TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 8400-10:2022

BỆNH ĐỘNG VẬT - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 10: BỆNH LAO BÒ

Animal disease - Diagnostic procedure - Part 10: Bovine tuberculosis

Lời nói đầu

TCVN 8400-10:2022 thay thế TCVN 8400-10:2011;

TCVN 8400-10:2022 do Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương, Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

Bộ tiêu chuẩn TCVN 8400 Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán gồm các phần sau đây:

- TCVN 8400-1:2019, Phần 1: Bệnh lở mồm long móng;

- TCVN 8400-2:2010, Phần 2: Bệnh do vi khuẩn Streptococcus suis gây ra trên lợn;

- TCVN 8400-3:2010, Phần 3: Bệnh giun xoắn;

- TCVN 8400-4:2010, Phần 4: Bệnh Niu cát xơn;

- TCVN 8400-5:2011, Phần 5: Bệnh tiên mao trùng;

- TCVN 8400-6:2011, Phần 6: Bệnh xuất huyết thỏ;

- TCVN 8400-7:2011, Phần 7: Bệnh đậu cừu và đậu dê;

- TCVN 8400-8:2011, Phần 8: Bệnh nấm phổi do Aspergillus ở gia cầm;

- TCVN 8400-9:2011, Phần 9: Bệnh viêm gan vịt typ I;

- TCVN 8400-10:2022, Phần 10: Bệnh lao bò;

- TCVN 8400-11:2019, Phần 11: Bệnh dịch tả vịt;

- TCVN 8400-12:2011, Phần 12: Bệnh bạch lỵ và thương hàn ở gà;

- TCVN 8400-13:2019, Phần 13: Bệnh sảy thai truyền nhiễm do Brucella;

- TCVN 8400-14:2011, Phần 14: Bệnh tụ huyết trùng ở trâu bò;

- TCVN 8400-15:2019, Phần 15: Bệnh xoắn khuẩn do Leptospira;

- TCVN 8400-16:2011, Phần 16: Bệnh phù ở lợn do vi khuẩn E. coli;

- TCVN 8400-17:2011, Phần 17: Bệnh do Staphylococcus aureus ở gà;

- TCVN 8400-18:2014, Phần 18: Bệnh phù đầu gà (coryza);

- TCVN 8400-19:2014, Phần 19: Bệnh phó thương hàn lợn;

- TCVN 8400-20:2014, Phần 20: Bệnh đóng dấu lợn;

- TCVN 8400-21:2014, Phần 21: Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS);

- TCVN 8400-22:2014, Phần 22: Bệnh giả dại ở lợn;

- TCVN 8400-23:2014, Phần 23: Bệnh ung khí thán;

- TCVN 8400-24:2014, Phần 24: Bệnh viêm phế quản truyền nhiễm;

- TCVN 8400-25:2014, Phần 25: Bệnh cúm lợn;

- TCVN 8400-26:2014, Phần 26: Bệnh cúm gia cầm H5N1;

- TCVN 8400-27:2014, Phần 27: Bệnh sán lá gan;

- TCVN 8400-28:2014, Phần 28: Bệnh viêm ruột hoại tử do Clostridium perfringens;

- TCVN 8400-29:2015, Phần 29: Bệnh Lympho leuko ở gà;

- TCVN 8400-30:2015, Phần 30: Bệnh Marek ở gà;

- TCVN 8400-31:2015, Phần 31: Bệnh tụ huyết trùng gia cầm;

- TCVN 8400-32:2015, Phần 32: Bệnh gumboro ở gia cầm;

- TCVN 8400-33:2015, Phần 33: Bệnh lê dạng trùng ở trâu bò;

- TCVN 8400-34:2015, Phần 34: Bệnh biên trùng ở trâu bò;

- TCVN 8400-35:2015, Phần 35: Bệnh Theileria ở trâu bò;

- TCVN 8400-36:2015, Phần 36: Hội chứng suy mòn ở lợn sau cai sữa do Circo vi rút typ 2;

- TCVN 8400-37:2015, Phần 37: Bệnh viêm phổi địa phương ở lợn;

- TCVN 8400-38:2015, Phần 38: Bệnh tiêu chảy ở lợn do Corona vi rút;

- TCVN 8400-39:2016, Phần 39: Bệnh viêm đường hô hấp mãn tính ở gà;

- TCVN 8400-40:2016, Phần 40: Bệnh nhiễm trùng huyết ở thủy cầm do vi khuẩn Riemerella anatipestifer gây ra;

- TCVN 8400-41:2019, Phần 41: Bệnh dịch tả lợn châu Phi;

- TCVN 8400-42:2019, Phần 42: Bệnh dịch tả loài nhai lại nhỏ;

- TCVN 8400-43:2019, Phần 43: Bệnh lưỡi xanh;

- TCVN 8400-44:2019, Phần 44: Bệnh roi trùng Trichomonosis;

- TCVN 8400-45:2019, Phần 45: Bệnh gạo lợn, bệnh gạo bò;

- TCVN 8400-46:2019, Phần 46: Bệnh dại;

- TCVN 8400-47:2019, Phần 47: Bệnh dịch tả lợn cổ điển;

- TCVN 8400-48:2020, Phần 48: Bệnh tiêu chảy có màng nhày do vi rút ở bò;

- TCVN 8400-49:2020, Phần 49: Bệnh viêm mũi khí quản truyền nhiễm ở bò;

- TCVN 8400-50:2020, Phần 50: Bệnh viêm não Nhật Bản;

- TCVN 8400-51:2020, Phần 51: Bệnh viêm phổi, màng phổi truyền nhiễm ở bò;

- TCVN 8400-52:2022, Phần 52: Bệnh nhiệt thán ở gia súc;

- TCVN 8400-53:2022, Phần 53: Bệnh viêm phổi hóa mủ do vi khuẩn Ornithobacterium rhinotracheale

- TCVN 8400-54:2022, Phần 54: Bệnh tỵ thư ở gia súc;

- TCVN 8400-55:2022, Phần 55: Bệnh u nhày ở thỏ.

BỆNH ĐỘNG VẬT - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 10: BỆNH LAO BÒ

Animal disease - Diagnostic procedure - Part 10: Bovine tuberculosis

CẢNH BÁO - Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không thể đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn sức khỏe thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn.

