Tiêu chuẩn này quy định phương pháp sử dụng\r\nsắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) để xác định hàm lượng carbadox trong thức ăn\r\nhỗn hợp và thức ăn chăn nuôi.
\r\n\r\nPhương pháp này có thể áp dụng cho thức ăn\r\nchăn nuôi có chứa 0,5 mg/kg (giới hạn định lượng) đến 100 mg/kg khối lượng và\r\náp dụng cho thức ăn hỗn hợp có chứa carbadox lên tới 10% khối lượng.
\r\n\r\nGiới hạn phát hiện dưới là 0,1 mg/kg.
\r\n\r\nCHÚ THÍCH 1: Đối với thức ăn chăn nuôi, phần\r\nkhối lượng của carbadox tính bằng miligam trên kilogam, còn đối với thức ăn hỗn\r\nhợp là phần trăm khối lượng.
\r\n\r\nCHÚ THÍCH 2: Carbadox thuộc nhóm quinoxalin.\r\nCarbadox được dùng làm phụ gia để kích thích tăng trưởng cho lợn con.
\r\n\r\n\r\n\r\nCác tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho\r\nviệc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì\r\náp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố\r\nthì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).
\r\n\r\nTCVN 6952:2001(ISO 6498:1998), Thức ăn\r\nchăn nuôi – Chuẩn bị mẫu thử.
\r\n\r\n\r\n\r\nCarbadox được chiết ra khỏi mẫu bằng hỗn hợp\r\ncủa axetonitril và metanol. Thức ăn chăn nuôi đã được làm ẩm sơ bộ với nước.\r\nChất chiết mẫu thức ăn chăn nuôi được làm sạch qua cột nhôm oxit ngắn. Chất\r\nchiết của hỗn hợp thức ăn chăn nuôi được pha loãng trực tiếp với hỗn hợp của\r\nnước, axetonitril và metanol. Chất chiết cuối cùng được phân tích bằng HPLC pha\r\nđảo với derector UV ở bước sóng 365 nm (xem [1] đến [3])
\r\n\r\nSự có mặt của dimetridazole, nitrofurazone\r\nhoặc natri sulfadimidin có thể làm cản trở phép xác định carbadox.
\r\n\r\nNgoài ra, carbadox có thể xác định được sau\r\nkhi tạo dẫn xuất sau cột với natri hydroxit sau đó phát hiện ở bước sóng 420\r\nnm.
\r\n\r\n\r\n\r\nChỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân\r\ntích.
\r\n\r\n4.1. Nước, đã khử khoáng hoặc đã khử ion, với\r\nđiện trở suất ít nhất là 10 MW.cm,\r\nhoặc nước có độ tinh khiết tương đương.
\r\n\r\n4.2. Dung môi chiết:
Trộn các thể tích bằng nhau của axetonitril\r\nvà metanol. Trộn kỹ và chỉnh về nhiệt độ phòng trước khi sử dụng.
\r\n\r\n4.3. Dung môi pha loãng:
Trộn 70 ml dung môi chiết (4.2) với 30 ml nước\r\n(4.1).
\r\n\r\n4.4. Axit axetic
Pha loãng 10 ml axit axetic băng với nước đến\r\n100 ml.
\r\n\r\n4.5. Dung dịch natri axetat,
Cân 0,82 g natri axetat không chứa nước cho\r\nvào bình định mức một vạch 1000 ml. Hòa tan trong 700 ml nước. Điều chỉnh pH\r\ntới pH = 6 bằng axit axetic (4.4). Pha loãng bằng nước tới vạch và trộn.
\r\n\r\n4.6. Pha động dùng cho HPLC
\r\n\r\nGộp 825 ml dung dịch natri axetat (4.5) và\r\n175 ml axetonitril và trộn. Lọc dịch rửa giải qua bộ lọc 0,22 µm sử dụng hệ\r\nthống lọc dung môi (5.2), khử khí 10 min trong bể siêu âm (5.3) trước khi sử\r\ndụng.
\r\n\r\n4.7. Chất chuẩn carbadox,
CẢNH BÁO – Vì carbadox nhạy với ánh sáng, do\r\nđó cần tránh ánh sáng ban ngày hoặc ánh sáng trắng nhân tạo. Tránh hít phải và\r\ntiếp xúc với chất chuẩn carbadox độc và các dung dịch của chúng. Làm việc trong\r\ntủ hút khói khi tiếp xúc với các dung môi và dung dịch. Mang kính an toàn và\r\nmặc quần áo bảo hộ.
\r\n\r\n4.8. Dung dịch gốc carbadox
Cân 10 mg ± 1 mg carbadox (4.7), chính xác\r\nđến 0,1 mg, cho vào bình định mức một vạch 100 ml. Hòa tan trong dung môi chiết\r\n(4.2), pha loãng tới vạch và trộn. Tính nồng độ của dung dịch có tính đến độ\r\ntinh khiết của chất chuẩn. Chuẩn bị dung dịch mới hàng tháng. Bảo quản trong\r\ntối ở 0°
4.9. Dung dịch làm việc carbadox
Dùng pipet lấy 1,0 ml và 5,0 ml dung dịch gốc\r\ncarbadox (4.8) cho vào các bình định mức một vạch 50 ml riêng rẽ. Pha loãng\r\nbằng dung môi pha loãng (4.3) tới vạch và trộn. Chuẩn bị dung dịch mới cho mỗi\r\ndãy mẫu.
