Lời nói đầu
\r\n\r\nTCVN 8710-7:2012 do Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và\r\nPhát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm\r\nđịnh, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.
\r\n\r\n\r\n\r\n
CẢNH BÁO - Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến\r\ncác vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không thể\r\nđưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng.\r\nNgười sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn sức khỏe\r\nthích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng\r\ntiêu chuẩn.
\r\n\r\n\r\n\r\nTiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh xuất huyết\r\nmùa xuân do vi rút ở cá chép.
\r\n\r\n\r\n\r\nTrong tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ và định nghĩa sau\r\nđây:
\r\n\r\nBệnh xuất huyết mùa xuân ở cá chép
SVC
\r\n\r\nBệnh truyền nhiễm nguy hiểm gây ra bởi vi rút Rhabdovirus\r\ncarpio thuộc họ Rhabdoviridae có vật chất di truyền là RNA mạch đơn (-RNA), thể\r\nvi rút dạng hình que, chiều dài 90 nm đến 180 nm, rộng 60 nm đến 90 nm, bộ gen\r\nchứa khoảng 11019 nucleotide mã hóa năm loại protein: nucleoprotein (N),\r\nphosphoprotein (P), matrix protein (M), glycoprotein (G) và protein mã hóa\r\nenzym RNA polymerase (L).
\r\n\r\n\r\n\r\n3.1. Chẩn đoán lâm sàng
\r\n\r\n3.1.1. Dịch tễ học
\r\n\r\nHầu hết các loài thuộc họ cá chép đều cảm nhiễm với vi rút\r\nSVC: cá chép (Cyprinus carpio carpio), cá koi (Cyprinus carpio koi), cá giếc\r\n(Carassius carassius), cá mè trắng (Hypophthalmichthys molitrix), cá tàu vàng\r\n(Carassius auratus), cá tenca (Tinca tinca), cá mè (Aristichthys nobilis), cá\r\ntrắm cỏ (Ctenopharyngodon idella).
\r\n\r\nNgoài ra đã phân lập được vi rút gây bệnh SVC từ cả các loài\r\ncá khác: cá nheo châu Âu (Silurus glanis) và cá hồi sông (Oncorhynchus mykiss).
\r\n\r\nHầu hết ở các giai đoạn của cá đều có thể bị nhiễm vi rút.\r\nGiai đoạn dễ cảm nhiễm nhất với vi rút là cá giống và cá nuôi dưới 1 năm.
\r\n\r\nVi rút có thể tồn tại bên ngoài vật chủ 5 tuần ở nước sông\r\ntại 10oC, hơn 6 tuần ở ao nuôi tại 4oC và 4 tuần tại 10oC.
\r\n\r\nVi rút gây bệnh SVC lây truyền theo trục ngang thông qua\r\nnguồn nước nhiễm vi rút, hoặc từ cá bệnh sang cá khỏe qua chất thải, các dịch\r\nsinh sản, qua da hoặc qua các vật trung gian như các loài chim ăn cá, rận ở cá\r\nchép (Argulus foliaceus hay đỉa (Piscicola geometra) có mang vi rút. Sự lây\r\ntruyền theo trục dọc chưa thể xác định mặc dù đã có công bố phân lập được vi\r\nrút SVC từ dịch tử cung của cá chép.
\r\n\r\nTại Việt Nam, bệnh SVC thường xuất hiện vào cuối đông và đầu\r\nmùa xuân, nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển của bệnh là 11oC đến\r\n17oC, bệnh hiếm khi xuất hiện ở nhiệt độ dưới 10oC và tỷ\r\nlệ chết cụ thể ở cá trưởng thành giảm khi nhiệt độ lên đến 22oC. Tỷ\r\nlệ chết từ 40% đến 70%.
\r\n\r\nSự bùng phát bệnh có liên quan lớn đến nhiệt độ, nước, độ\r\ntuổi, tình trạng của cá, mật độ nuôi đặc biệt là yếu tố stress của cá.