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh lao bò do vi khuẩn Mycobacterium bovis gây ra.

2  Tài liệu viện dẫn

Tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này.

TCVN 8128:2015 Vi sinh vật trong thực phẩm, thức ăn chăn nuôi và nước - Chuẩn bị, sản xuất, bảo quản và thử hiệu năng của môi trường nuôi cấy

3  Thuật ngữ, định nghĩa và các từ viết tắt

3.1  Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này sử dụng các thuật ngữ và định nghĩa sau:

3.1.1

Bệnh lao bò (Bovine tuberculosis)

Bệnh truyền nhiễm mạn tính của nhiều loài động vật, có thể lây sang người và xảy ra chủ yếu ở bò, do trực khuẩn Mycobacterium bovis gây ra.

3.1.2

Mycobacterium bovis (M. bovis)

Trực khuẩn mảnh, hơi cong, hai đầu tròn, không có lông, không có giáp mô, không có nha bào, chiều rộng có kích thước từ 0,2 μm đến 0,6 μm và chiều dài có kích thước từ 1 μm đến 10 μm.

3.1.3

Phản ứng dò lao (Tuberculin test)

Còn được gọi là phản ứng tiêm nội bì hoặc phản ứng quá mẫn chậm. Sử dụng chẩn đoán với gia súc còn sống, dùng kháng nguyên được chế từ vi khuẩn M. bovis hoặc M. avian.

3.2  Các từ viết tắt

4  Thuốc thử, vật liệu thử và môi trường nuôi cấy

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích; sử dụng nước cất hoặc nước khử ion hoặc nước có độ tinh khiết tương đương không có Rnase, trừ khi có quy định khác.

4.1  Thuốc nhuộm Ziehl-Neelsen (xem Phụ lục A.1)

4.2  Môi trường nuôi cấy vi khuẩn

Xem TCVN 8128:2015 (ISO 11133:2014) về các yêu cầu chung đối với việc chuẩn bị các môi trường nuôi cấy.

4.2.1  Môi trường Lowenstein-Jensen (xem Phụ lục B.1)

4.2.2  Môi trường canh thang Middlebbrook 7H9, 7H10, 7H11, H7H12 (xem Phụ lục B.2)

4.3  Môi trường xác định sinh hóa

4.3.1  Môi trường phân giải nitrat (xem Phụ lục B.3)

4.3.2  Môi trường kiểm tra sự mẫn cảm với pyrazinamid (xem Phụ lục B.4)

4.3.3  Môi trường kiểm tra khả năng sinh urease (xem Phụ lục B.5)

4.3.4  Môi trường kiểm tra khả năng sinh niacin (xem Phụ lục B.6)

4.4  Kháng nguyên cho phản ứng dò lao nội bì

4.4.1  Tuberculin PPD bò

4.4.2  Tuberculin PPD gà

4.5  Kháng nguyên và vật liệu cho phản ứng Bovigam

4.5.1  Bộ lao tố, để thu IFN-gamma

VÍ DỤ: Bộ lao tố PPD PACK (gồm có PPDA, PPDB, mitogen) của hãng IDvet; Bộ lao tố PPD bò (Cat. No.7600060) và PPD gà (Cat. No. 7600065) của hãng Prionics™.

4.5.2  Bộ ELISA phát hiện IFN-gamma

VÍ DỤ: Bộ sandwich ELISA phát hiện Gamma Interferon của hãng IDvet; Bộ kít BOVIGAM^® TB (Cat. No. 63320) của hãng Prionics™.

4.6  Dung dịch PBS, vô trùng

4.7  Dung dịch axit oxalic, 5 %

4.8  Dung dịch axit clohydric, 2 N.

4.9  Dung dịch natri hydroxit, có nồng độ 1 %, 2 %, 4 %

5  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm sinh học và các thiết bị, dụng cụ sau:

5.1  Bơm tiêm, chuyên dụng cho phản ứng dò lao nội bì

5.2  Kim tiêm, chuyên dụng cho phản ứng dò lao nội bì

5.3  Thước đo độ dày da, chuyên dụng cho phản ứng dò lao nội bì

5.4  Bơm tiêm, dung tích 10 ml, có gắn kim kích cỡ 18 G hoặc 20 G, vô trùng

5.5  Tăm bông vô trùng, loại có cán dài từ 15 cm đến 20 cm

5.6  Bông cồn, bằng cottông đã được tẩm cồn etanol 70 %

5.7  Tủ an toàn sinh học cấp II

5.8  Tủ ấm, bổ sung từ 5 % đến 10 % CO₂ thể tích và duy trì nhiệt độ 37 °C ± 0,5 °C

5.9  Kính hiển vi, có vật kính với độ phóng đại 10 X, 40 X, 100 X

5.10  Nồi hấp, duy trì ở các nhiệt độ 100 °C , 110 °C, 121 °C;

5.11  Máy lắc, có tốc độ lắc từ 50 rpm đến 2400 rpm

5.12  Máy ly tâm, ly tâm được với gia tốc từ 2000 g đến 2500 g

5.13  Ống nghiệm, có thể tích từ 10 ml đến 15 ml, sạch và vô trùng

5.14  Đĩa petri (hộp lồng), có đường kính từ 90 mm đến 100 mm, sạch và vô trùng

5.15  Que cấy, vô trùng

5.16  Cối chày sứ nghiền mẫu, sạch và vô trùng

5.17  Đèn cồn

5.18  Ống ly tâm (hoặc ống eppendoff), có thể tích 0,2 ml, 1,5 ml, vô trùng

5.19  Tủ lạnh, duy trì nhiệt độ từ 4 °C đến 8 °C

5.20  Đĩa 24 giếng, vô trùng

5.21  Ống thu máu có chứa heparin, vô trùng

5.22  Pipet, các loại có thể hút được thể tích 10 μl, 100 μl, 200 μl, 1000 μl và pipet đa kênh

5.23  Dụng cụ đựng mẫu, là các ống, hộp có nắp kín, không rò rỉ, không dễ vỡ và vô trùng.

6  Chẩn đoán lâm sàng

6.1  Đặc điểm dịch tễ

- Bệnh lao bò do vi khuẩn M. bovis gây ra.

