Lời nói đầu
\r\n\r\nTCVN 8710-8 : 2012 do Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và\r\nPhát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm\r\nđịnh, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.
\r\n\r\n\r\n\r\n
CẢNH BÁO - Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến\r\ncác vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không thể\r\nđưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng.\r\nNgười sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn sức khỏe\r\nthích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng\r\ntiêu chuẩn.
\r\n\r\n\r\n\r\nTiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh hoại tử cơ do\r\nvi rút gây ra ở tôm.
\r\n\r\n\r\n\r\nTrong tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ và định nghĩa sau\r\nđây:
\r\n\r\nBệnh hoại tử cơ do vi rút ở tôm
Bệnh truyền nhiễm nguy hiểm gây ra bởi vi rút thuộc họ Totiviridae\r\ncó vật chất di truyền là RNA mạch đôi, kích thước khoảng 7560 bp. Thể vi rút có\r\ndạng hình cầu hai mươi mặt, đường kính khoảng 40 nm.
\r\n\r\n\r\n\r\n3.1. Chẩn đoán lâm sàng
\r\n\r\n3.1.1. Dịch tễ học
\r\n\r\nVi rút gây bệnh IMNV cảm nhiễm chủ yếu trên các tôm thuộc họ\r\nTôm he (Penaeidae): Penaeus vannamei, Ρ.stylirostris, Ρ.monodon… gây tỉ\r\nlệ chết cao. Tỷ lệ tôm nhiễm bệnh trong ao, bể có thể lên đến 100 %, tỷ lệ gây\r\nchết khoảng 40 % đến 70 %.
\r\n\r\nBệnh có thể lan truyền từ bố mẹ truyền vi rút gây bệnh cho\r\ncon cái thông qua quá trình sinh sản. Hoặc bệnh lan truyền thông qua những sinh\r\nvật mang mầm bệnh vào vùng nuôi như chim ăn những con tôm bệnh hoặc tôm chết\r\nthải phân ra ngoài môi trường nuôi, thông qua kí chủ trung gian mang mầm bệnh\r\nvào ao bể nuôi, qua dùng chung dụng cụ, nguồn nước nhiễm bệnh.
\r\n\r\nBệnh xuất hiện quanh năm, đặc biệt là mùa xuân và đầu hè khi\r\nthời tiết biến đổi nhiều như biên độ trong ngày biến thiên quá lớn, thay đổi độ\r\nmặn gây sốc cho tôm.
\r\n\r\n3.1.2. Triệu chứng lâm sàng
\r\n\r\nGiai đoạn cấp tính của bệnh IMNV: cơ vân tôm vùng bụng kéo\r\ndọc đến phần đuôi bị hoại tử, có màu trắng đục. Tôm bơi lờ đờ, dạt bờ rồi chết.\r\nTôm chết nhiều liên tiếp trong vài ngày, tỉ lệ tôm chết có thể lên đến 40 % đến\r\n70 % trong ao nhiễm.
\r\n\r\nCHÚ THÍCH: Trong một số trường hợp, tôm bị stress do yếu tố\r\nmôi trường hoặc tôm bị bệnh trắng đuôi cũng thể hiện dấu hiệu bệnh lý tương tự.
\r\n\r\n3.2. Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm
\r\n\r\n3.2.1. Phương pháp RT-PCR (Phản ứng chuỗi polymer phiên mã\r\nngược)
\r\n\r\n3.2.1.1. Nguyên tắc
\r\n\r\nPhương pháp PCR (polymerase chain reaction) dựa trên hoạt\r\nđộng của DNA polymerase tổng hợp nên mạch mới từ mạch khuôn, có sự tham gia của\r\nmồi, bốn loại nucleotit gồm adenin (dATP), thymin (dTTP), guanin (dGTP),\r\ncytocin (dCTP), dùng để khuếch đại đoạn DNA đích thông qua các chu trình nhiệt.\r\nĐể thực hiện phản ứng khuếch đại DNA đích cần có 3 quá trình: biến tính, bắt\r\ncặp và kéo dài mạch tổng hợp mạch mới.
\r\n\r\nRT-PCR là phương pháp PCR mà axit nucleic đích là RNA. Để có\r\nthể thực hiện được PCR này thì trước hết RNA đích phải được phiên mã ngược (RT\r\n- reverse transcription) thành cDNA bằng mồi đặc hiệu cho phản ứng này.
\r\n\r\nGiai đoạn phiên mã ngược RT, enzym được sử dụng là Reverse\r\nTranscriptase. Đây là một loại enzym không chịu nhiệt, sử dụng mạch RNA là mạch\r\nkhuôn để tổng hợp nên sợi DNA bổ sung (cDNA) có sự tham gia của mồi, dNTP và\r\ndung dịch đệm cho phản ứng.
