Lời nói đầu
\r\n\r\nTCVN 8741:2011
TCVN 8741:2011
\r\n\r\n
Tiêu chuẩn này áp dụng cho việc\r\nbảo quản ngắn hạn giống vi sinh vật
TCVN 8565:2010, Phân\r\nbón vi sinh vật - Phương pháp xác định hoạt tính phân giải phốt phát của vi sinh\r\nvật.
\r\n\r\nTCVN 8566:2010, Phân\r\nbón vi sinh vật - Phương pháp xác định hoạt tính đối kháng nấm gây bệnh vùng rễ\r\ncây trồng cạn.
\r\n\r\n\r\n\r\nTrong tiêu chuẩn này sử dụng các thuật ngữ và định nghĩa\r\nsau:
\r\n\r\n3.1 Bảo\r\nquản vi sinh vật nông nghiệp (preservation of agricultural microorganism)
\r\n\r\nBảo quản\r\ncác giống vi sinh vật nông nghiệp thuần, trong điều kiện phù hợp, bảo đảm không\r\nbị tạp nhiễm, tỷ\r\nlệ sống không nhỏ hơn 50% và bảo tồn hoạt tính sinh\r\nhọc ban đầu.
\r\n\r\n3.2 Hoạt\r\ntính sinh học của vi sinh vật (bioactivity of agricultural microorganism)
\r\n\r\nKhả năng\r\ncủa vi sinh vật thông qua hoạt động sống của chúng có tác động đến quá trình\r\nsinh trưởng, phát triển của cây trồng, kiểm soát sinh học và sinh thái môi\r\ntrường.
\r\n\r\n3.3 Vi sinh vật tạp
Quần thể vi sinh vật\r\nkhông đồng nhất về hình thái tế bào và khuẩn lạc so với giống vi sinh vật ban\r\nđầu.
\r\n\r\nTỷ lệ\r\nphần trăm giữa lượng tế bào/bào tử tại thời điểm kiểm tra mẫu bảo quản và tại\r\nthời điểm bắt đầu bảo quản.
\r\n\r\n4.1 Môi\r\ntrường
\r\n\r\nCó thể sử\r\ndụng môi trường có bán sẵn trên thị trường hoặc một trong các môi trường dưới\r\nđây:
\r\n\r\n4.1.1 Môi\r\ntrường để nuôi cấy vi khuẩn
\r\n\r\nXem Điều A.1\r\nPhụ lục A.
\r\n\r\n- Môi\r\ntrường Ashby
\r\n\r\nXem Điều A.2\r\nPhụ lục A.
\r\n\r\n- Môi\r\ntrường DAC
\r\n\r\nXem Điều A.3\r\nPhụ lục A.
\r\n\r\n- Môi\r\ntrường Pikovskya
\r\n\r\nXem Điều A.4\r\nPhụ lục A.
\r\n\r\n- Môi\r\ntrường SPA (Sucrose Peptone Agar)
\r\n\r\nXem Điều A.5\r\nPhụ lục A.
\r\n\r\n- Môi\r\ntrường Czapeck
\r\n\r\nXem Điều A.6\r\nPhụ lục A.
\r\n\r\n- Môi\r\ntrường Czapeck – Dox
\r\n\r\nXem Điều A.7\r\nPhụ lục A.
\r\n\r\n- Môi\r\ntrường PDA (Potato Dextrose Agar)
\r\n\r\nXem Điều A.8\r\nPhụ lục A.
\r\n\r\n- Môi\r\ntrường Gause
\r\n\r\nXem Điều A.9\r\nPhụ lục A.
\r\n\r\nXem Điều A.10\r\nPhụ lục A.
\r\n\r\nXem Điều A.11\r\nPhụ lục A.
\r\n\r\n\r\n\r\nSử dụng\r\ncác thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm vi sinh thông thường và cụ thể như\r\nsau:
\r\n\r\n5.1 Tủ cấy vô trùng
5.2
5.3
5.4
5.5
5.6
5.7
5.8 Máy trộn (Vortex),
5.9
5.10 Bình tam giác,
5.11 Ống đong,
5.12 Đĩa Petri,
5.13 Que cấy.
\r\n\r\n5.14 Que gạt mẫu (bàn\r\ntrang).