- Gia súc có thể bị nhiễm lao do tiếp xúc với gia súc bị bệnh hoặc đi từ vùng đã có dịch.

- Gia súc non cảm nhiễm với M. bovis mạnh hơn gia súc trưởng thành.

- Bệnh lao lây chủ yếu qua đường hô hấp, do hít phải những giọt bắn có chứa M. bovis từ gia súc mắc bệnh ho, hắt hơi vào không khí. Ngoài ra, bệnh có thể lây từ đường tiêu hóa do sữa bò bị bệnh nhiễm M. bovis.

6.2  Triệu chứng lâm sàng

- Thời gian ủ bệnh từ 2 tuần đến 4 tuần hoặc lâu hơn.

- Gia súc mắc bệnh thường gầy, yếu, lông dựng đứng, da khô, sốt nhẹ về chiều.

- Các triệu chứng của bệnh phụ thuộc vào vị trí phân bố của các hạt lao.

Nếu các hạt lao khu trú ở phổi: Biểu hiện ho khan, ho từng cơn và ho nhiều hơn khi thời tiết thay đổi.

Nếu các hạt lao khu trú ở hạch: Các hạch bạch huyết sưng, cứng, sờ thấy lổn nhổn, nhất là các hạch ở trước vai, trước đùi, dưới hàm.

Nếu các hạt lao khu trú ờ ruột: Gia súc ỉa chảy, phân tanh khẳm hoặc ỉa chảy và táo bón luân phiên.

- Gia súc mắc bệnh gầy dần và có thể chết do suy nhược ở giai đoạn cuối của bệnh.

6.3  Bệnh tích

- Bệnh tích đặc trưng là gia súc có các hạt lao. Các hạt lao có thể ở trong các cơ quan nội tạng, màng treo ruột, ruột, màng phổi, màng bụng, vú,... nhưng hay gặp nhất là ở hạch phổi, hạch vùng đầu và các hạch bạch huyết ở xoang ngực.

- Các hạt lao thường có màu vàng, hoặc màu trắng đục, dạng bã đậu hoặc dạng hạt xơ hay bị canxi hóa thành những khối tăng sinh thượng bì. Trên cùng một cơ quan có thể thấy nhiều dạng hạt lao khác nhau.

- Nếu hạt lao có nhiều trong phổi thì khi nắn các thuỳ phổi có cảm giác như phổi có trộn cát, cắt có tiếng kêu lạo xạo.

6.4  Chẩn đoán ngoài thực địa - Phản ứng dò lao

6.4.1  Cách tiêm

Chọn một trong hai cách sau đây:

- Tiêm 1 mũi: Chọn một vị trí da cổ hoặc ở giữa mặt trong của nếp gấp da đuôi của bò (tránh chỗ da bị tổn thương), đánh dấu vị trí tiêm, cắt sạch lông, dùng thước (5.3) để đo độ dày da. Tiêm tối thiểu 2000 IU tuberculin PPD bò (4.4.1), PPD gà (4.4.2) và lượng tiêm tối đa 0,2 ml vào vị trí đã đánh dấu.

- Tiêm 2 mũi: Chọn 2 vị trí khác nhau ở cùng một bên cổ của con vật, khoảng cách giữa 2 vị trí là 12 cm đến 15 cm, với gia súc non nên tiêm ở hai bên cổ (tránh chỗ da bị tổn thương), đánh dấu vị trí tiêm, cắt sạch lông dùng thước (5.3) để đo độ dày da. Tiêm tối thiểu 2000 IU tuberculin PPD bò (4.4.1), PPD gà (4.4.2) và lượng tiêm tối đa 0,2 ml vào vị trí đã đánh dấu.

6.4.2  Đọc kết quả

Sau khi tiêm 72 h, đo độ dày nếp gấp của da và đánh giá kết quả như sau:

6.4.2.1  Đọc kết quả khi tiêm một mũi ở vùng da cổ

Kết quả cho thấy:

- Độ sưng da trước và sau khi tiêm không lớn hơn 2 mm và con vật không có các triệu chứng lâm sàng: Âm tính;

- Độ sưng da trước và sau khi tiêm lớn hơn 2 mm và nhỏ hơn 4 mm, con vật không có triệu chứng lâm sàng: Nghi ngờ;

- Độ sưng da trước và sau khi tiêm lớn hơn 2 mm và nhỏ hơn 4 mm, con vật có triệu chứng lâm sàng: Dương tính;

- Độ sưng da trước và sau khi tiêm bằng hoặc lớn hơn 4 mm: Dương tính.

LƯU Ý: Với những động vật cho kết quả nghi ngờ thì sau 42 ngày làm lại phản ứng. Sau khi kiểm tra lần hai, nếu cho kết quả nghi ngờ hoặc dương tính, kiểm tra lại bằng phản ứng tiêm nội bì hai mũi tuberculin PPD bò và tuberculin PPD gà.

6.4.2.2  Đọc kết quả khi tiêm một mũi ở nếp gấp da đuôi

Kết quả cho thấy:

- Phản ứng là dương tính: Khi độ sưng da tại vị trí tiêm trừ độ dày da bên không tiêm bằng hoặc lớn hơn 4 mm;

- Phản ứng âm tính: Khi độ sưng da tại vị trí tiêm trừ độ dày da bên không tiêm nhỏ hơn 2 mm;

- Phản ứng nghi ngờ: Khi độ sưng da tại vị trí tiêm trừ độ dày da bên không tiêm lớn hơn 2 mm và nhỏ hơn 4 mm.

6.4.2.3  Đọc kết quả khi tiêm hai mũi

Kết quả cho thấy:

- Kết quả dương tính: Độ sưng da tại vị trí tiêm tuberculin PPD bò lớn hơn độ sưng da tại vị trí tiêm tuberculin PPD gà, chênh lệch giữa hai độ sưng lớn hơn 4 mm;

- Kết quả nghi ngờ: Độ sưng da tại vị trí tiêm tuberculin PPD bò lớn hơn độ sưng da tại vị trí tiêm tuberculin PPD gà, chênh lệch giữa hai độ sưng là từ 2 mm đến 4 mm;

- Kết quả âm tính: Độ sưng da tại vị trí tiêm tuberculin PPD bò bằng hoặc nhỏ hơn độ sưng da tại vị trí tiêm tuberculin PPD gà.