\r\n\r\nCó hai phương pháp thực hiện RT-PCR, đó là RT-PCR một bước\r\nvà RT-PCR hai bước. Trong quy trình này, phương pháp RT-PCR hai bước được thực\r\nhiện để khuếch đại RNA đích.
\r\n\r\n3.2.1.2. Thuốc thử và vật liệu thử
\r\n\r\nChỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích và sử dụng\r\nnước cất hai lần đã khử ion hoặc nước có độ tinh khiết tương đương không có\r\nRNAase, trừ khi có quy định khác.
\r\n\r\n- Trizol;
\r\n\r\n- Cloroform;
\r\n\r\n- Isopropanol;
\r\n\r\n- Etanol 75 % và 95 %;
\r\n\r\n- Dung dịch TBE 1X
\r\n\r\nChuẩn bị dung dịch đệm TBE đậm đặc 10 lần (Tris - axit boric\r\n- EDTA 10X): hòa tan 108 g Tris và 55 g axit boric trong 600 ml nước, thêm 40\r\nml EDTA 0,5 M và thêm nước cho đủ 1 lít. Bảo quản ở nhiệt độ phòng.
\r\n\r\nKhi sử dụng, thêm 900 ml nước vào 100 ml dung dịch TBE gốc\r\n(10X) thành dung dịch TBE 1X.
\r\n\r\n- Dung dịch EDTA (etylen diamin tetra axetic) 0,5 M
\r\n\r\nHòa tan 93,05 g EDTA trong 350 ml nước, chỉnh đến pH 8,0\r\nbằng dung dịch NaOH 4 M. Thêm nước cho đủ 500 ml. Bảo quản ở nhiệt độ phòng.
\r\n\r\n- Dung dịch DEPC
\r\n\r\nDung dịch di-etypyrocacbonat 0,1 % thể tích, lắc trộn đều\r\nkhoảng 10 min. Sau đó để qua đêm trong bình kín, nới lỏng nắp và hấp khử trùng\r\nở 121 oC trong 15 min, bảo quản ở nhiệt độ - 20 oC
\r\n\r\n- Dung dịch TE (Tris - EDTA)
\r\n\r\nChuẩn bị dung dịch chứa Tris [tris (hydroxymetyl)\r\naminometan] 10 mM và EDTA 1mM, dùng HCl để chỉnh pH 7,6.
\r\n\r\n- Hỗn hợp phản ứng RT-PCR.
\r\n\r\n- Dung dịch đệm tải mẫu DNA đậm đặc 6 lần (loading dye 6X).
\r\n\r\n- Thang chuẩn DNA (DNA marker) gồm có các thang 100 bp; 200\r\nbp; 300 bp; 400 bp; 500 bp; 1000 bp; 1500 bp.
\r\n\r\n- Etidi bromua (EtBr).
\r\n\r\nCẢNH BÁO AN TOÀN: Etidi bromua là chất độc hại, tránh tiếp\r\nxúc và tránh hít phải hơi từ dung dịch còn nóng có chứa EtBr, sử dụng găng tay\r\nvà mặc áo bảo hộ lao động trong suốt thời gian tiếp xúc với EtBr.
\r\n\r\n- Gel agarose.
\r\n\r\n3.2.1.3. Thiết bị, dụng cụ
\r\n\r\nSử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm chẩn đoán\r\nbệnh và cụ thể như sau:
\r\n\r\n- Tủ lạnh;
\r\n\r\n- Tủ lạnh âm sâu, có thể hoạt động ở nhiệt độ - 20 oC;
\r\n\r\n- Máy li tâm, có thể hoạt động với gia tốc 13000 g;
\r\n\r\n- Nồi cách thủy hay block nhiệt khô, có thể hoạt động ở\r\nnhiệt độ 95 oC;
\r\n\r\n- Máy lắc trộn vortex;
\r\n\r\n- Cân phân tích có thể cân chính xác đến 0,1 mg;
\r\n\r\n- Micropipet đơn kênh có dải từ 0,5 ![](\"00906809_files/image001.gif\")
l đến 10 l, từ 2 l đến 20 l, từ 10 l đến 100 l, từ 100 l đến 1000
- Giá Eppendorf có kích thước 0,2 ml và 1,5 ml;
\r\n\r\n- Máy luân nhiệt (máy PCR);
\r\n\r\n- Bếp điện hoặc lò vi sóng;
\r\n\r\n- Ống đong, dung tích 100 ml; 500 ml; 1000 ml;
\r\n\r\n- Bình nón chịu nhiệt, dung tích 250 ml;
\r\n\r\n- Bộ điện di gồm bộ nguồn và máng chạy điện di;
\r\n\r\n- Buồng đổ gel;
\r\n\r\n- Bàn đọc gel (UV);
\r\n\r\n- Giấy parafin.
\r\n\r\n3.2.1.4. Lấy mẫu
\r\n\r\nChọn những cá thể có dấu hiệu bệnh lý như mô tả ở trên.