\r\n\r\n4.10. Dung dịch làm việc carbadox
Dùng pipet lấy 1,0 ml dung dịch gốc carbadox\r\n(4.8) cho vào bình định mức một vạch 50 ml, pha loãng bằng pha động (4.6) tới\r\nvạch và trộn. Dùng pipet lấy 10 ml dung dịch này (2 µg/ml) cho vào bình định\r\nmức một vạch 50 ml, pha loãng bằng pha động (4.6) tới vạch và trộn. Chuẩn bị\r\ndung dịch mới cho mỗi dãy mẫu.
\r\n\r\n4.11. Chất chuẩn dimetridazole
CẢNH BÁO - Vì dimetridazole nhạy với ánh\r\nsáng, do đó cần tránh ánh sáng ban ngày hoặc ánh sáng trắng nhân tạo. Tránh hít\r\nphải và tiếp xúc với chất chuẩn dimetridazole độc và các dung dịch của chúng.\r\nLàm việc trong tủ hút khói khi tiếp xúc với các dung môi và dung dịch. Mang\r\nkính an toàn và mặc quần áo bảo hộ.
\r\n\r\n4.12. Dung dịch gốc dimetridazole
Cân 10 mg ± 1 mg dimetridazole (4.11), chính\r\nxác đến 0,1 mg, cho vào bình định mức một vạch 100 ml. Pha loãng bằng metanol\r\ntới vạch và trộn. Tính nồng độ của dung dịch có tính đến độ tinh khiết của chất\r\nchuẩn. Chuẩn bị dung dịch mới hàng tháng. Bảo quản ở nơi tối ở 0
4.13. Dung dịch làm việc dimetridazole
Dùng pipet lấy 2,0 ml dung dịch gốc\r\ndimetridazole (4.12) cho vào bình định mức một vạch 10 ml. Pha loãng bằng nước\r\ntới vạch và trộn. Chuẩn bị dung dịch mới cho mỗi dãy mẫu.
\r\n\r\n4.14. Chất chuẩn sulfadimidin,
CẢNH BÁO – Tránh hít phải và tiếp xúc với\r\nchất chuẩn sulfadimidin độc và các dung dịch của chúng. Làm việc trong tủ hút\r\nkhói khi tiếp xúc với các dung môi và dung dịch. Mang kính an toàn và mặc quần\r\náo bảo hộ.
\r\n\r\n4.15. Dung dịch gốc sulfadimidin
Cân 10 mg ± 1 mg chất chuẩn sulfadimidin\r\n(4.14), chính xác đến 0,1 mg, cho vào bình định mức một vạch 50 ml. Pha loãng\r\nbằng metanol tới vạch và trộn. Tính nồng độ của dung dịch có tính đến độ tinh\r\nkhiết của chất chuẩn. Chuẩn bị dung dịch mới hàng tháng. Bảo quản ở nơi tối ở 0
4.16. Dung dịch làm việc sulfadimidin
Dùng pipet lấy 1,0 ml dung dịch gốc sulfadimidin\r\n(4.15) cho vào bình định mức một vạch 10 ml. Pha loãng bằng nước tới vạch và\r\ntrộn. Chuẩn bị dung dịch mới cho mỗi dãy mẫu.
\r\n\r\n4.17. Chất chuẩn nitrofurazone
CẢNH BÁO - Vì nitrofurazone nhạy với ánh\r\nsáng, do đó cần tránh ánh sáng ban ngày hoặc ánh sáng trắng nhân tạo. Tránh hít\r\nphải và tiếp xúc với chất chuẩn nitrofurazone độc và các dung dịch của chúng.\r\nLàm việc trong tủ hút khói khi tiếp xúc với các dung môi và dung dịch. Mang\r\nkính an toàn và mặc quần áo bảo hộ.
\r\n\r\n4.18. Dung dịch gốc nitrofurazone
Cân 10 mg ± 1 mg nitrofurazone (4.17), chính\r\nxác đến 0,1 mg, cho vào bình định mức một vạch 100 ml. Pha loãng bằng metanol tới\r\nvạch và trộn. Tính nồng độ của dung dịch có tính đến độ tinh khiết của chất\r\nchuẩn. Chuẩn bị dung dịch mới hàng tháng. Bảo quản ở nơi tối ở 0
4.19. Dung dịch làm việc nitrofurazone
Dùng pipet lấy 2,0 ml dung dịch gốc\r\nnitrofurazone (4.18) cho vào bình định mức một vạch 10 ml. Pha loãng bằng nước\r\ntới vạch và trộn. Chuẩn bị dung dịch mới cho mỗi dãy mẫu.
\r\n\r\n4.20. Nhôm oxit trung tính
Để khử hết hoạt tính sử dụng từ 0% đến 1%\r\nnước.
\r\n\r\n4.21. Dung dịch natri hydroxit
Cân 20 g natri hydroxit cho vào bình định mức\r\nmột vạch 1 lít và hòa tan trong 10 ml nước. Pha loãng bằng nước tới vạch và\r\ntrộn.
\r\n\r\n\r\n\r\nSử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử\r\nnghiệm thông thường và cụ thể như sau:
\r\n\r\n5.1. Máy đo pH.