6.5  Lấy mẫu, bảo quản và vận chuyển mẫu bệnh phẩm

6.5.1  Lấy mẫu

Bệnh phẩm là đờm, mẫu mô nghi ngờ có hạt lao, mẫu máu chống đông.

Lấy mẫu đờm: Dùng tăm bông (5.5) đưa vào miệng gia súc kích thích vòm họng để gia súc ho mạnh, bật đờm ra bám vào bông. Sau đó cho bông vào ống đã có môi trường bảo quản mẫu (xem B.7).

Lấy các mô (phổi, gan, lách,…) nghi ngờ có hạt lao với lượng từ 50 g đến 200 g, cho vào hộp đựng mẫu (5.23).

Lấy mẫu máu: Sát trùng xung quanh vùng định lấy mẫu (tai, cổ, đuôi) bằng bông cồn 70 %. Dùng bơm tiêm (5.4) để lấy khoảng 5 ml đến 10 ml máu. Chuyển 5 ml mẫu máu vào ống thu đã có chất chống đông (5.21), trộn đều bằng cách lắc nhẹ đảo ngược ống khoảng 10 lần.

6.5.2  Bảo quản mẫu

- Mẫu bệnh phẩm được để trong dụng cụ đựng mẫu (5.23) có môi trường bảo quản, đóng kín, dán nhãn ghi rõ tên bệnh phẩm;

- Dụng cụ chứa mẫu bệnh phải giữ trong điều kiện lạnh từ 2 °C đến 8 °C;

- Các mẫu bệnh phải có giấy yêu cầu xét nghiệm kèm theo ghi rõ bệnh sử, triệu chứng, bệnh tích, đặc điểm dịch tễ của gia súc.

6.5.3  Đóng gói và vận chuyển mẫu

Mẫu bệnh phẩm nghi mắc bệnh lao bò được đóng gói 3 lớp, đảm bảo an toàn sinh học trong quá trình vận chuyển đến phòng xét nghiệm.

- Lớp thứ 1 (lớp đựng mẫu bệnh phẩm): Có thể là hộp nhựa cứng có nắp xoáy, đảm bảo không rò rỉ, không thấm nước, không dễ vỡ, được đóng kín, dán nhãn bên ngoài (loại mẫu, ngày, chủ gia súc, nơi lấy mẫu...).

Bao lớp thứ 1 bằng vật liệu dễ thấm hút (bông, giấy thấm,...) đặt vào trong lớp thứ 2. Nếu có nhiều ống đựng mẫu thì mỗi ống cần được bao, bọc riêng để tránh tiếp xúc và có lớp vật liệu thấm hút bên ngoài.

- Lớp thứ 2: Bảo vệ lớp thứ 1, có thể là hộp nhựa hoặc túi túi nylon đảm bảo không rò rỉ, không thấm nước, không dễ vỡ, được đóng kín, dán nhãn ghi thông tin mẫu ở bên ngoài (loại mẫu, ngày, chủ gia súc, nơi lấy mẫu,..). Giữa lớp thứ 1 và thứ 2 có lớp vật liệu thấm hút để tránh rò rỉ mẫu.

- Lớp thứ 3 (là lớp ngoài cùng): Bao quanh lớp thứ 2, có thể là thùng bảo ôn hoặc hộp xốp, đảm bảo đủ cứng, không bục vỡ mẫu trong quá trình vận chuyển.

CHÚ THÍCH: Trong quá trình đóng gói và vận chuyển có thể dùng đá chuyên dụng để đảm bảo nhiệt độ bảo quản. Đá được để ở giữa lớp thứ 1 và lớp thứ 2 hoặc giữa lớp thứ 2 và lớp thứ 3.

7  Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

7.1  Xử lý mẫu

- Bệnh phẩm là đờm hoặc các mẫu mô nghi ngờ có hạt lao được nghiền với dung dịch PBS (4.6) theo tỷ lệ 1: 9 (phần thể tích) bằng cối chày sứ (5.16) hoặc máy dập mẫu thành huyễn dịch.

- Huyễn dịch được khử tạp khuẩn bằng dung dịch axit oxalic 5 % (4.7) hoặc dung dịch natri hydroxit 2 % (4.9) hoặc dung dịch natri hydroxit 4 % (4.9). Lắc huyễn dịch trong 10 min ở nhiệt độ phòng (khoảng 24 °C) rồi đem trung hòa với dung dịch axit clohydric 2 N (4.8), sau đó ly tâm bằng máy ly tâm (5.12). Thu phần cặn để nuôi cấy và kiểm tra hình thái dưới kính hiển vi (5.9).

- Bệnh phẩm là mẫu máu được sử dụng cho phản ứng Bovigam, phát hiện gamma interferon (xem Phụ lục C.1).

Với phòng thí nghiệm đạt tiêu chuẩn an toàn sinh học cấp II được thực hiện các kỹ thuật sinh học phân tử, nhuộm và quan sát vi khuẩn đã được bất hoạt.

Với phòng thí nghiệm đạt tiêu chuẩn an toàn sinh học cấp III được thực hiện xử lý mẫu bệnh phẩm, nuôi cấy, phân lập, xét nghiệm với vi khuẩn chưa bất hoạt.

7.2  Xác định hình thái vi khuẩn M. bovis

Sử dụng mẫu bệnh phẩm là mẫu đờm làm tiêu bản rồi đem nhuộm bằng phương pháp Ziehl-Neelsen.

Cách làm tiêu bản: Chọn những hòn mủ xanh, vàng nghiền nát với nước muối sinh lý vô trùng, cho thêm natri hydroxit 1 % (4.9) cho vào đờm, trộn đều rồi ly tâm bằng máy ly tâm (5.12) với gia tốc 2000 g đến 2500 g trong 15 min, lấy cặn làm tiêu bản.

Nhuộm tiêu bản: xem Phụ lục A.