\r\n\r\nTôm bố mẹ: lấy mẫu phần đuôi tôm bố mẹ.
\r\n\r\nTôm giống (> postlarvae 8, hay hậu ấu trùng lớn hơn 8\r\nngày tuổi) đến tôm trưởng thành: lấy chân bơi của từ 5 con đến 10 con.
\r\n\r\nTôm nhỏ hơn tôm giống (nhỏ hơn postlarvae 8): lấy phần đầu\r\ncủa từ 10 con đến 15 con.
\r\n\r\nẤu trùng biến thái: lấy cả con, khoảng 50 con.
\r\n\r\nLượng mẫu lấy để tách chiết RNA khoảng 20 mg, có thể dùng\r\ntôm còn sống hoặc mẫu tôm, mẫu phân cố định trong etanol 95 % để tách chiết\r\nRNA.
\r\n\r\n3.2.1.5. Cách tiến hành
\r\n\r\n3.2.1.5.1. Tách chiết RNA
\r\n\r\nCHÚ THÍCH: Có nhiều quy trình tách chiết RNA từ mô động vật\r\ntheo hướng dẫn của nhà sản xuất. Hiện nay có rất nhiều các thuốc thử và bộ kit\r\nthương mại hữu ích cho việc tách chiết RNA…) Người sử dụng có thể lựa chọn bộ\r\nkit thích hợp và an toàn theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
\r\n\r\nPhương pháp tách chiết RNA bằng trizol:
\r\n\r\nCho 20 mg mẫu vào ống Eppendorf 1,5 ml. Nếu mẫu được cố định\r\ntrong etanol 95 %, cần làm khô etanol bằng cách đổ etanol và dốc ngược trên tờ\r\ngiấy lọc, để khô tự nhiên.
\r\n\r\nCho vào ống Eppendorf có chứa mẫu khoảng 100
Nghiền nhỏ và mịn bằng chày nghiền, sau đó thêm vào khoảng\r\n550 l đến\r\n650 l dung\r\ndịch trizol và nghiền tiếp đến khi nhuyễn. Giữ ở nhiệt độ phòng đến 5 min.
Ly tâm 12000 g trong thời gian 10 min, sau đó chuyển dịch\r\ntrong sang ống Eppendorf mới, nhỏ thêm 150 l cloroform. Lắc cẩn thận bằng tay\r\ntrong 15 s.
Ủ 15 oC đến 30 oC từ 2 min đến 3 min.
\r\n\r\nLy tâm 12000 g từ 2 oC đến 8 oC trong\r\n15 min, sau đó chuyển phần trong phía trên sang ống Eppendorf 1,5 ml mới.
\r\n\r\nThêm 375 l dung dịch isopropanol, ủ ở 15 oC\r\nđến 30 oC trong 10 min.
Ly tâm 12000 g tại 4 oC trong 10 min, sau đó rút\r\nbỏ isopropanol.
\r\n\r\nRửa phần viên bằng 750 l etanol 75 %.
Trộn đều bằng máy vortex và ly tâm ở 7500 g trong 5 min ở 4 oC,\r\nsau đó rút bỏ etanol. Làm khô phần viên.
\r\n\r\nHòa tan RNA bằng nước tinh khiết hoặc DEPC (dietyl\r\npyrocarbonat) với lượng khoảng từ 50 l đến 100
l tùy thuộc vào lượng RNA tách chiết\r\nđược.
CẢNH BÁO: Việc tách chiết RNA sử dụng hóa chất nguy hiểm và\r\ncó khả năng gây hại nếu thao tác không cẩn thận. Do vậy, nên tránh tiếp xúc\r\ntrực tiếp với da và hít phải hơi của các hóa chất này. Luôn luôn đeo găng tay,\r\nkhẩu trang, mặc quần áo bảo hộ khi thực hiện các thao tác này.
\r\n\r\n3.2.1.5.2. Tiến hành phản ứng RT-PCR
\r\n\r\n3.2.1.5.1. Cặp mồi sử dụng trong phản ứng RT-PCR
\r\n\r\nPhản ứng khuếch đại được thực hiện trong máy luân nhiệt theo\r\nphương pháp RT-PCR hai bước khuếch đại đoạn gen đặc hiệu của vi rút IMNV sử\r\ndụng cặp mồi 4587F/4914R và 4725NF/4863NR (Bảng 1)
\r\n\r\n| \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n 4587F \r\n | \r\n \r\n CGA-CGC-TGC-TAA-CCA-TAC-AA \r\n | \r\n
| \r\n 4914R \r\n | \r\n \r\n ACT-CGG-CTG-TTC-GAT-CAA-GT \r\n | \r\n
| \r\n 4725 NF \r\n | \r\n \r\n GGC-ACA-TGC-TCA-GAG-ACA \r\n | \r\n
| \r\n 4863 NR \r\n | \r\n \r\n AGC-GCT-GAG-TCC-AGT-CTT-G \r\n | \r\n
Cặp mồi 4587F/4914R dùng để khuếch đại đoạn gen của vi rút\r\nIMNV có kích thước 328 bp. Cặp mồi 4725NF/4863NR dùng để khuếch đại đoạn gen có\r\nkích thước 139 bp.