\r\n\r\n5.15
6.1 Chuẩn\r\nbị
\r\n\r\n6.1.1 Dụng\r\ncụ
\r\n\r\nCác dụng\r\ncụ dùng trong nuôi cấy, bảo quản vi sinh vật phải được khử trùng bằng một trong\r\nhai cách sau:
\r\n\r\n-
-
6.1.2 Môi\r\ntrường nuôi cấy
\r\n\r\nCân và\r\nhòa tan các thành phần môi trường trong nước cất theo thứ tự đã cho (Phụ lục A).\r\n
\r\n\r\n6.1.2.1 Môi\r\ntrường cho bảo quản
\r\n\r\nPhân phối\r\ncác lượng từ 4 ml đến 6 ml môi trường vào các ống nghiệm, đậy nút, khử trùng 30\r\nmin ở 121 OC trong nồi hấp áp lực (5.2), làm nguội đến 50 OC,\r\nđặt nghiêng ống nghiệm khoảng 45O, để yên cho đông đặc, đợi bề mặt\r\nthạch khô tiến hành cấy giống.
\r\n\r\n6.1.2.2 Môi\r\ntrường cho kiểm tra
\r\n\r\nPhân phối\r\nmôi trường vào bình tam giác, đậy nút bông, khử trùng 30 min ở 121 OC\r\ntrong nồi hấp áp lực (5.2), làm nguội đến 50 OC, phân phối các lượng\r\ntừ 15 ml đến 20 ml môi trường vào các đĩa Petri đã chuẩn bị sẵn (6.1.1); tiến\r\nhành trong tủ cấy vô trùng (5.1).
\r\n\r\n6.1.3 Parafin\r\nlỏng
\r\n\r\nParafin lỏng\r\nđược khử trùng 30 min ở 121 OC trong nồi hấp áp lực\r\n(5.2), sau đó để ở nhiệt phòng cho bay hết nước lẫn\r\ntrong dầu.
\r\n\r\n6.1.4 Dung dịch pha\r\nloãng
\r\n\r\nCân\r\nvà hòa tan các thành phần trong nước cất.
\r\n\r\nPhân\r\nphối dung dịch pha loãng vào các ống nghiệm/bình tam giác có dung tích thích\r\nhợp với một lượng sao cho sau khi khử trùng, mỗi ống nghiệm chứa 9 ml, mỗi bình\r\ntam giác chứa 90 ml. Đậy nút và khử trùng ở 121
6.2 Bảo\r\nquản trên môi trường thạch nghiêng
\r\n\r\n6.2.1\r\nNuôi cấy
\r\n\r\nC
Nuôi cấy\r\ntrong điều kiện thích hợp (từ 28 OC đến 30 OC không ít\r\nhơn 2 ngày đối với vi khuẩn, từ 28 OC đến 30 OC không ít\r\nhơn 3 ngày đối với nấm sợi và từ 35 OC đến 37 OC không ít\r\nhơn 5 ngày đối với xạ khuẩn) để vi sinh vật phát triển đồng đều trên vết cấy.
\r\n\r\nĐịnh kỳ\r\nsau 1 tháng - 2 tháng bảo quản, kiểm tra lại tỷ lệ sống, độ tạp của vi sinh vật
6.2.3\r\nKiểm tra mẫu
\r\n\r\n6.2.3.1\r\nTỷ lệ sống của vi sinh vật
\r\n\r\na. Chuẩn\r\nbị dung dịch huyền phù vi khuẩn
\r\n\r\nLấy mẫu\r\nbảo quản cần kiểm tra ra khỏi nhiệt độ bảo quản. Khi nhiệt độ của mẫu bảo quản\r\nbằng nhiệt độ phòng thí nghiệm, tiến hành kiểm tra mẫu. Lấy toàn bộ sinh khối\r\nvi sinh vật từ mẫu bảo quản cho vào bình tam giác chứa 90 ml dịch pha loãng đã\r\nchuẩn bị sẵn (6.1.4), trộn đều bằng máy lắc hay máy trộn Vortex
Lấy 1 ml dung\r\ndịch huyền phù ban đầu cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha loãng đã\r\nchuẩn bị sẵn (6.1.4), tránh chạm đầu côn vào dung dịch pha loãng. Trộn kỹ bằng\r\nmáy trộn Vortex
b. Cấy\r\nmẫu
\r\n\r\nLấy
Dùng que\r\ngạt vô trùng gạt đều cho đến khi dung dịch huyền phù thấm đều trên bề mặt\r\nthạch, đợi khô bề mặt thạch, úp ngược đĩa Petri, nuôi trong tủ ấm ở điều kiện\r\nthích hợp (từ 28 OC đến 30 OC không ít hơn 2 ngày đối với\r\nvi khuẩn, từ 28 OC đến 30 OC không ít hơn 3 ngày đối với\r\nnấm sợi và từ 35 OC đến 37 OC không ít hơn 5 ngày đối với\r\nxạ khuẩn).