Soi tiêu bản: M. bovis bắt màu đỏ trên nền xanh. Vi khuẩn có dạng mảnh, hơi cong hoặc đứng thành cụm, không nha bào, không giáp mô. Trong canh trùng non (sau khoảng 2 tuần nuôi cấy), vi khuẩn có thể đứng riêng lẻ hoặc tạo thành chuỗi cong như chữ S. Trong canh trùng già (sau khoảng 6 tuần), vi khuẩn có hình sợi dài, phân nhánh.

Cần lưu ý rằng việc xác định hình thái của vi khuẩn bằng kính hiển vi chỉ là nhận định ban đầu, chưa thể kết luận được bệnh vì trong bệnh phẩm đờm của người và gia súc có nhiều vi khuẩn kháng axit khác. Những vi khuẩn này có hình thái giống M. bovis nhưng ngắn và mập hơn, kháng axit kém hơn M. bovis.

7.3  Nuôi cấy vi khuẩn M. bovis

Dùng que cấy (5.15) lấy chất cặn (xem 7.1) cho vào một trong hai môi trường lỏng là Middlebbrook 7H9 (xem Phụ lục B.2.1) hoặc Middlebbrook 7H12 (xem Phụ lục B.2.4).

Dùng que cấy (5.15) lấy chất cặn (xem 7.1) ria cấy lên một trong ba loại ống thạch nghiêng Lowenstein-Jensen (xem Phụ lục B.1) hoặc Middlebrook 7H10 (xem Phụ lục B.2.2) hoặc Middlebrook 7H11 (xem Phụ lục B.2.3).

Ủ ở 37 °C và quan sát tính chất mọc của vi khuẩn trong thời gian ít nhất là 8 tuần (thường từ 10 tuần đến 12 tuần). Tất cả các môi trường đã cấy cặn được bịt kín để tránh bị khô do thời gian nuôi mẫu dài.

7.4  Xác định vi khuẩn M. bovis

7.4.1  Xác định tính chất mọc của vi khuẩn M. bovis trên các môi trường

Tùy theo môi trường nuôi cấy mà thời gian mọc của vi khuẩn sẽ khác nhau. M. bovis thường mọc sau từ 3 tuần đến 6 tuần nuôi cấy ở nhiệt độ 37 °C; và không mọc ở 22 °C hoặc 45 °C.

- Trên môi trường lỏng (môi trường Middlebbrook 7H9 hoặc môi trường Middlebbrook 7H12): M. bovis mọc thành váng, đám hoặc lắng cặn.

- Trên môi trường thạch (môi trường Lowenstein-Jensen hoặc trên môi trường Middlebrook 7H10 hoặc môi trường Middlebrook 7H11): Sau từ 4 tuần đến 6 tuần nuôi cấy, M. bovis mới hình thành khuẩn lạc điển hình dạng R (Rough), sần sùi như hình hoa lơ, màu trắng nhạt.

7.4.2  Xác định hình thái vi khuẩn M. bovis từ môi trường nuôi cấy

- Xác định hình thái bằng phương pháp nhuộm Ziehl-Neelsen theo quy định trong Phụ lục A.

- M. bovis hình gậy mảnh, bắt màu đỏ trên nền xanh.

7.4.3. Xác định các đặc tính sinh hóa của vi khuẩn M. bovis

Các đặc tính sinh hóa đặc trưng của M. bovis được trình bày ở Bảng 1.

Bảng 1 - Đặc tính sinh hóa của M. bovis

Cách tiến hành: xem Phụ lục B.

7.5  Phản ứng Bovigam (Phản ứng phát hiện Gamma interferon)

7.5.1  Nguyên lý của phản ứng

Gamma interferon (IFN-gamma) là một cytokin quan trọng do tế bào TH1 (một loại tế bào lympho T) tiết ra. Tế bào TH1 có vai trò quan trọng trong miễn dịch qua trung gian tế bào.

Bovigam là phản ứng sandwich ELISA phát hiện IFN-gamma được sinh ra bằng cách sử dụng tế bào máu. Nếu gia súc bị nhiễm M. bovis thì khi lấy máu đem ủ với lao tố (PPD) sẽ sản sinh ra IFN-gamma.

Do vậy, phản ứng Bovigam gồm 2 bước:

- Bước 1: Xử lý mẫu máu (xem Phụ lục C.1) để thu IFN-gamma;

- Bước 2: Tiến hành phản ứng sandwich ELISA (xem Phụ lục C.3) để phát hiện IFN-gamma.

7.5.2  Cách tiến hành phản ứng và đọc kết quả

Xem Phụ lục C.

8  Kết luận

Gia súc được kết luận mắc bệnh lao bò khi có đặc điểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đặc trưng của bệnh và có một trong các kết quả sau đây:

- Kết quả nuôi cấy, xác định được M. bovis bằng tính chất mọc trên các loại môi trường (xem Điều 7.4.1) và bằng các phản ứng sinh hóa (xem Điều 7.4.3);

- Phản ứng dò lao nội bì dương tính (xem Điều 6.4);

- Phản ứng Bovigam dương tính (xem Điều 7.5).

Phụ lục A

(Quy định)

Phương pháp nhuộm Ziehl-Neelsen (ZN)

A.1  Thuốc nhuộm

A.1.1  Cacbon fuchsin đặc

Thành phần:

Cách chuẩn bị:

Fuchsin basic được hòa tan trong etanol, phenol được hòa tan trong nước.

Trộn 2 dung dịch này với nhau và để vài ngày rồi lọc qua giấy lọc.

Bảo quản trong dụng cụ thí nghiệm (chai, lọ) ở nhiệt độ phòng.

A.1.2  Dung dịch axit - alcohol

Thành phần:

Axit clohydric đặc 8,0 ml

Etanol 95 % (phần thể tích) 97,0 ml

LƯU Ý: Nên cho axit dohydric vào cồn etanol.

A.1.3  Dung dịch xanh metylen

Thành phần:

Cách chuẩn bị:

Hòa tan các thành phần trên vào nước.

Để vài ngày rồi lọc qua giấy lọc.

Bảo quản trong dụng cụ thí nghiệm (chai, lọ) ở nhiệt độ phòng.

A.2  Cách tiến hành

Cho cacbon fushin ngập tiêu bản đã được cố định và được đặt trên giá. Dùng ngọn lửa đèn cồn (5.17) đốt phía dưới tiêu bản để thuốc nhuộm bốc hơi trong 10 min nhưng không được sôi.