\r\n\r\n5.2. Hệ thống lọc dung môi,
5.3. Bể siêu âm
\r\n\r\n5.4. Máy lắc quay,
5.5. Bộ lọc sợi thủy tinh,
5.6. Bông thủy tinh.
\r\n\r\n5.7. Cột thủy tinh dùng cho máy sắc ký,
5.8. Hệ thống lọc,
5.9. Nồi cách thủy,
5.10. Hệ thống HPLC
5.10.1. Bơm,
5.10.2. Hệ thống bơm,
5.10.3. Detector UV,
Có thể sử dụng detector mảng diot dùng cho\r\nmục đích khẳng định, nếu có sẵn.
\r\n\r\n5.10.4. Máy ghi.
\r\n\r\n5.10.5. Cột bảo vệ:
5.10.6. Cột phân tích
\r\n\r\nĐối với thức ăn chăn nuôi có chứa carbadox ít\r\nhơn 10 mg/kg khối lượng, thì sử dụng cột C18 nhồi silica với cỡ hạt\r\n5 µm, dài 200 mm, đường kính trong 3,0 mm, hoặc cột phân tích có chất lượng\r\ntương đương.
\r\n\r\nĐối với thức ăn chăn nuôi và hỗn hợp thức ăn\r\ncó chứa carbadox bằng hoặc lớn hơn 10 mg/kg khối lượng, thì sử dụng cột C18\r\nnhồi silica với cỡ hạt 5 µm, dài 300 mm, đường kính trong 3,0 mm, hoặc cột phân\r\ntích có chất lượng tương đương.
\r\n\r\nĐối với carbadox, phải thu được hệ số khả\r\nnăng (K’) ít nhất là 1,0.
\r\n\r\nTrong đó
\r\n\r\nK’ là hệ số khả năng;
\r\n\r\ntR
t0
5.10.7. Bơm nhu động
5.10.8. Cuộn phản ứng
5.10.9. Detector UV/Vis,
5.11. Bơm tiêm dùng một lần,
Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn\r\nnày, nên lấy mẫu theo TCVN 4325 (ISO 6497) [5].
\r\n\r\nMẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải đúng là mẫu\r\nđại diện. Mẫu không bị hư hỏng hoặc thay đổi trong suốt quá trình vận chuyển\r\nhoặc bảo quản.
\r\n\r\n\r\n\r\nChuẩn bị mẫu thử theo TCVN 6952 (ISO 6498).
\r\n\r\nNghiền mẫu phòng thử nghiệm (thường là 500 g)\r\nsao cho lọt hết qua sàng cỡ lỗ 1 mm. Trộn thật kỹ.
\r\n\r\n\r\n\r\n8.1. Yêu cầu chung
\r\n\r\nĐồng thời với việc phân tích mẫu thử (hoặc\r\ndẫy mẫu thử), tiến hành phân tích mẫu trắng và mẫu trắng thêm chuẩn. Nếu cần,\r\ncó thể phân tích mẫu đối chứng để kiểm tra hiệu suất của phương pháp.
\r\n\r\nPhụ lục A đưa ra biểu đồ trình tự của quy\r\ntrình.
\r\n\r\nĐối với các mẫu thử trắng, sử dụng phần mẫu\r\ncủa thức ăn đã đồng nhất có chứa ít hơn 0,1 mg/kg carbadox. Đối với mẫu trắng\r\nthêm chuẩn, sử dụng mẫu trắng có bổ sung carbadox. Mẫu trắng và mẫu đối chứng\r\ncó thể giữ được một năm nếu được bảo quản ở nhiệt độ 0
Đối với carbadox 50 mg/kg khối lượng độ thu\r\nhồi thấp hơn 91% hoặc cao hơn 103% thì phép phân tích cần được lặp lại.
\r\n\r\n8.2. Chuẩn bị mẫu thêm chuẩn
\r\n\r\nLượng carbadox trong mẫu thêm chuẩn nên gần\r\nbằng với lượng carbadox dự kiến có trong mẫu thử. Chuẩn bị mẫu thêm chuẩn chứa\r\n50 mg/kg carbadox như sau:
\r\n\r\nDùng pipet lấy 5,0 ml dung dịch gốc (4.8) cho\r\nvào bình nón 250 ml. Làm bay hơi đến khi còn khoảng 0,5 ml dưới dòng nitơ rồi\r\nthêm 10 g mẫu trắng. Trộn kỹ và để yên ít nhất 10 min trước khi tiến hành chiết\r\n(8.3).
\r\n\r\n8.3. Chiết
\r\n\r\n8.3.1. Thức ăn chăn nuôi chứa 0,1 mg/kg đến\r\n10 mg/kg carbadox
\r\n\r\nCân 10,0 g mẫu thử đã chuẩn bị, chính xác đến\r\n0,1 g, cho vào trong bình nón 250 ml. Thêm 50,0 ml dung môi chiết (4.4), đậy\r\nkín và lắc mạnh 30 min trên máy lắc quay (5.4). Lọc dung dịch qua bộ lọc sợi\r\nthủy tinh (5.5) và sử dụng phần dịch lọc để phân tích sắc ký cột theo 8.4.