\r\n\r\nChuẩn bị mồi:
\r\n\r\n- Mồi ở trạng thái đông khô phải được ly tâm ngắn để mồi\r\nlắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Lần đầu tiên nên dùng đệm TE để\r\nhoàn nguyên mồi ở nồng độ 200 pmol/l làm gốc.
- Mồi được sử dụng ở nồng độ 20 pmol/l: pha loãng mồi gốc bằng\r\nnước không có nuclease (10 l mồi gốc và 90
l nước).
3.2.1.5.2.2. Chuẩn bị phản ứng
\r\n\r\nTùy theo điều kiện phòng thí nghiệm chọn lựa hỗn hợp Mix\r\nphản ứng thương mại phù hợp và sử dụng theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
\r\n\r\nChuẩn bị hỗn hợp phản ứng RT-PCR bước một và bước hai theo\r\nsố mẫu chẩn đoán, cộng thêm một mẫu đối chứng dương và một mẫu đối chứng âm,\r\ntrộn chung vào một ống Eppendorf.
\r\n\r\nSau đó hút 22,5 l hỗn hợp phản ứng vào ống Eppendorf\r\n0,2 ml, ghi kí hiệu mẫu lên nắp ống Eppendorf, mẫu đối chứng dương và mẫu đối\r\nchứng âm.
3.2.1.5.2.3. Tiến hành phản ứng PCR bước 1
\r\n\r\nThêm 2,5 l RNA mạch khuôn (tách chiết được) vào\r\nống PCR chứa sẵn 22,5
l hỗn hợp phản ứng RT-PCR (thành phần\r\ngồm: dung dịch đệm 1X EZ; mỗi loại dNTP có nồng độ 300
M; mồi 4587F, 4914R có nồng\r\nđộ 0,465 M;\r\nMn(OCOCH3)2 2,5 mM và nước cho đủ thể tích để được hỗn\r\nhợp với tổng thể tích 25 l.
Hỗn hợp phản ứng RT-PCR bước 1, xem Bảng 2.
\r\n\r\n| \r\n | \r\n \r\n
| \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Dung dịch đệm EZ (5X) \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n dNTP (10 mM mỗi loại) \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n
| \r\n
| \r\n rTth Enzyme (2,5 U/ | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Mồi 4587F \r\n | \r\n \r\n
| \r\n \r\n
| \r\n
| \r\n Mồi 4914R \r\n | \r\n \r\n
| \r\n \r\n
| \r\n
| \r\n Mn(OCOCH3)2 (25 mM) \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n RNA mạch khuôn \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Nước \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
Sau khi pha hỗn hợp cho mỗi phản ứng đặt vào máy luân nhiệt.
\r\n\r\nChu\r\ntrình nhiệt của phản ứng RT-PCR bước 1 được nêu trong Bảng 3.
\r\n\r\n| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Tạo cDNA \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Biến tính \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Biến tính \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Bắt cặp \r\n | \r\n \r\n | \r\n |
| \r\n Kéo dài mạch \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Giữ ổn định \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
Sản phẩm khuếch đại bảo quản ở 4 oC cho đến khi\r\nđiện di.
\r\n\r\n3.2.1.5.2.4. Tiến hành phản ứng RT-PCR bước 2
\r\n\r\nThêm 0,5 l RNA mạch khuôn (sản phẩm PCR bước 1)\r\nvào ống PCR chứa sẵn 24,5
l hỗn hợp phản ứng RT-PCR (thành phần\r\ngồm: mỗi dNTP có nồng độ 200
M; magie clorua 1,5 mM và 2,5 U của Taq\r\nDNA polymerase, mỗi mồi 4725 NF, 4863 NR có nồng độ 0,465
M và nước cho đủ thể tích để\r\nđược hỗn hợp PCR với tổng thể tích 25 l.
Có thể sử dụng thành phần hóa chất riêng lẻ hay sử dụng hỗn\r\nhợp phản ứng thương mại vẫn đảm bảo nồng độ cuối cùng của các thành phần trên.
\r\n\r\nVí dụ về sử dụng hỗn hợp phản ứng RT-PCR bước 2, sử dụng hỗn\r\nhợp phản ứng Go Taq Green Master Mix của Promega 2 X, xem bảng 4.