Nhỏ dung dịch axit - alcohol trong 15 min (tẩy nhiều lần).

Nhỏ xanh metylen lên tiêu bản trong 20 s.

Rửa tiêu bản bằng nước, để khô.

A.3  Soi tiêu bản

Nhỏ một giọt dầu vào tiêu bản và quan sát tiêu bản bằng kính hiển vi (5.9) quang học bằng với vật kính độ phóng đại 100 X.

Phụ lục B

(Quy định)

Môi trường nuôi cấy vi khuẩn và phương pháp kiểm tra đặc tính sinh hóa

B.1  Môi trường Lowenstein-Jensen

B.1.1  Chuẩn bị

Thành phần:

CHÚ THÍCH: Để nuôi cấy vi khuẩn M. bovis, môi trường Lowenstein-Jensen không bổ sung glycerol hoặc có bổ sung glycerol hoặc bổ sung natri pyruvat (C₃H₃NaO₃) 0,4 % hoặc bổ sung axit thiophen-2-cacbonic hydrazide

VÍ DỤ: Dùng môi trường Lowenstein-Jensen của hãng Sigma (Cat. No. L3910) 1), thành phần cho môi trường Lowenstein-Jensen được nêu ở B.1.1.

B.1.2  Tiến hành

- Hòa tan 37,3 g các thành phần môi trường trên trong 600 ml nước cất có chứa 12 ml natri pyruvat.

- Đun sôi cho tan hoàn toàn các thành phần trên.

- Vô trùng môi trường bằng nồi hấp (5.10) ở 121 °C trong 15 min.

- Chuẩn bị 1000 ml huyễn dịch trứng vô trùng, được đồng nhất lòng đỏ và lòng trắng. Thao tác chuẩn bị huyễn dịch trứng phải vô trùng, tránh tạo bọt.

- Đợi môi trường đã vô trùng nguội khoảng 50 °C đến 60 °C thì bổ sung 1000 ml huyễn dịch trứng vào.

- Chia môi trường ra ống nghiệm (5.13), khoảng 10 ml mỗi ống.

- Đặt ít nhất một ống môi trường Lowenstein-Jensen vào trong tủ ấm (5.8) ủ 37 °C với điều kiện hiếu khí để kiểm tra vô trùng. Sau từ 18 h đến 24 h, trên bề mặt môi trường Lowenstein-Jensen không có khuẩn lạc mọc là đảm bảo vô trùng sẽ được bảo quản và sử dụng.

- Bảo quản các ống môi trường Lowenstein-Jensen trong tủ lạnh (5.19) ở nhiệt độ 4 °C.

B.2  Môi trường canh thang Middlebbrook 7H9, 7H10, 7H11, 7H12

B.2.1  Môi trường Middlebbrook 7H9

Thành phần 1:

Điều chỉnh pH = 6,8 ± 0,2 ở 25 °C.

Thành phần 2: Dung dịch kháng sinh

Hòa tan các thành phần 2, vô trùng dung dịch bằng màng lọc có kích thước lỗ lọc 0,45 μm.

Cách tiến hành:

- Hòa tan các thành phần 1 trong 1000 ml nước cất.

- Đun sôi cho tan hoàn toàn các thành phần trên.

- Vô trùng môi trường bằng nồi hấp (5.10) ở 121 °C trong 15 min.

- Đợi môi trường đã vô trùng nguội khoảng 40 °C thì bổ sung 5 ml dung dịch kháng sinh và lắc đều.

- Chia môi trường ra ống nghiệm (5.13), khoảng 10 ml mỗi ống.

- Đặt ít nhất một ống môi trường Middlebbrook 7H9 vào trong tủ ấm (5.8) ủ 37 °C với điều kiện hiếu khí để kiểm tra vô trùng. Sau từ 18 h đến 24 h, không đục, không có váng là đảm bảo vô trùng sẽ được bảo quản và sử dụng.

- Bảo quản các ống môi trường Middlebbrook 7H9 trong tủ lạnh (5.19) ở nhiệt độ 4 °C.

B.2.2  Môi trường Middlebbrook 7H10

Thành phần 1:

Điều chỉnh pH = 6,6 ± 0,2 ở 25 °C.

Thành phần 2: Dung dịch tăng trưởng Middlebrook OADC

Hòa tan các thành phần 2 của dung dịch tăng trưởng Middlebrook OADC. Vô trùng dung dịch bằng màng lọc có kích thước lỗ lọc 0,45 μm.

Cách tiến hành:

- Hòa tan các thành phần 1 trong 900 ml nước cất.

- Đun sôi cho tan hoàn toàn các thành phần trên.

- Vô trùng môi trường bằng nồi hấp (5.10) ở 121 °C trong 15 min.

- Đợi môi trường đã vô trùng nguội khoảng 40 °C thì bổ sung 100 ml dung dịch tăng trưởng Middlebrook OADC và lắc đều.

- Chia môi trường ra ống nghiệm (5.13), khoảng 10 ml mỗi ống.

Đặt ít nhất một ống môi trường Middlebbrook 7H10 vào trong tủ ấm (5.8) ủ 37 °C với điều kiện hiếu khí để kiểm tra vô trùng. Sau từ 18 h đến 24 h, không đục, không có váng là đảm bảo vô trùng sẽ được bảo quản và sử dụng.

- Bảo quản các ống môi trường Middlebbrook trong tủ lạnh (5.19) ở nhiệt độ 4 °C.

B.2.3  Môi trường Middlebbrook 7H11

Thành phần 1:

Điều chỉnh pH = 6,6 ± 0,2 ở 25 °C.

Thành phần 2: Dung dịch tăng trưởng Middlebrook OADC

Hòa tan các thành phần 2 của dung dịch tăng trưởng Middlebrook OADC. Vô trùng dung dịch bằng màng lọc có kích thước lỗ lọc 0,45 μm.

Thành phần 3: Dung dịch kháng sinh

Cách tiến hành:

- Hòa tan các thành phần trên trong 900 ml nước cất.

- Đun sôi cho tan hoàn toàn các thành phần trên.