\r\n\r\nc. Tính\r\nkết quả
\r\n\r\nĐếm số lượng khuẩn lạc đặc trưng của mẫu bảo quản trên\r\nmỗi đĩa Petri.
\r\n\r\nMật độ vi sinh vật trong một đơn\r\nvị kiểm tra được\r\ntính bằng đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU) trên ml, theo công thức (1).
\r\n\r\nN =
trong đó:
\r\n\r\nN là số vi sinh vật trong một đơn vị\r\nkiểm tra (được tính bằng CFU trên ml);
\r\n\r\nåC
n1
n2
d là hệ số pha loãng tương ứng với độ\r\npha loãng thứ nhất.
\r\n\r\nCHÚ THÍCH 1:
\r\n\r\n1) Giữ lại các đĩa có chứa không quá 300\r\nkhuẩn lạc ở hai độ pha loãng kế tiếp nhau và điều cần thiết là một trong các\r\nđĩa này có chứa ít nhất 15 khuẩn lạc;
\r\n\r\n2) Làm tròn kết quả đến hai chữ số có nghĩa;
\r\n\r\n3) Biểu thị mật độ vi sinh vật trên một đơn\r\nvị kiểm tra bằng cách lấy một trong các giá trị từ 1,00 đến 9,99 nhân với 10x,\r\ntrong đó x là số mũ của 10.
\r\n\r\n- Tỷ lệ\r\nsống của vi sinh vật được tính theo công thức (2):
\r\n\r\nR
trong đó:
\r\n\r\nR
N1 là mật độ tế bào vi\r\nsinh vật trong mẫu thí nghiệm sau bảo quản (được tính bằng đơn vị hình thành\r\nkhuẩn lạc (CFU) trên ml);
\r\n\r\nNo là mật độ tế bào vi\r\nsinh vật trong mẫu thí nghiệm trước bảo quản (được tính bằng đơn vị hình thành\r\nkhuẩn lạc (CFU) trên ml).
\r\n\r\n6.2.3.2 Xác\r\nđịnh hoạt tính sinh học của vi sinh vật
\r\n\r\nXác định\r\nhoạt tính cố định nitơ của vi sinh vật theo TCVN\r\n8564:2010
\r\n\r\nXác định\r\nhoạt tính phân giải phốt phát của vi sinh vật theo TCVN\r\n8565:2010 hay TCVN 6167:1996. Trong đó xác định hoạt tính phân giải phốt phát\r\ntheo TCVN 8565:2010 là phương pháp trọng tài.
\r\n\r\nXác định\r\nhoạt tính phân giải xenlulo của vi sinh vật theo TCVN\r\n6168:2002
\r\n\r\nXác định\r\nhoạt tính ức chế nấm gây bệnh cây trồng cạn của vi sinh vật theo
Xác định\r\nhoạt tính ức chế vi khuẩn gây bệnh cây trồng cạn của vi sinh\r\nvật (xem phụ lục B)
\r\n\r\n6.3 Bảo quản dưới lớp\r\ndầu khoáng
\r\n\r\n6.3.1 Nuôi cấy
\r\n\r\nCấy một vòng que cấy giống vi sinh vật\r\nvào ống nghiệm chứa môi trường nuôi cấy thích hợp đã chuẩn bị sẵn (6.1.2.1),\r\ntiến hành trong tủ cấy vô trùng (5.1).
