,\r\nnước và chì axetat với sự có mặt của diatomit. Sau khi lọc, phần dịch lọc được\r\nchiết bằng cloroform sau đó cho bay hơi.
\r\n\r\nChất chiết khô được hòa tan trong\r\nhỗn hợp của benzen và axetonitril. Tiến hành sắc ký lớp mỏng hai chiều trên một\r\nphần của dịch dịch này. Hàm lượng zearalenone xác định được bằng cách quan sát\r\nhoặc đo cường độ huỳnh quang của vết chấm dưới ánh sáng tử ngoại bằng cách so\r\nsánh với cường độ huỳnh quang của một lượng zearalenone đã biết được\r\nthực hiện trên cùng một bản sắc ký.
\r\n\r\nViệc nhận biết zearalenone được\r\nkhẳng định bằng cách sử dụng thuốc thử benzidin bis-diazo hóa.
\r\n\r\n\r\n\r\nChỉ sử dụng thuốc thử loại tinh\r\nkhiết phân tích và nước cất hoặc nước đã khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết\r\ntương đương.
\r\n\r\n3.1. Axetonitril.
\r\n\r\n3.2. Isooctan.
\r\n\r\n3.3. Cloroform.
\r\n\r\nCẢNH BÁO – Cloroform là chất\r\nđộc. Tránh hít và tiếp xúc với cloroform. Làm việc trong tủ hút khí độc khi xử\r\nlý dung môi và các dung dịch của chúng.
\r\n\r\n3.4. Benzen/axetonitril, hỗn\r\nhợp 98 + 2, tính theo thể tích.
\r\n\r\nCẢNH BÁO – Benzen độc khi hít\r\nphải và tiếp xúc với da và rất dễ cháy.
\r\n\r\n3.5. Dung môi triển khai.
\r\n\r\n3.5.1. Toluen/etyl axetat/axit\r\nfocmic, hỗn hợp 6 + 3 + 1, tính theo thể tích.
\r\n\r\n3.5.2. Cloroform/etanol, hỗn\r\nhợp 95 + 5, tính theo thể tích.
\r\n\r\n3.6. Kali clorua, dung dịch\r\n40 g/l.
\r\n\r\n3.7. Dung dịch chì axetat,\r\nđược chuẩn bị như sau:
\r\n\r\nCân 200 g chì axetat cho vào bình\r\nđịnh mức một vạch 1000 ml, thêm 3 ml axit axetic, pha loãng bằng nước đến vạch\r\nvà trộn.
\r\n\r\n3.8. Thuốc thử benzidin\r\nbis-diazo hóa, được chuẩn bị như sau
\r\n\r\nCẢNH BÁO – Benzidin là chất gây\r\nung thư, gây độc khi hít vào, tiếp xúc với da và nuốt phải.
\r\n\r\n3.8.1. Chuẩn bị dung dịch\r\nbenzidin 5 g/l
\r\n\r\nLấy 0,5 g benzidin cho vào bình 100\r\nml có chứa 20 ml nước và 1,5 ml axit clohydric và thêm nước đến vạch.
\r\n\r\nBảo quản dung dịch này trong chai\r\nthủy tinh màu nâu tránh ánh sáng.
\r\n\r\n3.8.2. Chuẩn bị thuốc thử
\r\n\r\nLàm nguội các thể tích bằng nhau\r\ncủa dung dịch benzidin (3.8.1) và dung dịch natri nitrit 100 g/l đến khoảng từ\r\n0 oC đến 5 oC.
\r\n\r\nTrộn kỹ hai dung dịch này. Dung\r\ndịch thu được có màu tím sẫm và đục. Đưa dung dịch này về nhiệt độ phòng (màu\r\nvàng) trước khi sử dụng.
\r\n\r\nChuẩn bị thuốc thử này ngay khi sử\r\ndụng.
\r\n\r\n3.9. Diatomit (celit 545),\r\nđã được rửa bằng axit clohydric
\r\n\r\n3.10. Nitơ.
\r\n\r\n3.11. Zearalenone, dung dịch\r\nchuẩn có nồng độ 10 μg/ml trong benzen.
\r\n\r\nXác định phổ hấp thụ của dung dịch\r\ntrong dải bước sóng từ 300 nm đến 330 nm bằng máy đo phổ, sử dụng cuvet quang\r\nhọc thạch anh 10 mm và sử dụng benzen làm chất đối chứng. Ghi lại độ hấp thụ\r\ntối đa, A, gần với bước sóng 317 nm.