\r\n\r\n| \r\n | \r\n \r\n
| \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Promega Gotag Green Master Mix, 2X \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Mồi 4725 NF \r\n | \r\n \r\n
| \r\n \r\n
| \r\n
| \r\n Mồi 4863 NR \r\n | \r\n \r\n
| \r\n \r\n
| \r\n
| \r\n Sản phẩm bước 1 \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Nước \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
Sau khi pha hỗn hợp cho mỗi phản ứng, đặt hỗn hợp vào máy\r\nluân nhiệt. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR bước 2 được nêu trong Bảng 5.
\r\n\r\n| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Biến tính \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Biến tính \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Bắt cặp \r\n | \r\n \r\n | \r\n |
| \r\n Kéo dài mạch \r\n | \r\n \r\n | \r\n |
| \r\n Kéo dài mạch \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Giữ ổn định \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
CHÚ Ý: Mẫu, nguyên liệu cho phản ứng RT-PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt\r\nquá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng.
\r\n\r\nCẢNH BÁO: Do bản chất của RNA là rất dễ bị phân hủy trong\r\nmôi trường cũng như enzym RNAase tiết ra từ các vi sinh vật, môi trường chai,\r\nlọ, thiết bị, dụng cụ và dung dịch. Enzym RNAase rất bền, khó bị phân hủy bởi\r\nnhiệt độ. Vì vậy, tất cả mọi dụng cụ, thiết bị, thuốc thử dùng trong RT-PCR\r\nphải tuyệt đối vô trùng.
\r\n\r\n3.2.1.5.3. Chạy điện di
\r\n\r\n3.2.1.5.3.1. Chuẩn bị bản gel
\r\n\r\nPha thạch nồng độ từ 1,5 % đến 2 % agarose bằng dung dịch\r\nđệm TBE 1X hoặc TAE 1X vào bình nón 250 ml, lắc cho tan.
\r\n\r\nSau đó cho vào lò vi sóng đun đến sôi, đợi đến khi nhiệt độ\r\ngiảm xuống khoảng 40 oC đến 50 oC, cho vào 5
Chuẩn bị khuôn đổ thạch, đặt lược vào khuôn, rồi đổ thạch\r\nvào khuôn.
\r\n\r\nTiến hành đổ vào bản gel (chú ý không nên đổ bản gel dày quá\r\n0,8 cm).
\r\n\r\nKhi bản gel đông lại thì tiến hành gỡ lược khỏi bản gel.
\r\n\r\nChuyển bản gel vào máng điện di, đổ dung dịch đệm (TBE 1X\r\nhoặc TAE 1X) cùng loại với dung dịch đã đun agarose vào máng điện di cho tới\r\nkhi ngập bản gel.
\r\n\r\n3.2.1.5.3.2. Điện di
\r\n\r\nHút 10 l sản phẩm RT-PCR nhỏ vào một giếng\r\ntrên bản gel.
Khi thực hiện điện di, chạy kèm theo DNA marker để dự đoán\r\nkích thước sản phẩm khuếch đại. Hút 10 l thang DNA vào một giếng trên bản gel.
Điện di ở hiệu điện thế 100 V đến 150 V (quan sát thấy bóng\r\nkhí nổi lên từ hai phía điện cực của máy điện di sau khi nối điện). Khi quan\r\nsát thấy màu xanh đậm của thuốc nhuộm cách giếng khoảng 2/3 chiều dài bảng\r\nthạch agarose, dừng quá trình điện di.
\r\n\r\nCHÚ Ý: Trong trường hợp Master Mix không có sẵn đệm tải mẫu thì khi tiến hành\r\nđiện di nhỏ 2 l.\r\nLoading dye 6X lên giấy parafin, hút 10 l sản phẩm PCR ra, nhỏ vào và trộn đều,\r\nsau đó lấy khoảng 10
l nhỏ vào một giếng trên bản gel.
3.2.1.5.4. Đọc kết quả
\r\n\r\nSau khi điện di xong, đọc kết quả trên bàn đọc UV, đọc kết\r\nquả với tia UV bước sóng 302 nm.
\r\n\r\nĐối chiếu các vạch sáng của mẫu với các vạch sáng từ thang\r\nDNA, mẫu đối chứng dương tính và mẫu đối chứng âm tính để đưa ra kết luận.
\r\n\r\n| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Thang DNA \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n |
| \r\n Mẫu đối chứng dương tính \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n |
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n |
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n |
| \r\n Mẫu đối chứng âm tính \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n |
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n ||
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n ||
| \r\n Mẫu \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n |
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n |
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n |
Kết quả mẫu thử dương tính khi xuất hiện vạch sáng có kích\r\nthước bằng kích thước giống mẫu đối chứng dương có kích thước 328 bp bước 1 và\r\n139 bp bước 2 hoặc chỉ có vạch 139 bp bước 2. Thang DNA phân vạch rõ ràng, mẫu\r\nđối chứng âm không có vạch sáng.
\r\n\r\nKết quả mẫu thử âm tính khi không có vạch sáng kích thước\r\n139 bp. Không có vạch sáng của mẫu đối chứng âm tính, có vạch sáng mẫu đối\r\nchứng dương tính. Thang DNA phân vạch rõ ràng.