\r\n\r\n3.2.1. Triệu chứng lâm sàng
\r\n\r\nDấu hiệu bệnh lý đầu tiên là cá bơi ở tầng mặt, mất thăng\r\nbằng bơi không định hướng sau đó chết chìm xuống đáy.
\r\n\r\nMang và da xuất huyết có thể xuất huyết cả ở mắt. Da có màu\r\ntối, những chỗ viêm có nhiều chất nhầy, mắt lồi nhẹ, mang nhợt nhạt, các tơ\r\nmang dính kết lại. Máu loãng chảy ra từ hậu môn.
\r\n\r\nQuan sát cơ quan nội tạng thấy: bụng trướng to, trong xoang\r\nbụng xuất huyết có dấu hiệu tích nước (phù), bóng hơi xuất huyết và teo dần một\r\nngăn, lá lách sưng to, tim, gan, thận, ruột xuất huyết, xoang bụng có chứa\r\nnhiều dịch nhờn.
\r\n\r\nTrong trường hợp cấp tính, cá không thể hiện dấu hiệu bệnh\r\nlý, bệnh xảy ra đột ngột. Tỉ lệ chết cao.
\r\n\r\n3.2. Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm (Phương pháp RT-PCR)
\r\n\r\n3.2.1. Nguyên tắc
\r\n\r\nPhương pháp PCR (polumerase chain reaction) dựa trên hoạt\r\nđộng của DNA polymerase tổng hợp nên mạch mới từ mạch khuôn, có sự tham gia của\r\nmồi, bốn loại nucleotit gồm adenin (dATP), thymin (dTTP), guanin (dGTP),\r\ncytocin (dCTP), dùng để khuếch đại đoạn DNA đích thông qua các chu trình nhiệt.\r\nĐể thực hiện phản ứng khuếch đại DNA đích cần có 3 quá trình: biến tính, bắt\r\ncặp và kéo dài mạch tổng hợp mạch mới.
\r\n\r\nRT-PCR là phương pháp PCR mà nucleoic axit đích là RNA. Để\r\ncó thực hiện được PCR này thì trước hết RNA đích phải được phiên mã ngược (RT -\r\nreverse transcription) thành cDNA bằng mồi đặc hiệu cho phản ứng này.
\r\n\r\nGiai đoạn phiên mã ngược RT, enzym được sử dụng là Reverse\r\nTranscriptase. Đây là một loại enzym không chịu nhiệt, sử dụng mạch RNA là mạch\r\nkhuôn để tổng hợp nên sợi DNA bổ sung (cDNA) có sự tham gia của mồi, dNTP và\r\ndung dịch đệm cho phản ứng.
\r\n\r\nCó hai phương pháp thực hiện RT-PCR, đó là RT-PCR một bước\r\nvà RT-PCR hai bước. Trong quy trình này, phương pháp RT-PCR hai bước được thực\r\nhiện để khuếch đại RNA đích.
\r\n\r\n3.2.2. Thuốc thử và vật liệu thử
\r\n\r\n- Trizol;
\r\n\r\n- Cloroform;
\r\n\r\n- Isopropanol;
\r\n\r\n- Etanol 75% và 95%;
\r\n\r\n- Dung dịch TBE 1X
\r\n\r\nChuẩn bị dung dịch đệm TBE đậm đặc 10 lần (Tris - axit boric\r\n- EDTA 10X): hòa tan 108 g Tris và 55 g axit boric trong 600 ml nước, thêm 40\r\nml EDTA 0,5 M và thêm nước cho đủ 1 lít. Bảo quản ở nhiệt độ phòng.
\r\n\r\nKhi sử dụng, thêm 900 ml nước vào 100 ml dung dịch TBE gốc\r\n(10X) thành dung dịch TBE 1X.