\r\n\r\nTính nồng độ zearalenone của dung\r\ndịch bằng miligam trên mililit (mg/ml), sử dụng công thức sau:
\r\n\r\nTrong đó
\r\n\r\n318 là khối lượng phân tử của zearalenone;
\r\n\r\n6060 là hệ số tắt\r\nphân tử.
\r\n\r\n\r\n\r\nSử dụng các thiết bị,\r\ndụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:
\r\n\r\n4.1. Máy nghiền
4.2. Máy lắc
4.3. Giấy lọc
4.4. Bộ cô quay
4.5. Thiết bị dùng\r\ncho sắc ký lớp mỏng, ví dụ: thiết bị cần thiết để\r\nchuẩn bị bản sắc ký (4.6) và dụng cụ chấm (pipet mao quản hoặc microxyranh), bể\r\ntriển khai sắc ký, và dụng cụ phun thuốc thử (3.8) lên các bản sắc ký.
\r\n\r\n4.6. Bản thủy tinh\r\ndùng cho sắc ký lớp mỏng, kích thước 200 mm x 200 mm,\r\nđược chuẩn bị như sau (lượng này chỉ vừa đủ để chuẩn bị 5 bản).
\r\n\r\nCân 30 g silica gel\r\nG-HR cho vào bình nón, thêm 60 ml nước, đậy kín và trộn kỹ trong 1 min. Dàn đều\r\nthành một lớp trên bản sắc ký sao cho tạo thành một lớp dày đều 0,25 mm. Để khô\r\ntrong không khí và bảo quản các bản sắc ký này trong bình hút ấm. Hoạt hóa bản\r\nsắc ký trước khi sử dụng bằng cách đặt chúng trong tủ sấy, duy trì ở 110 oC\r\n± 3 oC trong 1 h.
\r\n\r\nCó thể sử dụng các\r\nbản sắc ký đã chuẩn bị có bán sẵn trên thị trường nếu cho các kết quả tương\r\nđương với kết quả thu được từ các bản sắc ký được chuẩn bị ở phần trên.
\r\n\r\n4.7. Đèn UV bước\r\nsóng ngắn (bước sóng 253 nm)
\r\n\r\nCường độ của tia sáng\r\nphải đạt được sao cho phân biệt rõ chấm 25 ng của zearalenone trên bản sắc ký\r\nlớp mỏng khi đèn được đặt cách bản sắc ký 100 mm.
\r\n\r\nCẢNH BÁO – Do ánh\r\nsáng UV rất có hại cho mắt, cần mang tính bảo vệ mắt.
\r\n\r\n4.8. Ống nghiệm
4.9. Máy đo huỳnh\r\nquang (tùy chọn, nhưng nên có).
\r\n\r\n4.10. Nồi cách\r\nthủy, có thể duy trì nhiệt độ ở 60 oC ± 1 oC.
\r\n\r\n4.11. Bình nón
4.12. Phễu chiết
4.13. Ống\r\nđong, dung tích 100 ml và 250 ml.
\r\n\r\n4.14. Pipet, dung tích 50 ml\r\nvà 100 ml.
\r\n\r\n4.15. Microxyranh.
\r\n\r\n\r\n\r\nLấy mẫu phòng thử nghiệm đối với\r\nsản phẩm cần kiểm tra theo tiêu chuẩn thích hợp liên quan đến sản phẩm, trừ khi\r\nviệc lấy mẫu để xác định zearalenone không bao gồm trong áp dụng. Nếu không có\r\ntiêu chuẩn cụ thể hiện hành, thì các bên liên quan sẽ thỏa thuận về vấn đề này,\r\ncó tính đến các đặc tính của sản phẩm cần lấy mẫu.
\r\n\r\n\r\n\r\n6.1. Chuẩn bị mẫu thử
\r\n\r\nNghiền mẫu sao cho có thể hết qua\r\nrây có cỡ lỗ 1 mm. Trộn kỹ.
\r\n\r\n6.2. Phần mẫu thử
\r\n\r\nCân 50 g mẫu thử cho vào bình nón\r\n500 ml (4.11), chính xác đến 0,01 g.
\r\n\r\n6.3. Chiết
\r\n\r\nDùng ống đong (4.13) thêm cẩn thận\r\n180 ml axetonitril (3.1) và 20 ml dung dịch kali clorua (3.6) vào bình. Đậy\r\nbình, trộn và lắc 30 min bằng máy lắc (4.2). Lọc qua giấy lọc (4.3).