\r\n\r\n3.2.2. Phương pháp mô học
\r\n\r\n3.2.2.1. Thuốc thử và vật liệu thử
\r\n\r\nChỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích và sử dụng\r\nnước cất hai lần đã khử ion hoặc nước có độ tinh khiết tương đương không có\r\nRNAase, trừ khi có quy định khác.
\r\n\r\n- Dung dịch Davidson (xem A.1).
\r\n\r\n- Thuốc nhuộm hematoxylin (xem A.2).
\r\n\r\n- Thuốc nhuộm eosin (xem A.3).
\r\n\r\n- Etanol 70 %, 90 % và etanol tuyệt đối.
\r\n\r\n- Parafin.
\r\n\r\n- Xylen.
\r\n\r\n- Keo dán, ví dụ Bom Canada.
\r\n\r\n3.2.2.2. Thiết bị, dụng cụ
\r\n\r\nSử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm chẩn đoán\r\nbệnh và cụ thể như sau:
\r\n\r\n- Kính giải phẫu.
\r\n\r\n- Bộ đồ giải phẫu gồm các dụng cụ panh, rùi nhọn, giải phẫu\r\nkéo các loại, lam kính và lamen.
\r\n\r\n- Lọ nhỏ cố định mẫu.
\r\n\r\n- Bình rót parafin.
\r\n\r\n- Bộ phận làm lạnh mẫu.
\r\n\r\n- Máy cắt mẫu microtome.
\r\n\r\n- Nồi nước có chỉnh nhiệt độ.
\r\n\r\n- Tủ ấm hoặc bàn sấy mẫu.
\r\n\r\n- Kính hiển vi quang học.
\r\n\r\n- Cassete.
\r\n\r\n- Khung đúc mẫu.
\r\n\r\n3.2.2.3. Lấy mẫu
\r\n\r\nThu những mẫu tôm có dấu hiệu bệnh (như mô tả dấu hiệu bệnh\r\nlý phần trên).
\r\n\r\nKhông dùng tôm chết hoặc tôm bảo quản đá để cắt mô.
\r\n\r\n3.2.2.4. Cách tiến hành
\r\n\r\n3.2.2.4.1. Chuẩn bị mẫu
\r\n\r\nCố định mẫu trong dung dịch Davidson. Đối với ấu trùng hoặc\r\ntôm hậu ấu trùng có thể cố định cả con trong dung dịch Davidson từ 12 h đến 24\r\nh. Số tôm thu từ 30 con đến 50 con mỗi bể. Sau đó cố định trong etanol 70 % ở\r\nnhiệt độ phòng.
\r\n\r\nĐối với tôm lớn cố định bằng cách lấy tôm sống cắt lấy phần\r\ncơ đuôi, cơ bụng, sau đó cho vào lọ có chứa dung dịch Davidson. Số tôm thu từ 5\r\ncon đến 10 con một ao. Nếu mẫu lớn cần phải cắt nhỏ, chiều dài mẫu không quá 1\r\ncm. Tỷ lệ mẫu và dung dịch cố định là 1/10, ngâm trong 24 h đến 72 h phụ thuộc\r\nvào kích thước của mẫu, sau đó bảo quản ngay trong etanol 70 % ở nhiệt độ\r\nphòng.
\r\n\r\n3.2.2.4.2. Khử mẫu cố định
\r\n\r\nNgâm trong etanol 90 % hai lần, trong thời gian 30 min đến\r\n60 min mỗi lần. Sau đó ngâm trong etanol tuyệt đối hai lần, thời gian 30 min\r\nđến 60 min mỗi lần.
\r\n\r\n3.2.2.4.3. Làm trong mẫu
\r\n\r\nNgâm sang lọ xylen 1 để trong 30 min đến 60 min.
\r\n\r\nNgâm sang lọ xylen 2 để trong 30 min đến 60 min.
\r\n\r\nSau đó ngâm tẩm parafin hai lần, mỗi lần 56 oC\r\nđến 58 oC trong 1 h.
\r\n\r\nĐúc khuôn: Đặt mẫu đã thấm parafin vào khuôn đổ parafin tập\r\ntrung vào một mặt của khuôn để khi cắt được tốt hơn. Làm lạnh mẫu trong bàn\r\nlạnh hoặc để trong tủ lạnh.
\r\n\r\n3.2.2.4.4. Cắt mẫu
\r\n\r\nCắt gọt khối block parafin vuông, mặt cắt bằng phẳng, để\r\ntrên mặt khay đá.
\r\n\r\nĐặt mặt khối block parafin song song với mép lưỡi dao, cắt\r\nchiều dày lát cắt từ 4 m đến 5
m.
Chọn lát cắt tiêu bản phẳng thả vào nồi nước nhiệt độ nước\r\ntừ 30 oC đến 35 oC; sau đó dùng lam kính vớt lát cắt tiêu\r\nbản. Để khô.