\r\n\r\n8.3.2. Thức ăn chăn nuôi chứa từ 10 mg/kg đến\r\n100 mg/kg carbadox
\r\n\r\nCân 5,0 g mẫu thử đã chuẩn bị chính xác đến\r\n0,1 g cho vào bình nón 250 ml. Thêm 15,0 ml nước, trộn rồi để yên 5 min. Thêm\r\n35,0 ml dung môi chiết (4.2), sau đó đậy kín và lắc mạnh trong 30 min trên máy\r\nlắc quay (5.4). Lọc dung dịch qua bộ lọc sợi thủy tinh (5.5) và sử dụng dịch\r\nlọc để phân tích sắc ký cột theo 8.4.
\r\n\r\n8.3.3. Hỗn hợp thức ăn chăn nuôi chứa đến 2,0\r\n% carbadox
\r\n\r\nCân 1,0 g mẫu thử đã chuẩn bị, chính xác đến\r\n0,01 g, cho vào bình nón 250 ml. Thêm 15,0 ml nước, trộn và để yên 5 min. Thêm\r\n35,0 ml dung môi chiết (4.2) sau đó đậy kín và lắc mạnh 30 min trên máy lắc\r\nquay (5.4). Lọc dung dịch qua bộ lọc sợi thủy tinh (5.5).
\r\n\r\nPha loãng dịch lọc bằng dung môi pha loãng\r\n(4.3) thu được dung dịch cuối có carbadox trong khoảng 5 µg/ml đến 10 µg/ml\r\nphần khối lượng. Hệ số pha loãng là f.
\r\n\r\nTrộn kỹ và lọc dung dịch sử dụng hệ thống lọc\r\n(5.8). Sử dụng dịch lọc để phân tích HPLC theo 8.5.
\r\n\r\nHệ số pha loãng yêu cầu (f) có thể\r\nđược ước tính bằng cách sử dụng công thức:
\r\n\r\nTrong đó
\r\n\r\nfe là hệ số pha loãng yêu cầu ước\r\ntính của dịch chiết mẫu;
\r\n\r\nm là khối lượng của phần thử, tính bằng gam\r\n(g);
\r\n\r\nwe là phần khối lượng carbadox dự\r\nkiến có trong mẫu, tính bằng miligam trên kilogam (mg/kg);
\r\n\r\nrr là nồng độ carbadox yêu cầu có trong dung dịch cuối,\r\ntính bằng microgam trên mililit (µg/ml);
\r\n\r\nV là thể tích tổng của dung môi chiết thêm\r\nvào phần thử, tính bằng mililit (ml) (xem thêm 8.5.2.3).
\r\n\r\n8.3.4. Hỗn hợp thức ăn chăn nuôi chứa 2,0 %\r\nđến 10 % carbadox
\r\n\r\nCân 5,0 g mẫu thử đã chuẩn bị, chính xác đến\r\n5mg, cho vào bình nón 250 ml. Thêm 45,0 ml nước, trộn và để yên 5 min. Thêm\r\n105,0 ml dung môi chiết (4.2) đậy nắp và trộn. Đặt bình trong bể siêu âm (5.3)\r\n15 min. Lắc mạnh 15 min trên máy lắc quay (5.4). Lọc dung dịch qua bộ lọc sợi\r\nthủy tinh (5.5).
\r\n\r\nPha loãng dịch lọc bằng dung môi pha loãng\r\n(4.3) để thu được dung dịch cuối với phần khối lượng carbadox trong khoảng từ 5\r\nµg/ml đến 10 µg/ml. Hệ số pha loãng là f.
\r\n\r\nTrộn kỹ và lọc dung dịch sử dụng hệ thống lọc\r\n(5.8). Sử dụng dịch lọc để phân tích HPLC theo 8.5.
\r\n\r\nCHÚ THÍCH: Xem 8.3.3 về cách tính hệ số pha\r\nloãng ước tính.
\r\n\r\n8.4. Sắc ký cột
\r\n\r\n8.4.1. Để chiết mẫu, dùng cột thủy tinh (5.7) được\r\nnhồi khô bằng 4 g nhôm oxit (4.20), đáy cột được nút bằng bông thủy tinh (5.6).\r\nDùng 15 ml chất chiết, đã chuẩn bị theo 8.3.1 hoặc 8.3.2, cho vào cột và loại\r\nbỏ 2 ml dịch rửa giải đầu tiên.
\r\n\r\nĐối với mẫu chứa từ 0,1 mg/kg đến 10 mg/kg\r\ncarbadox, thì tiến hành theo 8.4.2.
\r\n\r\nĐối với mẫu chứa từ 10 mg/kg đến 100 mg/kg\r\ncarbadox, thì tiến hành theo 8.4.3.
\r\n\r\n8.4.2. Thu lấy 6 ml dịch rửa giải vào ống đong nhỏ\r\ncó chia vạch. Dùng pipet lấy 4 ml dịch rửa giải cho vào ống nghiệm hiệu chuẩn\r\nvà làm bay hơi dung môi đến gần khô, sử dụng nồi cách thủy hoặc bộ phận gia\r\nnhiệt (5.9) ở 40 °
8.4.3. Thu lấy 4 ml dịch rửa giải vào ống đong nhỏ\r\ncó chia vạch và lọc dung dịch qua hệ thống lọc (5.8). Sử dụng dịch lọc để phân\r\ntích HPLC theo 8.5.