- Vô trùng môi trường bằng nồi hấp (5.10) ở 121 °C trong 15 min

- Đợi môi trường đã vô trùng nguội khoảng 40 °C thì bổ sung 100 ml dung dịch tăng trưởng Middlebrook OADC và 5 ml dung dịch kháng sinh và lắc đều.

- Chia môi trường ra ống nghiệm (5.13), khoảng 10 ml mỗi ống.

- Đặt ít nhất một ống môi trường Middlebbrook 7H11 vào trong tủ ấm (5.8) ủ 37 °C với điều kiện hiếu khí để kiểm tra vô trùng. Sau từ 18 h đến 24 h, không đục, không có váng là đảm bảo vô trùng sẽ được bảo quản và sử dụng.

- Bảo quản các ống môi trường Middlebbrook 7H11 trong tủ lạnh (5.19) ở nhiệt độ 4 °C.

B.2.4  Môi trường Middlebbrook 7H12

Thành phần 1:

Điều chỉnh pH = 6,8 ± 0,2 ở 25 °C.

Thành phần 2: Dung dịch tăng trưởng Middlebrook OADC

Thành phần 3: Dung dịch kháng sinh

Cách tiến hành:

- Hòa tan các thành phần trên trong 900 ml nước cất.

- Đun sôi cho tan hoàn toàn các thành phần trên.

- Vô trùng môi trường bằng nồi hấp (5.10) ở 121 °C trong 15 min.

- Đợi môi trường đã vô trùng nguội khoảng 40 °C thì bổ sung 100 ml dung dịch dung dịch tăng trưởng Middlebrook OADC và 5 ml dung dịch kháng sinh, lắc đều.

- Chia môi trường ra ống nghiệm (5.13), khoảng 10 ml mỗi ống.

- Đặt ít nhất một ống môi trường Middlebbrook 7H12 vào trong tủ ấm (5.8) ủ 37 °C với điều kiện hiếu khí để kiểm tra vô trùng. Sau từ 18 h đến 24 h, không đục, không có váng là đảm bảo vô trùng sẽ được bảo quản và sử dụng.

- Bảo quản các ống môi trường Middlebbrook 7H12 trong tủ lạnh (5.19) ở nhiệt độ 4 °C.

B.3  Phân giải nitrat

B.3.1  Chuẩn bị

Thuốc thử:

- Dung dịch natri nitrat (NaNO₃) (pha dung dịch natri nitrat 0,01 M trong đệm phosphat 0,022 M, pH 7)

- Axít clohydric đặc pha loãng với nước theo tỷ lệ 1:1 về thể tích

- Dung dịch sulphanilamid 0,2 %

- Dung dịch N-(1-naphthyl) etylendiamin dihydrocloma 0,1 %

- Nước cất, vô trùng.

B.3.2  Các tiến hành

- Cho vài giọt nước cất vào 1 ống nghiệm và dùng que cấy (5.15) lấy 1 vòng canh khuẩn M. bovis;

- Dùng một ống nghiệm khác có nước cất, không cấy vi khuẩn để làm đối chứng âm;

- Cho 2 ml dung dịch natri nitrat;

- Lắc rồi ủ trong nồi cách thủy ở 37 °C trong 2 h;

- Cho tiếp vào ống nghiệm 1 giọt axit clohydric, 2 giọt dung dịch sulphanilamid, 2 giọt dung dịch N-(1-naphthyl) etylendiamin dihydroclorua.

B.3.3  Đọc kết quả

- Phản ứng dương tính: Dung dịch trong ống có màu đỏ;

- Phản ứng âm tính: Dung dịch trong có màu giống đối chứng âm và có màu hồng.

B.4  Kiểm tra sự mẫn cảm với pyrazinamid

B.4.1  Chuẩn bị

Thành phần môi trường Dubos:

VÍ DỤ: Dùng môi trường Môi trường nước thịt Dubos của hãng Himedia (Cat. No. M067) 2).

Hòa tan các thành phần trên.

Chia vào ống nghiệm có nắp vặn 15 ml/ống. Hấp ở 121 °C trong 15 min rồi để rắn thạch ở vị trí thẳng.

B.4.2  Tiến hành

Dùng que cấy (5.15) lấy canh khuẩn hoặc khuẩn lạc M. bovis nghi ngờ (xem 7.4.1) cấy vào môi trường. Nuôi trong tủ ấm (5.8), sau 96 h (4 ngày) tiếp tục tiến hành phản ứng với dung dịch amoni sắt (II) sulfat.

Cho 1 ml dung dịch amoni sắt (II) sulfat mới chuẩn bị vào ống môi trường đã nuôi cấy vi khuẩn và để vào tủ lạnh (5.19) trong 4 h.

CHÚ THÍCH: Có sử dụng một ống không cấy và một ống cấy M. avium làm đối chứng âm và dương.

B.4.3  Đọc kết quả

- Phản ứng dương tính: Có một vạch màu hồng trên bề mặt môi trường;

- Phản ứng âm tính: Môi trường không chuyển màu.

Vi khuẩn M. bovis không mẫn cảm với pyrazinamid (phản ứng pyrazinamid âm tính).

B.5  Kiểm tra khả năng sinh urease

B.5.1  Chuẩn bị

Có thể sử dụng môi trường urê cơ bản (urea agar base - Christensen).

Pha chế môi trường và bổ sung urê theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Chia vào môi trường vào ống nghiệm (5.13), mỗi ống 4 ml.

B.5.2  Cách tiến hành

Dùng que cấy (5.15) lấy canh khuẩn hoặc khuẩn lạc M. bovis nghi ngờ (xem 7.4.1) cấy vào môi trường urê (B.5.1). Nuôi trong tủ ấm (5.8), đọc kết quả sau 72 h.

B.5.3  Đọc kết quả

- Phản ứng dương tính: Môi trường chuyển sang màu hồng;

- Phản ứng âm tính: Môi trường không chuyển màu.

Vi khuẩn M. bovis có khả năng sinh urease (phản ứng sinh urease dương tính).

B.6  Sản sinh niacin

Nên sử dụng kít thương phẩm (ví dụ sản phẩm của Difco) vì chuẩn bị phản ứng này cần sử dụng dung dịch brom xyanua (BrCN) là chất độc đối với cơ thể.