\r\n\r\n- Dung dịch EDTA (etylen diamin tetra axetic) 0,5 M
\r\n\r\nHòa tan 93,05 g EDTA trong 350 ml nước, chỉnh đến pH 8,0\r\nbằng dung dịch NaOH 4 M. Thêm nước cho đủ 500 ml. Bảo quản ở nhiệt độ phòng.
\r\n\r\n- Dung dịch DEPC
\r\n\r\nDung dịch di-etypyrocacbonat 0,1% thể tích, lắc trộn đều\r\nkhoảng 10 min. Sau đó để qua đêm trong bình kín, nới lỏng nắp và hấp khử trùng\r\nở 121oC trong 15 min, bảo quản ở nhiệt độ -20oC.
\r\n\r\n- Dung dịch TE (Tris - EDTA)
\r\n\r\nChuẩn bị dung dịch chứa Tris [tris (hydroxymetyl)\r\naminometan] 10 mM và EDTA 1 mM, dùng HCl để chỉnh đến pH 7,6.
\r\n\r\n- AMV RT (Reverse Transcriptase);
\r\n\r\n- Hỗn hợp phản ứng RT-PCR;
\r\n\r\n- Dung dịch đệm tải mẫu DNA đậm đặc 6 lần (loading dye 6X)
\r\n\r\n- Thang chuẩn DNA (DNA marker) gồm có các thang 100 bp; 200\r\nbp; 300 bp; 400 bp; 500 bp; 1000 bp; 1500 bp.
\r\n\r\n- Etidi bromua (EtBr);
\r\n\r\nCẢNH BÁO AN TOÀN: Etidi bromua là chất độc hại, tránh tiếp\r\nxúc và tránh hít phải hơi từ dung dịch còn nóng có chứa EtBr, sử dụng găng tay\r\nvà mặc áo bảo hộ lao động trong suốt thời gian tiếp xúc với EtBr.
\r\n\r\n- Gel agarose.
\r\n\r\n3.2.3. Thiết bị, dụng cụ
\r\n\r\nSử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm chẩn đoán\r\nbệnh và cụ thể như sau:
\r\n\r\n- Tủ lạnh.
\r\n\r\n- Tủ lạnh âm sâu, có thể hoạt động ở nhiệt độ -20oC;
\r\n\r\n- Máy li tâm, có thể hoạt động với gia tốc 13 000 g;
\r\n\r\n- Nồi cách thủy hay block nhiệt khô, có thể hoạt động ở nhiệt\r\nđộ 95oC;
\r\n\r\n- Máy lắc trộn vortex;
\r\n\r\n- Cân phân tích có thể cân chính xác đến 0,1 mg;
\r\n\r\n- Micropipet đơn kênh có dải từ 0,5
- Giá Eppendorf có kích thước 0,2 ml và 1,5 ml;
\r\n\r\n- Máy luân nhiệt (máy PCR);
\r\n\r\n- Bếp điện hoặc lò vi sóng;
\r\n\r\n- Ống đong, dung tích 100 ml; 500 ml; 1000 ml;
\r\n\r\n- Bình nón chịu nhiệt, dung tích 250 ml;
\r\n\r\n- Bộ điện di gồm bộ nguồn và máng chạy điện di;
\r\n\r\n- Buồng đổ gel;
\r\n\r\n- Bàn đọc gel (UV);
\r\n\r\n- Giấy parafin.
\r\n\r\n3.2.4. Lấy mẫu
\r\n\r\nChọn những cá thể có dấu hiệu bệnh lý như mô tả ở trên.
\r\n\r\nCá bột: lấy cả con (20 con).
\r\n\r\nCá giống: từ 1 con đến 5 con, lấy thận, lấy phần trước của\r\nđầu (20 con).
\r\n\r\nCá lớn: lấy gan, thận, não (5 con)
\r\n\r\nLượng mẫu lấy để tách chiết RNA khoảng 20 mg, có thể dùng cá\r\ncòn sống, tiến hành làm ngay hoặc mẫu cố định trong etanol 95%.