\r\n\r\n8.5. Phân tích HPLC
\r\n\r\n8.5.1. Các điều kiện HPLC
\r\n\r\nXem Bảng 1
\r\n\r\n| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Cột phân tích \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Tốc độ dòng thể tích pha động \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Thể tích bơm \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Bước sóng \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Độ nhạy (chỉ thị) \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Máy ghi \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Tốc độ vẽ đồ thị \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n a ChromSpher và | \r\n ||
Các điều kiện nếu trong Bảng 1 chỉ mang tính chỉ\r\ndẫn, vì trong thực tế việc cài đặt sẽ liên quan đến cột và detector được sử\r\ndụng
\r\n\r\n8.5.2. Cách tiến hành
\r\n\r\n8.5.2.1. Bơm dung dịch làm việc carbadox (4.9)\r\nvào máy sắc ký cho đến khi đường nền ổn định và đến khi thu được chiều cao pic\r\nhoặc diện tích pic tái lập. Đối với chiều cao pic hoặc diện tích pic, chênh\r\nlệch giữa kết quả cao nhất và thấp nhất cần nhỏ hơn 5% kết quả trung bình của\r\nba lần bơm liên tiếp.
\r\n\r\nTrong phép phân tích hỗn hợp thức ăn chăn\r\nnuôi và thức ăn chăn nuôi chứa bằng hoặc nhiều hơn 10 mg/kg carbadox, sử dụng\r\ncác dung dịch làm việc carbadox (4.9).
\r\n\r\nTrong phép phân tích thức ăn chăn nuôi chứa\r\nít hơn 10 mg/kg carbadox, sử dụng các dung dịch làm việc carbadox nồng độ thấp\r\nhơn (4.10).
\r\n\r\nPic của carbadox phải đối xứng (fas\r\n< 2).
\r\n\r\nCHÚ THÍCH: fas là chiều rộng ở\r\nphía cuối đường vuông góc của pic, chia cho chiều rộng phía trước đường vuông\r\ngóc của pic, cả hai được đo ở vị trí 10 % chiều cao pic.
\r\n\r\n8.5.2.2. Giữa các nồng độ và chiều cao pic của\r\nhai dung dịch làm việc carbadox phải có mối tương quan tỷ lệ thuận (trong phạm\r\nvi 5%). Nếu chênh lệch lớn hơn 5% thì cần phải chuẩn bị các dung dịch làm việc\r\ncarbadox mới.
\r\n\r\nBơm các chất chiết mẫu trắng, mẫu trắng thêm\r\nchuẩn và dung dịch làm việc dimetridazol (4.13), sulfadimidin (4.16) và nitrofurazon\r\n(4.9). Nếu pic carbadox không đối xứng hoặc không tách hoàn toàn khỏi các pic của\r\nchất nền hoặc pic của các dung dịch chuẩn được bơm thì cần sử dụng cột HPLC\r\nkhác hoặc điều chỉnh các điều kiện sắc ký bằng cách tăng hoặc giảm hàm lượng\r\nnước của pha động (4.6).
\r\n\r\nBơm lần lượt các dung dịch làm việc carbadox\r\n(4.9 hoặc 4.10), năm dịch chiết mẫu và bơm lại các dung dịch làm việc carbadox.\r\nLặp lại trình tự này đối với các dãy chất chiết mẫu khác, nếu cần.
\r\n\r\nChiều cao pic hoặc diện tích pic quan sát\r\nđược đối với các dung dịch làm việc carbadox cần nằm trong khoảng 5% các kết\r\nquả của các dung dịch làm việc carbadox được bơm vào trước đó.
\r\n\r\n8.5.2.3. Nếu phần khối lượng carbadox trong\r\nhỗn hợp thức ăn chăn nuôi thấp hơn nhiều so với phần khối lượng dự kiến (có\r\ntính đến dung sai), thì nên lặp lại các bước phân tích theo 8.3.3 hoặc 8.3.4 có\r\nbổ sung 50 ml dung môi chiết gồm 35 ml dung môi chiết (4.2) và 15,0 ml nước.
\r\n\r\nNếu phần khối lượng carbadox mới thu được lớn\r\nhơn 15% so với giá trị ban đầu, thì cần lặp lại phép phân tích với 50 ml dung\r\nmôi chiết khác đã mô tả ở trên. Việc xác định bổ sung này cần được lặp lại cho\r\nđến khi chênh lệch kết quả của các lần xác định liên tiếp carbadox nhỏ hơn 15%.
\r\n\r\n\r\n\r\n9.1. Yêu cầu chung
\r\n\r\nNếu việc nhận biết của chất cần phân tích có\r\npic trong sắc ký phổ còn chưa rõ ràng dựa vào hình dạng pic hoặc dựa vào kết\r\nquả thu được, thì việc nhận biết này cần được khẳng định lại bằng cách áp dụng\r\nđồng sắc ký hoặc detector mảng diot. Nếu khẳng định bằng đồng sắc ký thì tiến\r\nhành theo 9.2 còn sử dụng detector mảng diot thì tiến hành theo 9.3. Ngoài ra,\r\nsự có mặt của carbadox có thể được khẳng định bằng cách sử dụng việc tạo dẫn\r\nxuất sau cột với dung dịch natri hydroxit (xem 9.4).
\r\n\r\n9.2. Đồng sắc ký
\r\n\r\nChuẩn bị dịch chiết mẫu có bổ sung chuẩn bằng\r\ncách thêm một lượng thích hợp của dung dịch làm việc carbadox (4.10) vào dịch\r\nchiết mẫu. Lượng carbadox được thêm vào phải gần bằng lượng carbadox dự kiến có\r\ntrong dịch chiết mẫu.