\r\n\r\n- Nuôi cấy trong điều\r\nkiện thích hợp (từ 28 OC đến 30 OC\r\nkhông ít hơn 2 ngày đối với vi khuẩn, từ 28 OC đến 30 OC\r\nkhông ít hơn 3 ngày đối với nấm sợi và từ 35 OC đến 37 OC\r\nkhông ít hơn 5 ngày đối với xạ khuẩn) để vi sinh vật phát triển đồng đều trên\r\nvết cấy.
\r\n\r\n-\r\nĐổ parafin lỏng đã chuẩn bị sẵn (6.1.3) lên bề mặt thạch nghiêng đã cấy giống\r\nvi sinh vật sao cho khi dựng đứng ống thạch lên thì bề mặt lớp parafin lỏng cách\r\nmép trên của lớp thạch khoảng 1 cm, tiến hành trong tủ cấy vô trùng (5.1).
\r\n\r\n6.3.2 Bảo\r\nquản
\r\n\r\nBảo quản\r\nở điều kiện nhiệt độ từ 4 OC đến 10 OC.
\r\n\r\nĐịnh kỳ\r\nsau 3 tháng - 4 tháng bảo quản, kiểm tra tỷ lệ sống, độ tạp của vi sinh vật.\r\nNếu tỷ lệ sống của vi sinh vật không lớn hơn 50 % thì phải tiến hành cấy truyền\r\nlại. Nếu mẫu vi sinh vật bị tạp nhiễm thì loại bỏ.
\r\n\r\n6.3.3\r\nKiểm tra mẫu
\r\n\r\n6.3.3.1\r\nTỷ lệ sống của vi sinh vật (xem 6.2.3.1)
\r\n\r\nCHÚ THÍCH 3: Cần loại\r\nbỏ toàn bộ lớp parafin lỏng trước khi lấy sinh khối vi sinh. Dùng micropipet\r\nhút hết lớp parafin lỏng trong ống bảo quản, sau đó dùng giấy lọc thấm khô hết parafin\r\nlỏng dính trên bề mặt ống bảo quản.
\r\n\r\n6.3.3.2 Hoạt\r\ntính sinh học của vi sinh vật (xem 6.2.3.2)
\r\n\r\n\r\n\r\n
A.1
| \r\n K2HPO4 \r\n | \r\n \r\n 0,5 g \r\n | \r\n
| \r\n MgSO4.7H2O \r\n | \r\n \r\n 0,2 g \r\n | \r\n
| \r\n NaCl \r\n | \r\n \r\n 0,1 g \r\n | \r\n
| \r\n Ma | \r\n \r\n 10,0 g \r\n | \r\n
| \r\n Cao\r\n nấm men \r\n | \r\n \r\n 0,5 g \r\n | \r\n
| \r\n CaCO3 \r\n | \r\n \r\n 0,5 g \r\n | \r\n
| \r\n Dung\r\n dịch công gô đỏ 1% \r\n | \r\n \r\n 2,5 ml \r\n | \r\n
| \r\n Thạch \r\n | \r\n \r\n 20,0\r\n g \r\n | \r\n
| \r\n Nước\r\n cất vừa đủ \r\n | \r\n \r\n 1000 ml \r\n | \r\n
| \r\n pH\r\n \r\n | \r\n \r\n 6,8 đến 7,0 \r\n | \r\n
A.
| \r\n | \r\n \r\n 20,0g \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n 0,2 g \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n 0,2 g \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n 0,2 g \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n 0,1 g \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n 5,0 g \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n 20,0\r\n g \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n 1000 ml \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n 6,8 đến 7,0 \r\n | \r\n
A.
| \r\n | \r\n \r\n 5,0 g \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n 0,5 g \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n 0,05 g \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n 0,01 g \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n 0,1 g \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n 0,02 g \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n 0,01 g \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n 0,002 g \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n 2,0 ml \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n 2,5 ml \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n 20,0\r\n g \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n 1000 ml \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n 6,8 đến 7,0 \r\n | \r\n
CHÚ\r\nTHÍCH A.3:
A.
| \r\n | \r\n \r\n 10,0 g \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n 5,0 g \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n 0,5 g \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n 0,2 g \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n 0,1 g \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n vết \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n vết \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n 0,5 g \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n 20,0\r\n g \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n 1000 ml \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n 6,8 đến 7,0 \r\n | \r\n
A.