\r\n\r\n3.2.2.4.5. Nhuộm tiêu bản H&E
\r\n\r\nTẩy parafin bằng cách ngâm trong xylen hai lần, mỗi lần từ 3\r\nmin đến 5 min, sau đó ngâm lần lượt trong etanol tuyệt đối, etanol 90 % và\r\netanol 70 %, mỗi lần ngâm từ 3 min đến 5 min rồi đem rửa dưới vòi nước chảy từ\r\n3 min đến 5 min.
\r\n\r\nNgâm trong thuốc nhuộm haematoxylin từ 3 min đến 5 min sau\r\nđó rửa dưới vòi chảy từ 3 min đến 5 min rồi tiếp tục ngâm trong thuốc nhuộm\r\neosin từ 1 min đến 2 min.
\r\n\r\nLàm mất nước trong mẫu qua các thang nồng độ etanol 75 %,\r\netanol 90% và etanol tuyệt đối, mỗi bước từ 1 min đến 2 min, chuyển sang xylen\r\nhai lần (mỗi lần từ 2 min đến 3 min), gắn lamen bằng keo dán, ví dụ Bom Canada.\r\nĐể khô và soi kính.
\r\n\r\n3.2.2.4.6. Đọc kết quả
\r\n\r\nSoi tiêu bản từ độ phóng đại thấp đến độ phóng đại cao (100\r\nX, 400 X, 1000 X)
\r\n\r\nKhi tôm bị bệnh IMNV, kết quả mô bệnh học cho thấy các vị\r\ntrí hoại tử ở các sợi cơ vân và có hiện tượng viêm, phù, xuất huyết giữa các\r\nsợi cơ, xuất hiện thể ẩn trong tế bào chất.
\r\n\r\nTôm bị nhiễm nặng, phần cơ ở bụng bị hoại tử nghiêm trọng và\r\nsự xâm nhập với số lượng lớn của các tế bào máu vào vùng bị viêm.
\r\n\r\n3.2.3. Phương pháp lai tại chỗ (in situ hybridization - ISH)
\r\n\r\n3.2.3.1. Nguyên tắc
\r\n\r\n- Lai tại chỗ được phát triển từ phép lai Southern Blot.
\r\n\r\nTrình tự axit nucleic cần tìm không được tách chiết ra khỏi\r\nmô hay tế bào. Quá trình lai với mẫu dò đã được đánh dấu và phát hiện các phân\r\ntử lai được thực hiện ngay trên khuẩn lạc, nhiễm sắc thể, tế bào hay lát cắt\r\nmô.
\r\n\r\n3.2.3.2. Thuốc thử và vật liệu thử
\r\n\r\n- Dung dịch lai.
\r\n\r\n- Phosphatase kiềm và nitroblue tetrazolium và\r\n5-bromo-4-chloro-3-indoyl phosphat.
\r\n\r\nXem 3.2.2.1.
\r\n\r\n3.2.3.3. Thiết bị, dụng cụ
\r\n\r\nXem 3.2.2.2.
\r\n\r\n3.2.3.4. Lấy mẫu
\r\n\r\nThu những con tôm có dấu hiệu bị bệnh (như mô tả dấu hiệu\r\nbệnh lý phần trên).
\r\n\r\nMẫu tôm dùng để phân tích phải còn sống hoặc đang còn trong\r\ntình trạng hấp hối.
\r\n\r\n3.2.3.5. Chuẩn bị mẫu
\r\n\r\nĐể phát hiện IMNV thì mẫu tôm phải được cố định bằng cách\r\ncắt lấy phần cơ đuôi, cơ bụng ngâm trong dung dịch không axit [dung dịch R-F\r\n(A.4)].
\r\n\r\nNgâm mẫu cố định từ 12 h đến 24 h, sau đó lấy mẫu ra khỏi\r\ndung dịch cố định, rửa với nước trong 1 h đến 2 h và đem xử lý mẫu.
\r\n\r\n3.2.3.6. Xử lý mẫu
\r\n\r\nMẫu tôm cố định được xử lý và cố định trong parafin và cắt\r\n(4m) theo\r\nhướng dẫn trong quy trình chuẩn.
3.2.3.7. Tiến hành lai
\r\n\r\nCặp probe sử dụng trong quá trình lai, xem bảng 7.
\r\n\r\n| \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n IMNV 993F \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n IMNV 993R \r\n | \r\n \r\n | \r\n
Quy trình sử dụng cho phương pháp ISH được mô tả bởi\r\nLightner (1996).