\r\n\r\nBơm dịch chiết mẫu, dung dịch làm việc\r\ncarbadox (4.10) và dịch chiết mẫu thêm chuẩn. Chỉ có pic trong sắc ký được coi\r\nlà pic của chất phân tích có tăng lên tỷ lệ thuận với mức thêm vào và việc tăng\r\nchiều rộng của pic tại một nửa chiều cao không lớn hơn ± 10% chiều rộng ban đầu.
\r\n\r\nTiến hành tiếp theo Điều 10.
\r\n\r\n9.3. Detector mảng diot
\r\n\r\n9.3.1. Điều kiện
\r\n\r\nCác điều kiện được mô tả trong 8.5.1, tuy\r\nnhiên detector mảng diot được sử dụng thay cho detector UV, xem Bảng 2.
\r\n\r\n| \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Bước sóng mẫu \r\n | \r\n \r\n 365 nm \r\n | \r\n
| \r\n Độ rộng băng tần mẫu \r\n | \r\n \r\n 4 nm (nghĩa là bước sóng 365 nm ± 2 nm) \r\n | \r\n
| \r\n Bước sóng đối chứng \r\n | \r\n \r\n 450 nm \r\n | \r\n
| \r\n Độ rộng băng tần đối chứng \r\n | \r\n \r\n 100 nm \r\n | \r\n
| \r\n Dải quang phổ \r\n | \r\n \r\n 225 nm đến 400 nm \r\n | \r\n
| \r\n Phổ \r\n | \r\n \r\n đường nền, đỉnh, điểm uốn lên và điểm uốn\r\n xuống \r\n | \r\n
9.3.2. Cách tiến hành
\r\n\r\nĐể cho hệ thống ổn định. Bơm 2 µg/ml dung\r\ndịch làm việc carbadox (4.10), dịch chiết mẫu còn nghi ngờ và bơm tiếp 2 µg/ml\r\ndung dịch làm việc carbadox (4.10). Ghi lại phổ ở đường nền, điểm uốn lên và\r\nđiểm uốn xuống và đỉnh pic. Lưu giữ tất cả các dữ liệu.
\r\n\r\n9.3.3. Đánh giá
\r\n\r\nVẽ trong một hình các phổ khác nhau đã chuẩn\r\nhóa (mẫu – đường nền) của pic mẫu, đã ghi lại ở đỉnh và ở điểm uốn lên và điểm\r\nuốn xuống.
\r\n\r\nVẽ trong một hình các phổ đã chuẩn hóa của\r\npic mẫu và của pic dung dịch làm việc carbadox được ghi lại ở đỉnh.
\r\n\r\n9.3.4. Tiêu chí khẳng định
\r\n\r\nViệc nhận biết chất phân tích được khẳng định\r\nnếu thỏa mãn các tiêu chí sau đây:
\r\n\r\na) Thời gian lưu của pic mẫu phải bằng (± 5%)\r\nthời gian lưu của pic chuẩn. Trong trường hợp còn nghi ngờ thì phải thêm chuẩn\r\n(chất chuẩn được thêm vào mẫu).
\r\n\r\nb) Đánh giá độ tinh khiết của pic mẫu theo sự\r\nphù hợp của chênh lệch phổ, được ghi lại ở đỉnh và ở điểm uốn lên và điểm uốn\r\nxuống. Ở mỗi bước sóng độ hấp thụ tương đối phải ngang bằng (trong khoảng 15%)\r\nđối với tất cả các phổ.
\r\n\r\nc) Đối với các phần của phổ với độ hấp thụ\r\ntương đối nhỏ nhất 10% chênh lệch phổ của pic mẫu và pic chuẩn được ghi lại ở\r\nđỉnh pic không được có sự khác biệt đáng kể. Tiêu chí này được đáp ứng khi các\r\ngiá trị cực đại cùng có mặt trong một biên độ xác định bởi độ phân giải của hệ\r\nthống detector (điển hình từ 2 nm đến 4 nm). Không được có điểm quan sát nào có\r\nđộ lệch giữa hai phổ vượt quá 15% độ hấp thụ của chất chuẩn ở bước sóng cụ thể.
\r\n\r\n9.4. Dẫn xuất sau cột
\r\n\r\n9.4.1. Yêu cầu chung
\r\n\r\nBằng chứng bổ sung về sự có mặt của carbadox,\r\nđặc biệt là trong các mẫu chứa ít hơn 5 mg/kg, có thể tìm được bằng cách áp\r\ndụng dẫn xuất sau cột đặc thù cho carbadox. Trong trường hợp này tiến hành như\r\nsau.
\r\n\r\nDùng khớp nối chữ T và một bơm nhu động\r\n(5.10.7), sau cột phân tích và trước cuộn phản ứng (5.10.8), thêm dung dịch\r\nnatri hydroxit (4.23) vào pha động. Độ hấp thụ cực đại của carbadox sẽ dịch\r\nchuyển đến bước sóng 420 nm.
\r\n\r\n9.4.2. Điều kiện
\r\n\r\nXem Bảng 3.