\r\n\r\n3.2.5. Cách tiến hành
\r\n\r\n3.2.5.1. Tách chiết RNA
\r\n\r\nCHÚ THÍCH: Có nhiều quy trình tách chiết RNA từ mô động vật\r\ntheo hướng dẫn của nhà sản xuất. Hiện nay có rất nhiều các thuốc thử và bộ kít\r\nthương mại hữu ích cho việc tách chiết RNA ...) Người sử dụng có thể lựa chọn\r\nbộ kit thích hợp và an toàn theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
\r\n\r\nPhương pháp tách chiết RNA bằng trizol:
\r\n\r\nCho 20 mg mẫu vào ống Eppendorf 1,5 ml. Nếu mẫu được cố định\r\ntrong etanol 95%, cần làm khô etanol bằng cách đổ etanol và dốc ngược trên tờ\r\ngiấy lọc, để khô tự nhiên.
\r\n\r\nCho vào ống Eppendorf có chứa mẫu khoảng 100
Nghiền nhỏ và mịn bằng chày nghiền, sau đó thêm vào khoảng\r\n550 m
Ly tâm 12 000 g trong thời gian 10 min, sau đó chuyển dịch\r\ntrong sang ống Eppendorf mới, nhỏ thêm 150 ml\r\ncloroform. Lắc cẩn thận bằng tay trong 15s.
\r\n\r\nỦ 15oC đến 30oC từ 2 min đến 3 min.
\r\n\r\nLy tâm 12000 g từ 2oC đến 8oC trong 15\r\nmin, sau đó chuyển phần trong phía trên sang ống Eppendorf 1,5 ml mới.
\r\n\r\nThêm 375 ml dung dịch\r\nisopropanol, ủ ở 15oC đến 30oC trong 10 min.
\r\n\r\nLy tâm 12 000 g tại 4°C trong 10 min, sau đó rút bỏ\r\nisopropanol.
\r\n\r\nRửa phần viên bằng 750 ml\r\netanol 75%
\r\n\r\nTrộn đầu bằng máy vortex và ly tâm ở 7500 g trong 5 min ở 4°C,\r\nsau đó rút bỏ etanol. Làm khô phần viên.
\r\n\r\nHòa tan RNA bằng nước tinh khiết hoặc DEPC (dietyl\r\npyrocarbonat) với lượng khoảng từ 50ml\r\nđến 100 m
CẢNH BÁO: Việc tách chiết RNA sử dụng hóa chất nguy hiểm và\r\ncó khả năng gây hại nếu thao tác không cẩn thận. Do vậy, nên tránh tiếp xúc\r\ntrực tiếp với da và hít phải hơi của các hóa chất này. Luôn luôn đeo găng tay,\r\nkhẩu trang, mặc quần áo bảo hộ khi thực hiện các thao tác này.
\r\n\r\n3.2.5.2. Tiến hành phản ứng PCR
\r\n\r\n3.2.5.2.1. Cặp mồi sử dụng trong phản ứng RT-PCR
\r\n\r\nPhản ứng khuếch đại được thực hiện trong máy luân nhiệt theo\r\nphương pháp RT-PCR hai bước khuếch đại đoạn gen đặc hiệu mã hóa cho\r\nglycoprotein của vi rút SVC sử dụng cặp mồi SVC R2/SVC F1 và cặp mồi SVC F1/SVC\r\nR4 (xem Bảng 1).
\r\n\r\n| \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n
Chuẩn bị mồi:
\r\n\r\n- Mồi ở trạng thái đông khô phải được ly tâm ngắn để mồi\r\nlắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Lần đầu tiên nên dùng đệm TE để\r\nhoàn nguyên mồi ở nồng độ 200 pmol/ml\r\nlàm gốc.