\r\n\r\nVới phương pháp ISH, các mảnh cắt trên tiêu bản được phủ bởi\r\n500 l dung\r\ndịch lai (4 SSC, formamid 50 %, 1 Denhard's, dextran sulfat 5 % (khối lượng/thể\r\ntích), DNA tinh dịch cá hồi 0,5 g/ml) có chứa IMNV probe (0,2
3.2.3.8. Đọc kết quả
\r\n\r\nMẫu dương tính nếu có các thể vùi kết tủa màu xanh đến đen\r\ntrong tế bào chất, những tế bào không bị nhiễm vi rút thì cấu trúc mô bình\r\nthường và bắt màu thuốc nhuộm bổ sung (màu cam).
\r\n\r\nMẫu âm tính nếu không có màu xanh hoặc đen, chỉ bắt màu\r\nthuốc nhuộm bổ sung và có màu cam sau quá trình lai.
\r\n\r\n\r\n\r\nTôm được xác định nhiễm bệnh IMNV khi có đặc điểm dịch tễ,\r\ntriệu chứng lâm sàng của bệnh và kết quả dương tính trong các phương pháp sau:
\r\n\r\n- Phản ứng RT-PCR phát hiện vi rút dương tính;
\r\n\r\n- Mẫu cắt mô có bệnh tích của vi rút IMNV;
\r\n\r\n- Kết quả lai tại chỗ dương tính với IMNV.
\r\n\r\n\r\n\r\n
A.1. Dung dịch Davidson
\r\n\r\nEtanol 95 % 330 ml
\r\n\r\nFormalin (formaldehyd 37 %) 220 ml
\r\n\r\nAxit axetic đậm đặc 115 ml
\r\n\r\nNước 335\r\nml
\r\n\r\nA.2. Thuốc nhuộm hematoxylin
Hematoxylin dạng tinh thể 1 g
\r\n\r\nNatri iodat 0,2\r\ng
\r\n\r\nAmoni alum [NH4Al(SO4)2]\r\nhoặc kali alum [KAl(SO4)2]: 50 g
\r\n\r\nAxit axetic 1 g
\r\n\r\nCloral hydrat 50 g
\r\n\r\nNước 1000\r\nml
\r\n\r\nHòa tan hematoxylin trong nước, sau đó cho natri iodat và\r\namoni alum hoặc kali alum, hòa tan, tiếp tục cho axit axetic và chloral hydrat\r\nrồi lọc qua giấy lọc.
\r\n\r\nBảo quản dung dịch đã pha trong chai tối màu.
\r\n\r\nA.3. Thuốc nhuộm eosin
\r\n\r\nEosin Y 1\r\ng
\r\n\r\nEtanol 70 % 1 lít
\r\n\r\nAxit axetic băng 5\r\nml
\r\n\r\nThêm từ 2 giọt đến 3 giọt axit axetic vào etanol 70 %. Hòa\r\ntan eosin trong etanol, sau đó cho thêm axit axetic rồi lọc qua giấy lọc.
\r\n\r\nBảo quản dung dịch đã pha trong chai tối màu.
\r\n\r\nA.4. Dung dịch R-F (RNA - friendly)
\r\n\r\nFormaldehyd 37 % 349 ml
\r\n\r\nCồn 95 % 407 ml
\r\n\r\nNước 244\r\nml
\r\n\r\nChỉnh pH = 7.
\r\n\r\n\r\n\r\n
[1] Bonnie T.Poulos. 2006. Donald V Lightner, Detection of\r\ninfectious myonecrosis virus (IMNV) of penaeid shrimp by reverse-transcriptase\r\npolymerase chain reaction (RT-PCR).
\r\n\r\n[2] Manual of Diagnostic Test for Aquatic Animals, 2010. Viral\r\nencephalopathy and retinopathy.
\r\n\r\n[3] Manual of Diagnostic Test for Aquatic Animals, 2009. Infectious\r\nmyonecrosis.
\r\n\r\n[4] Tang et al. 2005. K.F.J. Tang, C.R. Pantoja, B.T.\r\nPoulos, R.M. Redman and D.V. Lightner. In situ hybridization\r\ndemonstrates that Litopenaeus vannamei, L. stylirostris and Penaeus\r\nmonodon are susceptible to experimental infection with infectious\r\nmyonecrosis virus (IMNV), Dis. Aquat. Org. 63, pp. 261-265.
\r\n\r\nFile gốc của Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-8:2012 về Bệnh thủy sản – Quy trình chẩn đoán – Phần 8: Bệnh hoại tử cơ ở tôm đang được cập nhật.
Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-8:2012 về Bệnh thủy sản – Quy trình chẩn đoán – Phần 8: Bệnh hoại tử cơ ở tôm
Tóm tắt
| Cơ quan ban hành | Đã xác định |
| Số hiệu | TCVN8710-8:2012 |
| Loại văn bản | Tiêu chuẩn Việt Nam |
| Người ký | Đã xác định |
| Ngày ban hành | 2012-01-01 |
| Ngày hiệu lực | |
| Lĩnh vực | Nông nghiệp |
| Tình trạng | Còn hiệu lực |