\r\n\r\nDùng pipet (4.14) chuyển 100 ml\r\ndịch lọc vào phễu chiết (4.12) và loại chất béo bằng cách chiết hai lần liên\r\ntục mỗi lần dùng 50 ml isooctan (3.2).
\r\n\r\nThu lấy pha axetonitril vào bình\r\ncầu đáy tròn của bộ cô quay (4.4) và cho bay hơi đến khô dưới áp suất giảm.
\r\n\r\n6.4. Tinh sạch
\r\n\r\nDùng ống đong (4.13) thêm cẩn thận\r\n20 ml axetonitril (3.1), 60 ml nước và 20 ml dung dịch chì axetat (3.7) vào\r\nlượng còn lại thu được sau khi bay hơi. Trộn và để tách pha 10 min trong nồi\r\ncách thủy (4.10) duy trì ở 60 oC. Kết tủa được tạo thành. Thêm 5 g diatomit\r\n(3.9) và lọc qua giấy lọc (4.3).
\r\n\r\nDùng pipet (4.14) chuyển 50 ml dịch\r\nlọc vào phễu chiết và thực hiện chiết ba lần liên tiếp, mỗi lần dùng 50 ml\r\ncloroform (3.3). Làm khô các phần cloroform trên natri sulfat. Thu các phần\r\ncloroform trong bình cầu đáy tròn của bộ cô quay (4.4) và làm bay hơi gần như\r\nđến khô dưới áp suất giảm.
\r\n\r\nChuyển lượng còn lại sau khi bay\r\nhơi vào ống nghiệm (4.8) dùng cloroform để tráng rửa, sau đó làm bay hơi đến\r\nkhô dưới dòng khí nitơ (3.10) trên nồi cách thủy (4.10).
\r\n\r\nCẩn thận dùng microxyranh thêm 0,5\r\nml hỗn hợp benzen/axetonitril (3.4) và đậy chặt nắp ống nghiệm.
\r\n\r\n6.5. Sắc ký lớp mỏng hai chiều
\r\n\r\n6.5.1. Sử dụng các dung dịch (xem\r\nHình 1)
\r\n\r\nVạch lên bản sắc ký (4.6) hai đường\r\nthẳng song song sát với hai cạnh liền kề (ở 50 mm và 60 mm tương ứng tính từ từ\r\ncác cạnh) để đánh dấu giới hạn dịch chuyển của dung môi phía trước. Đưa các\r\ndung dịch sau đây lên bản sắc ký bằng cách dùng microxyranh.
\r\n\r\n- ở điểm A, 25 μl dịch chiết đã\r\ntinh sạch (6.4);
\r\n\r\n- ở điểm B, 10 μl dung dịch chuẩn\r\n(3.11);
\r\n\r\n- ở điểm C, 5 μl dung dịch chuẩn\r\n(3.11);
\r\n\r\n- ở điểm D, 10 μl dung dịch chuẩn\r\n(3.11);
\r\n\r\n- ở điểm E, 15 μl dung dịch chuẩn\r\n(3.11).
\r\n\r\nLàm khô dưới dòng không khí hoặc\r\nnitơ. Các vết chấm thu được phải có đường kính khoảng 5 mm.
\r\n\r\n6.5.2. Khai triển
\r\n\r\nPhát triển sắc phổ theo hướng l sử\r\ndụng dung môi khai triển (3.5.1) (lớp 10 mm trong bể bão hòa) tránh ánh sáng,\r\ncho đến khi dung môi đạt được đến vạch đánh dấu. Lấy bản sắc ký ra hỏi bể và để\r\nkhô ít nhất 15 min ở nhiệt độ môi trường, tránh ánh sáng.
\r\n\r\nĐể thuận tiện hơn, sau khi khai triển\r\ntheo hướng l, quan sát sắc phổ nhanh dưới ánh sáng tử ngoại 253 nm và khoanh\r\ncác chấm zearalenone nhanh bằng bút chì (chấm ở điểm B cho thấy vị trí của\r\nzearalenone).
\r\n\r\nHình\r\n1 – Chấm mẫu và triển khai sắc ký đồ
\r\n\r\nSau đó, khai triển sắc ký theo\r\nhướng ll sử dụng dung môi triển khai (3.5.2) (lớp 10 mm trong bể chưa bão hòa)\r\ntránh ánh sáng, cho đến khi dung môi đến vạch đánh dấu. Lấy bản sắc ký ra khỏi\r\nbể và để khô ở nhiệt độ môi trường, tránh ánh sáng.