\r\n\r\n- Mồi được sử dụng ở nồng độ 20 pmol/
3.2.5.2.2. Chuẩn bị phản ứng
\r\n\r\nTùy theo điều kiện phòng thí nghiệm chọn lựa hỗn hợp Mix\r\nphản ứng cho phù hợp và sử dụng theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
\r\n\r\nHỗn hợp phản ứng giai đoạn phiên mã ngược, bước 1 và bước 2\r\nđược chuẩn bị trong 1 ống Eppendorf dựa trên tổng số mẫu cần chẩn đoán, cộng\r\nthêm một mẫu đối chứng dương và một mẫu đối chứng âm, trộn chung vào một ống\r\nEppendorf.
\r\n\r\n3.2.5.2.3. Tiến hành phản ứng RT-PCR bước 1
\r\n\r\nGiai đoạn phiên mã ngược (tạo cDNA)
\r\n\r\nGiai đoạn phiên mã ngược được thực hiện trong 1 h ở 37 °C.\r\nThể tích hỗn hợp phản ứng 20 ml có thành\r\nphần dung dịch đệm như sau: 1 X dung dịch M-MLV RT buffer hai bước (Two-Step\r\nMMLV RT-PCR Kit) bao gồm (Tris 50 mM, pH 8,3, KCl 75 mM, KCl 10 mM, DTT 10 mM,\r\nMgCl2 3 mM) và mỗi dNTP có nồng độ 1 mM, mồi R2 có nồng độ 1
Ví dụ về hỗn hợp phản ứng sử dụng Two-Step MMLV RT-PCR Kit\r\ncủa hãng AllianceBio, xem Bảng 2:
\r\n\r\n| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n 2 \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
Sản phẩm cDNA tổng hợp được sử dụng cho phản ứng RT-PCR.
\r\n\r\nPhản ứng RT-PCR (bước 1)
\r\n\r\nHỗn hợp phản ứng RT-PCR: hỗn hợp dung dịch đệm RT-PCR bao\r\ngồm (KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 9,0 và Triton X-100 0,1%); MgCl2\r\n2,5 mM, mỗi dNTP có nồng độ 200 mM,\r\n20 pmol mồi R2, F1 có nồng độ 1 mM,\r\n0,625 U Taq DNA polymerase, 2,5 ml\r\nsản phẩm cDNA ở trên và nước sao cho đủ thể tích 25
Có thể sử dụng thành phần thuốc thử riêng lẻ hay sử dụng hỗn\r\nhợp phản ứng thương mại sao cho đảm bảo nồng độ cuối cùng của các thành phần\r\nnhư trên, ví dụ sử dụng hỗn hợp phản ứng Go Taq Green Master Mix của Promega,\r\n2X có thành phần 2X green Go Taq Reaction Buffer (pH 8,5); dNTP 400
Ví dụ về hỗn hợp phản ứng RT-PCR bước 1, sử dụng hỗn hợp\r\nphản ứng Go Taq Green Master Mix của Promega, 2X như trong Bảng 3.
\r\n\r\n| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
Sau khi pha hỗn hợp cho mỗi phản ứng đặt vào máy luân nhiệt.
\r\n\r\nChu\r\ntrình nhiệt của phản ứng PCR bước 1 được nêu trong Bảng 4.
\r\n\r\n| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n |
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n |
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
3.2.5.2.4. Tiến hành phản ứng RT-PCR bước 2
\r\n\r\nThêm 2,5 ml mạch khuôn\r\n(sản phẩm bước 1) vào ống PCT chứa sẵn 22,5 ml\r\nhỗn hợp phản ứng thành phần gồm như sau: 1 x PCR (KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM, pH\r\n9 và Triton X-100 nồng độ 0,1 %); MgCl2 2,5 mM, mỗi dNTP có nồng độ\r\n200 m
Có thể sử dụng thành phần hóa chất riêng lẻ hay sử dụng hỗn\r\nhợp phản ứng thương mại vẫn đảm bảo nồng độ cuối cùng của các thành phần như\r\ntrên sử dụng cặp mồi SVC R2 và SVC F1. Ví dụ hỗn hợp phản ứng sử dụng hỗn hợp\r\nphản ứng Go Taq Green Master Mix của Promega, 2X có thành phần 2X green Go Taq\r\nReaction Buffer (pH 8,5); 400 mM mỗi dNTP;\r\nMgCl2 3 mM, Taq DNA polymerase và chất đệm tải mẫu (yellow dye và\r\nblue dye) nên khi chạy gel không cần thêm chất đệm tải mẫu (loading dye).