| \r\n Sacaroza \r\n | \r\n \r\n 20,0 g \r\n | \r\n
| \r\n Pepton \r\n | \r\n \r\n 5,0 g \r\n | \r\n
| \r\n K2HPO4\r\n \r\n | \r\n \r\n 0,5 g \r\n | \r\n
| \r\n MgSO4.7H2O \r\n | \r\n \r\n 0,25 g \r\n | \r\n
| \r\n Thạch \r\n | \r\n \r\n 20,0\r\n g \r\n | \r\n
| \r\n Nước\r\n cất vừa đủ \r\n | \r\n \r\n 1000 ml \r\n | \r\n
| \r\n pH\r\n \r\n | \r\n \r\n 6,8 đến 7,0 \r\n | \r\n
A.6 Môi trường Czapek
\r\n\r\n| \r\n NaNO3\r\n \r\n | \r\n \r\n 3,0 g \r\n | \r\n
| \r\n Sacaroza \r\n | \r\n \r\n 30,0 g \r\n | \r\n
| \r\n KH2PO4\r\n \r\n | \r\n \r\n 1,0 g \r\n | \r\n
| \r\n MgSO4.7H2O \r\n | \r\n \r\n 0,5 g \r\n | \r\n
| \r\n Thạch \r\n | \r\n \r\n 20,0\r\n g \r\n | \r\n
| \r\n Nước\r\n cất vừa đủ \r\n | \r\n \r\n 1000 ml \r\n | \r\n
| \r\n pH\r\n \r\n | \r\n \r\n 6,0 đến 6,5 \r\n | \r\n
CHÚ THÍCH A.6
A.7 Môi trường\r\nCzapek-Dox
\r\n\r\n| \r\n NaNO3\r\n \r\n | \r\n \r\n 2,0\r\n g \r\n | \r\n
| \r\n KCl \r\n | \r\n \r\n 1,0\r\n g \r\n | \r\n
| \r\n KH2PO4\r\n \r\n | \r\n \r\n 1,0 g \r\n | \r\n
| \r\n MgSO4.7H2O \r\n | \r\n \r\n 0,5 g \r\n | \r\n
| \r\n FeSO4 \r\n | \r\n \r\n 0,01 g \r\n | \r\n
| \r\n Thạch \r\n | \r\n \r\n 20,0\r\n g \r\n | \r\n
| \r\n Nước\r\n cất vừa đủ \r\n | \r\n \r\n 1000 ml \r\n | \r\n
| \r\n pH\r\n \r\n | \r\n \r\n 6,0 đến 6,5 \r\n | \r\n
CHÚ THÍCH A.7
A.
| \r\n Dextroza \r\n | \r\n \r\n 20,0 g \r\n | \r\n
| \r\n Khoai\r\n tây \r\n | \r\n \r\n 20,0 g \r\n | \r\n
| \r\n Thạch \r\n | \r\n \r\n 20,0 g \r\n | \r\n
| \r\n Nước\r\n cất vừa đủ \r\n | \r\n \r\n 1000 ml \r\n | \r\n
| \r\n pH\r\n \r\n | \r\n \r\n 6,7 đến 6,8 \r\n | \r\n
CHÚ THÍCH A.8
-\r\nkhoai tây thái nhỏ, cho vào 1 l nước và\r\nđun sôi trong 20 min,
\r\n\r\n-\r\nsau đó lọc lấy nước trong để sử dụng\r\nlàm môi trường.
\r\n\r\nA.9 Môi trường
| \r\n Tinh\r\n bột tan \r\n | \r\n \r\n 20,0 g \r\n | \r\n
| \r\n KNO3 \r\n | \r\n \r\n 1,0 g \r\n | \r\n
| \r\n KH2PO4\r\n \r\n | \r\n \r\n 0,5 g \r\n | \r\n
| \r\n MgSO4.7H2O \r\n | \r\n \r\n 0,5 g \r\n | \r\n
| \r\n NaCl \r\n | \r\n \r\n 0,5 g \r\n | \r\n
| \r\n FeSO4 \r\n | \r\n \r\n 0,01 g \r\n | \r\n
| \r\n Thạch \r\n | \r\n \r\n 20,0 g \r\n | \r\n
| \r\n Nước\r\n cất vừa đủ \r\n | \r\n \r\n 1000 ml \r\n | \r\n
| \r\n pH\r\n \r\n | \r\n \r\n 7,0 đến 7,2 \r\n | \r\n
CHÚ THÍCH A.9:
A.