\r\n\r\n| \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Tốc độ dòng thể tích thuốc thử \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Bước sóng \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Thể tích bơm \r\n | \r\n \r\n | \r\n
10.1. Yêu cầu chung
\r\n\r\nTính phần khối lượng carbadox trong mẫu bằng\r\ncách so sánh chiều cao píc hoặc diện tích píc của chất chiết mẫu với trung bình\r\ncủa chiều cao pic hoặc diện tích pic của các dung dịch làm việc carbadox được\r\nbơm vào trước và sau mẫu. Sử dụng các kết quả thu được với dung dịch làm việc\r\ncarbadox có phần khối lượng phù hợp nhất của carbadox.
\r\n\r\n10.2. Thức ăn chăn nuôi chứa từ 0,1 mg/kg đến\r\n10 mg/kg carbadox
\r\n\r\nTính phần khối lượng carbadox (wc)\r\ntrong mẫu thức ăn chăn nuôi bằng công thức:
\r\n\r\nTrong đó:
\r\n\r\nwc
h là chiều cao pic thu được đối với chất chiết\r\nmẫu, tính bằng đơn vị độ dài;
\r\n\r\nhs
ρs
V là thể tích tổng số của dung môi chiết được\r\nthêm vào phần mẫu thử, tính bằng mililit (ml);
\r\n\r\nm là khối lượng của phần thử, tính bằng gam\r\n(g).
\r\n\r\nNgoài ra, có thể sử dụng diện tích pic trong\r\ntính toán thay cho chiều cao pic và sử dụng phương pháp hồi quy tuyến tính để\r\ntính hàm lượng carbadox trong chất chiết mẫu.
\r\n\r\nLàm tròn kết quả đến 0,1 mg/kg.
\r\n\r\n10.3. Thức ăn chăn nuôi chứa từ 10 mg/kg đến\r\n100 mg/kg carbadox
\r\n\r\nTính phần khối lượng carbadox (wc)\r\ntrong mẫu thức ăn chăn nuôi bằng công thức:
\r\n\r\nÝ nghĩa của các ký hiệu giống như trong 10.2.
\r\n\r\nNgoài ra, có thể sử dụng diện tích pic trong\r\ntính toán thay cho chiều cao pic và sử dụng hồi quy tuyến tính để tính hàm lượng\r\ncarbadox trong chất chiết mẫu.
\r\n\r\nLàm tròn kết quả đến 1 mg/kg.
\r\n\r\n10.4. Premix chứa đến 10 % carbadox
\r\n\r\nTính phần khối lượng carbadox (wcp)\r\ntrong mẫu premix bằng công thức:
\r\n\r\nTrong đó
\r\n\r\nwcp là phần khối lượng carbadox\r\ntrong mẫu premix, tính bằng phần trăm (%);
\r\n\r\nws là nồng độ carbadox trong dung\r\ndịch làm việc carbadox, tính bằng microgam trên mililit (
f là hệ số pha loãng của chất chiết mẫu (xem\r\n8.3.3 hoặc 8.3.4);
\r\n\r\nfu là hệ số hiệu chỉnh đơn vị (fu\r\n= 1 kg.mg-1.%).
\r\n\r\nÝ nghĩa của các ký hiệu giống như trong 10.2.
\r\n\r\nNgoài ra, có thể sử dụng diện tích pic trong\r\ntính toán thay cho chiều cao pic và sử dụng hồi quy tuyến tính để tính nồng độ\r\ncarbadox trong chất chiết mẫu.
\r\n\r\nLàm tròn kết quả đến 0,01 %.
\r\n\r\n\r\n\r\n11.1. Thử liên phòng thử nghiệm
\r\n\r\nCác chi tiết của phép thử liên phòng thử\r\nnghiệm về độ chụm của phương pháp, bao gồm chú thích về tính hợp lệ của các số\r\nliệu độ chụm, được đưa ra trong Phụ lục B. Các giá trị thu được từ phép thử\r\nliên phòng thử nghiệm này có thể không áp dụng cho các dải nồng độ và chất nền\r\nkhác với các dải nồng độ và chất nền đã nêu.
\r\n\r\n11.2. Độ lặp lại
\r\n\r\nChênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả của hai\r\nphép thử đơn lẻ độc lập, thu được khi sử dụng cùng phương pháp trên vật liệu\r\nthử giống hệt nhau trong cùng một phòng thử nghiệm, do một người thực hiện, sử\r\ndụng cùng thiết bị, thực hiện trong một khoảng thời gian ngắn, không quá 5% các\r\ntrường hợp lớn hơn:
\r\n\r\na) 10 % trung bình của hai kết quả thử đối\r\nvới phần khối lượng carbadox đến 50 mg/kg;
\r\n\r\nb) 14 % giá trị trung bình của hai kết quả\r\nthử đối với phần khối lượng carbadox trong khoảng từ 1% đến 10%.
\r\n\r\n11.3. Độ tái lập
\r\n\r\nChênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả của hai\r\nphép thử độc lập, thu được khi sử dụng cùng phương pháp, tiến hành thử trên vật\r\nliệu giống nhau trong các phòng thử nghiệm khác nhau, do các nhà phân tích khác\r\nnhau, sử dụng các thiết bị khác nhau thực hiện, không quá 5% các trường hợp lớn\r\nhơn:
\r\n\r\na) 25% trung bình của hai kết quả thử đối với\r\nphần khối lượng carbadox đến 50 mg/kg;
\r\n\r\nb) 18% trung bình của hai kết quả thử đối với\r\nphần khối lượng carbadox trong khoảng từ 1% đến 10%.