\r\n\r\nVí dụ về hỗn hợp phản ứng bước 2, sử dụng hỗn hợp phản ứng\r\nGo Taq Green Master Mix của Promega 2X như trong Bảng 5.
\r\n\r\n| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
Sau khi pha hỗn hợp cho mỗi phản ứng đặt vào máy luân nhiệt.\r\n Chu trình nhiệt của phản ứng RT-PCR bước 2 được nêu trong Bảng 6.
\r\n\r\n| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n |
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n |
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
CHÚ Ý: Mẫu và nguyên liệu cho phản ứng RT-PCR cần đặt trong\r\nkhay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng.
\r\n\r\nCẢNH BÁO: Do bản chất của RNA là rất dễ bị phân hủy trong\r\nmôi trường cũng như enzym RNAase tiết ra từ các vi sinh vật, môi trường chai,\r\nlọ, thiết bị, dụng cụ và dung dịch. Enzym RNAase rất bền, khó bị phân hủy bởi\r\nnhiệt độ. Vì vậy, tất cả mọi dụng cụ, thiết bị, thuốc thử dùng trong RT-PCR\r\nphải tuyệt đối vô trùng.
\r\n\r\n3.2.5.3. Chạy điện di
\r\n\r\n3.2.5.3.1. Chuẩn bị bản gel
\r\n\r\nPha thạch nồng độ từ 1,5% đến 2% agarose bằng dung dịch đệm\r\nTBE 1X hoặc TAE 1X vào bình nón 250 ml, lắc cho tan.
\r\n\r\nSau đó cho vào lò vi sóng đun đến sôi, đợi đến khi nhiệt độ\r\ngiảm xuống khoảng 40°C đến 50°C, cho vào 5 ml\r\netidi bromua/100 ml. Lắc nhẹ tránh tạo bọt để etidi bromua tan đều.
\r\n\r\nChuẩn bị khuôn đổ thạch, đặt lược vào khuôn, rồi đổ thạch\r\nvào khuôn.
\r\n\r\nTiến hành đổ vào bản gel (chú ý không nên đổ bản gel dày quá\r\n0,8 cm).
\r\n\r\nKhi bản gel đông lại thì tiến hành gỡ lược khỏi bản gel.
\r\n\r\nChuyển bản gel vào máng điện di, đổ dung dịch đệm (TBE 1X\r\nhoặc TAE 1X) cùng loại với dung dịch đã đun agarose) vào máng điện di cho tới\r\nkhi ngập bản gel.
\r\n\r\n3.2.5.3.2. Điện di
\r\n\r\nHút 10 ml sản phẩm\r\nRT-PCR nhỏ vào một giếng trên bản gel.
\r\n\r\nKhi thực hiện điện di, chạy kèm theo DNA marker để dự đoán\r\nkích thước sản phẩm khuếch đại. Hút 10 ml\r\nthang DNA vào một giếng trên bản gel.
\r\n\r\nĐiện di ở hiệu điện thế 100 V đến 150 V (quan sát thấy bóng\r\nkhí nổi lên từ hai phía điện cực của máy điện di sau khi nối điện). Khi quan\r\nsát thấy màu xanh đậm của thuốc nhuộm cách giếng khoảng 2/3 chiều dài bảng\r\nthạch agarose, dừng quá trình điện di.