| \r\n Tinh\r\n bột tan \r\n | \r\n \r\n 10,0 g \r\n | \r\n
| \r\n KH2PO4\r\n \r\n | \r\n \r\n 1,0 g \r\n | \r\n
| \r\n MgSO4.7H2O \r\n | \r\n \r\n 1,0 g \r\n | \r\n
| \r\n NaCl \r\n | \r\n \r\n 1,0 g \r\n | \r\n
| \r\n (NH4)2SO4 \r\n | \r\n \r\n 2,0 g \r\n | \r\n
| \r\n CaCO3 \r\n | \r\n \r\n 1,0 g \r\n | \r\n
| \r\n Thạch \r\n | \r\n \r\n 20,0 g \r\n | \r\n
| \r\n Nước\r\n cất vừa đủ \r\n | \r\n \r\n 1000 ml \r\n | \r\n
| \r\n pH \r\n | \r\n \r\n 7,0 đến 7,2 \r\n | \r\n
CHÚ THÍCH A.10
A.11 Dung dịch pha\r\nloãng (dung dịch natri clorua)
\r\n\r\n| \r\n N | \r\n \r\n 8,5 g \r\n | \r\n
| \r\n Nước\r\n cất vừa đủ \r\n | \r\n \r\n 1000 ml \r\n | \r\n
| \r\n pH \r\n | \r\n \r\n 6,8 đến 7,0 \r\n | \r\n
B.1 Xác định hoạt\r\ntính đối kháng của vi sinh vật đối kháng thông qua kích thước vòng đối kháng
\r\n\r\nB.1.1 Cách tiến hành
\r\n\r\nLấy
Dùng\r\nque gạt vô trùng gạt đều cho đến khi dung dịch vi khuẩn gây bệnh thấm hoàn toàn\r\ntrên bề mặt thạch, đợi khô bề mặt thạch;
\r\n\r\nSau\r\nkhi bề mặt thạch khô (khoảng 4 h), tiếp tục phủ khoảng 15 ml đến 20 ml môi\r\ntrường thích hợp với vi sinh vật đối kháng (lớp thạch thứ hai) lên lớp\r\nthạch thứ nhất. Các đĩa thạch được để khô trong 45 min;
\r\n\r\nCHÚ\r\nTHÍCH 2: Nhiệt độ của môi trường khi phủ lên trên lớp thạch thứ\r\nnhất từ 35 OC đến 45 OC. Độ dày của lớp thạch thứ hai từ\r\n2 mm đến 3 mm.
\r\n\r\nLấy\r\n0,1 ml dung dịch huyền phù ban đầu (xem 6.2.3.1.a) cấy lên bề mặt lớp thạch thứ\r\nhai. Dùng que gạt vô trùng gạt đều cho đến khi dịch mẫu thấm hoàn toàn trên bề\r\nmặt lớp thạch thứ hai;
\r\n\r\nCác\r\nđĩa thạch được nuôi cấy ở điều kiện nhiệt độ từ 28 OC đến 32 OC\r\ntrong thời gian từ 3 ngày đến 5 ngày;
\r\n\r\nMỗi mẫu được lặp lại không ít hơn 3\r\nlần.
\r\n\r\nB.1.2 Tính kết quả
\r\n\r\nHoạt\r\ntính đối kháng của vi sinh vật thể hiện thông qua kích thước vòng đối kháng\r\n(vòng tròn trong suốt bao quanh khuẩn lạc), tính bằng mm theo công thức (3):
\r\n\r\nKích thước vòng đối kháng = D
trong\r\nđó
\r\n\r\nD
D
Kết\r\nquả là giá trị trung bình cộng của các lần lặp lại.