\r\n\r\n6.6. Xác định
\r\n\r\n6.6.1. Yêu cầu chung
\r\n\r\nCó thể sử dụng hai phương pháp xác\r\nđịnh: quan sát bằng mắt thường hoặc đo mật độ huỳnh quang. Nếu có sẵn máy đo\r\nmật độ huỳnh quang thì nên dùng phương pháp này.
\r\n\r\n6.6.2. Quan sát bằng mắt thường
\r\n\r\nXác định lượng zearalenone trong\r\nđiểm chấm mẫu bằng cách so sánh cường độ huỳnh quang dưới ánh sáng UV của điểm\r\nchấm từ chất chiết với cường độ của các điểm chấm C, D và E của dung dịch\r\nchuẩn, với các bản sắc ký được đặt cách đèn UV (4.7) 10 cm. Dùng phương pháp\r\nnội suy, nếu cần.
\r\n\r\nNếu cường độ huỳnh quang của điểm\r\nchấm 25 μl của chất chiết lớn hơn so với điểm chấm 15 μl dung dịch chuẩn, thì\r\ndùng một thể tích nhỏ hơn ở điểm A hoặc pha loãng chất chiết với hỗn hợp\r\nbenzen/axetonitril (3.4) và lặp lại sắc ký lớp mỏng (6.5).
\r\n\r\n6.6.3. Đo mật độ huỳnh quang
\r\n\r\nĐo cường độ huỳnh quang của các\r\nchấm sử dụng máy đo mật độ huỳnh quang (4.9), ví dụ, ở bước sóng kích thích 313\r\nnm và bước sóng phát xạ 443 nm (bước sóng phát xạ cực đại ở 470 nm).
\r\n\r\nXác định hàm lượng zearalenone của\r\nchấm mẫu bằng cách so sánh cường độ huỳnh quang của điểm chấm từ chất chiết với\r\ncường độ của các điểm chấm C, D và E từ dung dịch chuẩn.
\r\n\r\n6.7. Phép khẳng định zearalenone
\r\n\r\nPhun thuốc thử benzidin bis-diazo\r\nhóa (3.8) lên các bản sắc ký thu được trong 6.5. Zearalenone cho chấm màu gạch\r\nđỏ tươi ở nhiệt độ phòng, nhạt dần sau khi tiếp xúc với không khí trong ít nhất\r\n15 min.
\r\n\r\n\r\n\r\n7.1. Phương pháp quan sát bằng\r\nmắt thường
\r\n\r\nHàm lượng zearalenone, biểu thị\r\nbằng microgam trên kilogam sản phẩm, tính được bằng công thức sau:
\r\n\r\nTrong đó:
\r\n\r\nc là nồng độ zearalenone của dung\r\ndịch chuẩn (3.11), tính bằng microgam trên mililit (μg/ml);
\r\n\r\nm là khối lượng phần mẫu thử tương\r\nứng với thể tích chất chiết phụ thuộc vào quá trình tinh sạch (12,5 g), tính\r\nbằng gam (g);
\r\n\r\nV1 là thể tích cuối cùng\r\ncủa dịch chiết có tính đến các khả năng pha loãng, tính bằng microlit (μl);
\r\n\r\nV2 và V3 là\r\ncác thể tích tương ứng của chất chiết và của dung dịch chuẩn zearalenone (3.11)\r\nđược áp dụng cho bản sắc ký, cho các cường độ huỳnh quang tương tự, tính bằng\r\nmicrolit (μl).
\r\n\r\n7.2. Phép đo bằng máy đo mật độ\r\nhuỳnh quang
\r\n\r\nHàm lượng zearalenone, biểu thị\r\nbằng microgam trên kilogam sản phẩm, tính theo công thức sau:
\r\n\r\nTrong đó:
\r\n\r\nm là khối lượng phần mẫu thử (trong\r\ntrường hợp này là 12,5 g) tương ứng với thể tích chất chiết phụ thuộc vào quá\r\ntrình tinh sạch (12,5 g), tính bằng gam (g);
\r\n\r\nm1 là khối lượng của\r\nzearalenone trong chấm chất chiết (có tính đến thể tích V2), suy ra\r\ntừ các phép xác định, tính bằng nanogam (ng);
\r\n\r\nV1 là thể tích cuối cùng\r\ncủa dịch chiết có tính đến các khả năng loãng, tính bằng microlit (μl);
\r\n\r\nV2 là thể tích của dịch\r\nchiết được đưa vào bản sắc ký (trong trường hợp này là 25 μl), tính bằng\r\nmicrolit (μl).