\r\n\r\nCHÚ Ý: Trong trường hợp Master Mix không có sẵn đệm tải mẫu\r\nthì khi tiến hành điện di nhỏ 2 ml\r\nđệm tải mẫu 6X lên giấy parafin, hút 10 ml\r\nsản phẩm PCR ra, nhỏ vào và trộn đều, sau đó lấy khoảng 10
3.2.5.4. Đọc kết quả
\r\n\r\nSau khi điện di xong, đọc kết quả trên bàn đọc UV, đọc kết\r\nquả với tia UV bước sóng 302 nm.
\r\n\r\nĐối chiếu các vạch sáng của mẫu với các vạch sáng từ thang\r\nDNA, mẫu đối chứng dương tính và mẫu đối chứng âm tính để đưa ra kết luận.
\r\n\r\n| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n |
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n |
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n |
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n |
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n |
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n ||
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n ||
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n |
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n |
| \r\n | \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n |
Kết quả mẫu thử dương tính khi: Xuất hiện vạch sáng có kích\r\nthước bằng kích thước giống mẫu đối chứng dương có kích thước 606 bp, thang DNA\r\nphân vạch rõ ràng, mẫu đối chứng âm không có vạch sáng.
\r\n\r\nKết quả mẫu thử âm tính khi: Không có vạch sáng kích thước\r\n606 bp. Không có vạch sáng của mẫu đối chứng âm tính, có vạch sáng mẫu đối\r\nchứng dương tính. Thang DNA phân vạch rõ ràng.
\r\n\r\n\r\n\r\nCá được xác định bị nhiễm bệnh SVC khi có đặc điểm dịch tễ,\r\ntriệu chứng lâm sàng của bệnh và kết quả phản ứng RT-PCR phát hiện vi rút dương\r\ntính.
\r\n\r\n\r\n\r\n
[1] Alikin Y.S., Shchelkunov I.S., Shchelkunova T.I.,\r\nKupinskaya O.A., Masycheva V.I., Klimenko V.P, & Fadina V.A. 1996, Prophylactic\r\ntreatment of viral diseases in fish using native RNA linked to soluble and\r\ncorpuscular carriers. J.Fish Biol., 49, 195-205.
\r\n\r\n[2] Bùi Quang Tề và cộng sự. 2008., Bệnh học thủy sản.
\r\n\r\n[3] Manual of Diagnostic Test for Aquatic Animals. 2010.
\r\n\r\n[4] Magdy K.Soliman, Mohammed M. Aboeisa, Safinaz G.\r\nMohamed, Walid D. Saleh. 2008. First record of isolation and identification\r\nof Spring of carp virus from Oreochromis niloticus in Egypt. 1294-1300.
\r\n\r\n[5] Stone D.M., Ahne W., Denham K.D., Dixon P.F., Liu\r\nC.T.Y., Sheppard A.M., Taylor G.R. & Way K.2003. Nucleotide sequence\r\nanalysis of the glycoprotein gene of pulative spring viraemia of carp virus and\r\npike fry rhabdovirus isolates reveals four genogroups. Dis. Aquat. Org., 53,\r\n203-210.
\r\n\r\n[6] Békési I. & Csontos L. (1985). Isolation of\r\nspring viraemia of carp virus from asymptomatic broodstock carp, Cyprinus\r\ncarpio L. J.Fish Dis., 8, 471-472
\r\n\r\nFile gốc của Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-7:2012 về Bệnh thủy sản – Quy trình chẩn đoán – Phần 7: Bệnh xuất huyết mùa xuân ở cá chép đang được cập nhật.
Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-7:2012 về Bệnh thủy sản – Quy trình chẩn đoán – Phần 7: Bệnh xuất huyết mùa xuân ở cá chép
Tóm tắt
| Cơ quan ban hành | Đã xác định |
| Số hiệu | TCVN8710-7:2012 |
| Loại văn bản | Tiêu chuẩn Việt Nam |
| Người ký | Đã xác định |
| Ngày ban hành | 2012-01-01 |
| Ngày hiệu lực | |
| Lĩnh vực | Nông nghiệp |
| Tình trạng | Hết hiệu lực |