\r\n\r\nB.2 Xác định hoạt\r\ntính đối kháng của\r\nvi sinh vật đối kháng thông qua tỷ lệ cây bị bệnh
\r\n\r\nB.2.1 Tiến hành thử\r\nnghiệm
\r\n\r\nThử\r\nnghiệm được tiến hành với 2 công thức: Công thức đối chứng (nhiễm vi khuẩn gây\r\nbệnh), công thức thí nghiệm (nhiễm vi sinh vật đối kháng và vi khuẩn gây bệnh).\r\nMỗi công thức được lặp lại không ít hơn 3 lần với tổng số cây không ít hơn 50\r\ncây;
\r\n\r\nDung\r\ndịch vi sinh vật đối kháng được bón vào đất vô trùng trước khi gieo trồng, đảm\r\nbảo mật độ vi sinh vật đối kháng đạt 106 CFU/g đất;
\r\n\r\nNgâm\r\nhạt hoặc củ giống trong dịch vi khuẩn gây bệnh (mật độ đạt 108\r\nCFU/ml) trong thời gian 30 min. Gieo (trồng) hạt (hoặc củ) đã nhiễm vi khuẩn\r\ngây bệnh vào đất đối với công thức đối chứng và đất đã được nhiễm dịch vi sinh\r\nvật đối kháng đối với công thức thí nghiệm;
\r\n\r\nThí\r\nnghiệm được chăm sóc theo qui trình phù hợp với từng đối tượng cây chủ; đảm bảo\r\nsự phát triển, phát sinh của vi khuẩn gây bệnh; Sử dụng nước vô trùng để giữ ẩm\r\nđộ tương đối (RH) không nhỏ hơn 70 % và nhiệt độ đạt từ 25 oC đến 30\r\noC;
\r\n\r\nTrong\r\nthời gian từ 30 đến 45 ngày kể từ khi gieo trồng, phải quan sát và ghi nhận\r\nhàng ngày tình trạng sức khỏe của cây trồng (không có triệu chứng bệnh hoặc có\r\ntriệu chứng bệnh).
\r\n\r\nCHÚ THÍCH 4:
\r\n\r\n1)\r\nĐất được khử trùng bằng phương pháp khử trùng ngưng đoạn [khử trùng 3 ngày liên\r\ntiếp ở 121 OC không ít hơn 20 min trong nồi hấp áp lực (5.2)].
\r\n\r\n2)Hạt,\r\ncủ giống được khử trùng bề mặt bằng cách ngâm trong dung dịch H2O2\r\n4 %, thời gian từ 3 min đến 4 min, sau đó rửa sạch 2 - 3 lần bằng nước vô\r\ntrùng.
\r\n\r\n3) Thử nghiệm phải bảo đảm hạn chế tối đa ảnh\r\nhưởng của các yếu tố phi thí nghiệm.
\r\n\r\nB.2.2
Tỷ\r\nlệ cây bị bệnh (%) được tính theo công thức (4):
\r\n\r\n| \r\n Tỷ lệ cây bị bệnh (%) = \r\n | \r\n \r\n Trung bình cộng số cây bị bệnh \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Trung bình cộng số cây điều tra \r\n | \r\n
So sánh tỷ lệ cây bị bệnh\r\ngiữa công thức thí nghiệm với công thức đối chứng và đánh giá hoạt tính đối\r\nkháng của vi sinh vật theo các cấp độ nêu trong Bảng 1.
\r\n\r\nBảng 1 – Mức độ hoạt tính đối kháng của vi sinh vật
\r\n\r\n| \r\n Tỷ\r\n lệ cây bị bệnh (%) \r\n | \r\n \r\n Cấp\r\n độ đối kháng \r\n | \r\n \r\n Mức\r\n độ hoạt tính đối kháng \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n 1 \r\n | \r\n \r\n Cao \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n 2 \r\n | \r\n \r\n Khá \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n 3 \r\n | \r\n \r\n Trung bình \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n 4 \r\n | \r\n \r\n Yếu \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n 5 \r\n | \r\n \r\n Không có \r\n | \r\n
\r\n\r\n
File gốc của Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8741:2011 về Vi sinh vật nông nghiệp – Phương pháp bảo quản ngắn hạn đang được cập nhật.
Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8741:2011 về Vi sinh vật nông nghiệp – Phương pháp bảo quản ngắn hạn
Tóm tắt
| Cơ quan ban hành | Đã xác định |
| Số hiệu | TCVN8741:2011 |
| Loại văn bản | Tiêu chuẩn Việt Nam |
| Người ký | Đã xác định |
| Ngày ban hành | 2011-01-01 |
| Ngày hiệu lực | |
| Lĩnh vực | Nông nghiệp |
| Tình trạng | Còn hiệu lực |