\r\n\r\n\r\n\r\nCác chi tiết của phép thử liên\r\nphòng thử nghiệm về độ chụm của phương pháp được nêu trong Phụ lục A. Các giá\r\ntrị thu được từ phép thử liên phòng thử nghiệm này có thể không áp dụng cho các\r\ndải nồng độ và chất nền khác với các dải nồng độ và chất nền đã nêu.
\r\n\r\n\r\n\r\nBáo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:
\r\n\r\n- mọi thông tin cần thiết để nhận\r\nbiết đầy đủ về mẫu thử;
\r\n\r\n- phương pháp lấy mẫu đã sử dụng,\r\nnếu biết;
\r\n\r\n- phương pháp thử đã dùng, cũng như\r\nviện dẫn tiêu chuẩn này;
\r\n\r\n- phương pháp xác định đã sử dụng\r\n(quan sát bằng mắt thường hoặc sử dụng máy đo huỳnh quang);
\r\n\r\n- tất cả các chi tiết thao tác\r\nkhông quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc tùy chọn cùng với các chi tiết bất\r\nthường khác có thể ảnh hưởng tới kết quả;
\r\n\r\n- kết quả thu được.
\r\n\r\n\r\n\r\n
Một phép thử liên phòng thử nghiệm\r\nquốc tế gồm có 20 phòng thử nghiệm tham gia (chỉ 16 phòng thử nghiệm trong số\r\nđó cung cấp kết quả có thể sử dụng cho ngô B) mỗi phòng thử nghiệm tiến hành ba\r\nphép xác định, cho các kết quả thống kê (đánh giá theo ISO 5725:1986
Bảng\r\nA.1 – Kết quả thử nghiệm liên phòng
\r\n\r\n| \r\n Mẫu \r\n | \r\n \r\n Ngô\r\n A \r\n | \r\n \r\n Ngô\r\n B \r\n(mẫu\r\n ngô A được pha loãng đến 1/3) \r\n | \r\n
| \r\n Số lượng các phòng thử nghiệm còn\r\n lại sau khi trừ ngoại lệ \r\n | \r\n \r\n 20 \r\n | \r\n \r\n 15 \r\n | \r\n
| \r\n Trung bình, μg/kg \r\n | \r\n \r\n 734 \r\n | \r\n \r\n 219 \r\n | \r\n
| \r\n Độ lệch chuẩn lặp lại, sr,\r\n μg/kg \r\nHệ số biến thiên lặp lại, % \r\nGiới hạn lặp lại, r(2,83 sr),\r\n μg/kg \r\n | \r\n \r\n 78 \r\n11 \r\n221 \r\n | \r\n \r\n 34 \r\n15 \r\n96 \r\n | \r\n
| \r\n Độ lệch chuẩn tái lập, sR,\r\n μg/kg \r\n | \r\n \r\n 282 \r\n | \r\n \r\n 125 \r\n | \r\n
| \r\n Hệ số biến thiên tái lập, % \r\n | \r\n \r\n 38 \r\n | \r\n \r\n 57 \r\n | \r\n
| \r\n Giới hạn tái lập, R (2,83 sR),\r\n μg/kg \r\n | \r\n \r\n 798 \r\n | \r\n \r\n 354 \r\n | \r\n
\r\n\r\n
\r\n\r\n
\r\n\r\n
1) ISO 5725\r\n(đã được hủy bỏ) được sử dụng để thu dữ liệu về độ chụm.
\r\n\r\nFile gốc của Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 9131:2011 (ISO 6870 : 2002) về Thức ăn chăn nuôi – Định tính zearalenone đang được cập nhật.
Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 9131:2011 (ISO 6870 : 2002) về Thức ăn chăn nuôi – Định tính zearalenone
Tóm tắt
| Cơ quan ban hành | Đã xác định |
| Số hiệu | TCVN9131:2011 |
| Loại văn bản | Tiêu chuẩn Việt Nam |
| Người ký | Đã xác định |
| Ngày ban hành | 2011-01-01 |
| Ngày hiệu lực | |
| Lĩnh vực | Nông nghiệp |
| Tình trạng | Còn hiệu lực |