\r\n\r\n\r\n\r\nBáo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:
\r\n\r\na) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy\r\nđủ về mẫu thử;
\r\n\r\nb) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;
\r\n\r\nc) phương pháp thử đã dùng, cũng như viện dẫn\r\ntiêu chuẩn này;
\r\n\r\nd) tất cả các chi tiết thao tác không quy\r\nđịnh trong tiêu chuẩn này, hoặc tùy chọn cùng với các chi tiết bất thường nào\r\nkhác có thể ảnh hưởng tới kết quả;
\r\n\r\ne) kết quả thử thu được, hoặc nếu độ lặp lại\r\nđược kiểm tra thì nêu hai kết quả cuối cùng thu được.
\r\n\r\n\r\n\r\n
![](\"00911990_files/image006.gif\")
\r\n\r\n
Độ chụm của phương pháp được thiết lập bởi\r\nphép thử liên phòng thử nghiệm được tiến hành ở Hà Lan phù hợp với TCVN 6910-2\r\n(ISO 5725-2) [4]. Trong phép thử này có 8 phòng thử nghiệm tham gia và 13 mẫu\r\nđược kiểm tra đánh giá.
\r\n\r\nCác dữ liệu về độ chụm thu được cho thấy số\r\nphòng thử nghiệm (7) được giữ lại sau khi trừ ngoại lệ hoàn toàn không đáp ứng\r\nđược yêu cầu của IUPAC-AOAC (cần ít nhất là kết quả của 8 phòng thử nghiệm sau\r\nkhi đã trừ các ngoại lệ). Tuy nhiên, các số liệu về kết quả của độ chụm có thể\r\nđược chấp nhận để sử dụng trong thực tế, mặc dù mức xác suất của giới hạn độ\r\nlặp lại và độ tái lập sẽ nhỏ hơn 95%.
\r\n\r\n| \r\n | \r\n \r\n | \r\n |||||
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n |||||
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n |
| \r\n Số phòng thử nghiệm được giữ lại sau khi đã\r\n trừ ngoại lệ \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Phần khối lượng trung bình của carbadox,\r\n mg/kg \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Độ lệch chuẩn lặp lại (sr),\r\n mg/kg \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Hệ số biến thiên lặp lại, % \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Giới hạn độ lặp lại (r) [r = 2,8sr],\r\n mg/kg \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Độ lệch chuẩn tái lập (sR),\r\n mg/kg \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Hồ số biến thiên tái lập, % \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Giới hạn độ tái lập (R) [R=2,8 sR]\r\n mg/kg \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n a b | \r\n ||||||
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n ||||||
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n |
| \r\n Số phòng thử nghiệm còn lại sau khi trừ\r\n ngoại lệ \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Phần khối lượng trung bình của carbadox, % \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Độ lệch chuẩn lặp lại (sr), % \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Hệ số biến thiên lặp lại, % \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Giới hạn lặp lại (r) [r = 2,8 sr],\r\n % \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Độ lệch chuẩn tái lập (sR), % \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Hồ sơ biến thiên tái lập, % \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Giới hạn tái lập (R) [R = 2,8 sR],\r\n % \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n a 5,6 và 7: premix với carbadox khoảng 10%\r\n khối lượng. \r\n | \r\n |||||||
[1] SOP A0394, State Institute for Quality\r\nControl of Agricultural Products (RIKILT-DLO). Agricultural Reseach\r\nDepartment, The Netherlands.
\r\n\r\n[2] LowiE, Jr., D.M., TEAGUE, Jr., R.T.\r\nQUICK, F.E., and FOSTER, C.L. J. Assoc. Off. Anal. Chem., 66,\r\n1983, pp. 602-605.
\r\n\r\n[3] TCVN 6910-1:2001 (ISSO 5725-1:1994) Độ\r\nchính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo - Phần 1:\r\nNguyên tắc và định nghĩa chung.
\r\n\r\n[4] TCVN 6910-2:2001 (ISO 5725-2:1994) Độ\r\nchính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo - Phần 2: Phương\r\npháp cơ bản xác định độ lặp lại và độ tái lập của phương pháp đo tiêu chuẩn.
\r\n\r\n[5] TCVN 4325 (ISO 6497), Thức ăn chăn\r\nnuôi – Lấy mẫu.
\r\n\r\n[6] AERTS, M.M.L. and WERDMULLER, G.A. J.\r\nAssoc. Off. Anal. Chem., 71, 1988, pp. 484-490.
\r\n\r\nFile gốc của Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 9128:2011 (ISO 14939:2001) về Thức ăn chăn nuôi – Xác định hàm lượng carbadox – Phương pháp sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao đang được cập nhật.
Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 9128:2011 (ISO 14939:2001) về Thức ăn chăn nuôi – Xác định hàm lượng carbadox – Phương pháp sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao
Tóm tắt
| Cơ quan ban hành | Đã xác định |
| Số hiệu | TCVN9128:2011 |
| Loại văn bản | Tiêu chuẩn Việt Nam |
| Người ký | Đã xác định |
| Ngày ban hành | 2011-01-01 |
| Ngày hiệu lực | |
| Lĩnh vực | Nông nghiệp |
| Tình trạng | Còn hiệu lực |