Vi khuẩn M. bovis có khả năng sinh niacin (phản ứng sinh niacin dương tính).

B.7  Môi trường bảo quản và vận chuyển mẫu (Môi trường Cary Blair)

Thành phần:

Có thể sử dụng môi trường thương mại đã pha sẵn hoặc môi trường tự pha chế theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: Dùng môi trường Cary Blair chế sẵn của hãng Aptaca (Cat. No. 309/SG); Hoặc môi trường Cary Blair tự pha chế của hãng Himedia (Cat. No. M202) hoặc của hãng Alpha Biosciences (Cat. No. CO3-125)

Cách tiến hành:

Chuẩn bị môi trường bảo quản và vận chuyển mẫu theo hướng dẫn của nhà sản xuất, phân phối vào các bình. Đưa các bình chứa môi trường vào nồi hấp (5.10) hấp tiệt trùng ở 100 °C trong 15 min.

Để môi trường nguội đến khoảng 40 °C thì lắc đều và phân phối ra ống đựng mẫu khoảng 7 ml/ống có dung tích 9 ml có nắp vặn chặt.

Đặt ít nhất một ống môi trường vào trong tủ ấm (5.8) ủ 37 °C với điều kiện hiếu khí để kiểm tra vô trùng. Sau từ 18 h đến 24 h, ống môi trường không đục, không có váng là đảm bảo vô trùng sẽ được bảo quản và sử dụng.

Bảo quản các ống môi trường trong tủ lạnh (5.19) ở nhiệt độ 4 °C.

Phụ lục C

(Quy định)

Phản ứng Bovigam

C.1  Xử lý mẫu máu

Sử dụng bộ lao tố để xử lý mẫu máu. Quy trình xử lý và các bước tiến hành tuân theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: Quy trình xử lý mẫu máu với bộ lao tố PPD PACK (gồm có PPDA, PPDB, mitogen) của hãng IDvet

- Mẫu máu có chất chống đông được bảo quản ở nhiệt độ từ 16 °C đến 22 °C, tránh lắc mạnh làm vỡ hồng cầu và được chuyển về nhanh phòng thí nghiệm. Mẫu máu nên được xử lý trong khoảng 16 h kể từ lúc lấy mẫu, tốt nhất là từ 8 h đến 10 h;

- Lao tố bò và gà (PPDB và PPDA) khi sử dụng được pha loãng theo tỷ lệ lao tố : dung dịch PBS bằng 1 : 9 (phần thể tích) thành dung dịch lao tố 1X. Sử dụng trong vòng 10 h kể từ khi pha loãng và bảo quản ở nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C.

- Chuẩn bị dung dịch Mitogen:

Hoàn nguyên Mitogen từ dạng đông khô: lấy 1 ml dung dịch PBS cho vào lọ đông khô chứa chất Mitogen (1 mg/ml), để yên 5 min, rồi lắc nhẹ cho tan hoàn toàn, sẽ được dung dịch Mitogen đậm đặc. Chia nhỏ dung dịch Mitogen đậm đặc vào các ống nhỏ và bảo quản ở nhiệt độ - 20 °C.

Khi sử dụng dung dịch Mitogen, lấy 1 phần thể tích dung dịch Mitogen đậm đặc với 20 phần thể tích PBS (nồng độ cuối là 50 μg/ml) và sử dụng trong vòng 10 h kể từ khi pha loãng. Bảo quản ở nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C.

LƯU Ý: Các ống dung dịch Mitogen đậm đặc chỉ được sử dụng khi bị rã đông không quá 3 lần.

- Mẫu máu được đảo đều nhẹ nhàng khoảng 10 lần trước khi tiến hành;

- Chia máu vào đĩa 96 giếng: 1 mẫu nhỏ vào 4 giếng, 200 μl máu mỗi giếng;

- Nhỏ 200 μl mỗi loại dung dịch PBS, PPDB, PPBA, Mitogen vào mỗi giếng đã có mẫu máu;

CHÚ THÍCH 1: PBS là đối chứng âm; PPDA là kháng nguyên khác loài; PPDB là kháng nguyên loài; Mitogen là đối chứng dương.

- Lắc đĩa nhẹ nhàng bằng tay hoặc bằng máy lắc ở tốc độ 500 rpm trong thời gian từ 1 min đến 5 min.

- Ủ đĩa mẫu ở điều kiện nhiệt độ 37 °C trong thời gian từ 16 h đến 24 h;

- Ly tâm cả đĩa mẫu với gia tốc 500 g trong 10 min ở nhiệt độ phòng.

CHÚ THÍCH 2: Trong trường hợp không có máy ly tâm cho cả đĩa mẫu thì dùng pipet hút chuyển mẫu sang ống ly tâm để ly tâm thu dịch nổi phía trên.

- Hút lấy dịch trong phía trên (không được hút lẫn với hồng cầu) và chuyển sang ống khác để tiến hành ELISA hoặc lưu mẫu.

- Ống lưu mẫu được ghi ký hiệu và bảo quản ở nhiệt độ 2 °C đến 8 °C. Mẫu đã được xử lý phải được ghi ký hiệu rõ ràng, đảm bảo nhận biết được tên mẫu, xử lý với lao tố nào, ngày thu mẫu.

- Ở nhiệt độ mát từ 2 °C đến 8 °C bảo quản mẫu được 1 tuần, nhiệt độ - 20 °C bảo quản mẫu được khoảng 3 tháng và ở nhiệt độ - 70 °C bảo quản mẫu được lâu hơn.

VÍ DỤ: Quy trình xử lý mẫu máu với bộ lao tố PPD của hãng Phonics™

- Mẫu máu có chất chống đông được bảo quản ở nhiệt độ 22 °C ± 3 °C, tránh lắc mạnh làm vỡ hồng cầu và được chuyển về nhanh phòng thí nghiệm. Mẫu máu chỉ được xử lý trong khoảng thời gian tối đa 30 h kể từ khi lấy mẫu;

- Mẫu máu được đảo đều nhẹ nhàng khoảng 10 lần trước khi tiến hành;

- Chia máu vào đĩa 24 giếng (5.20): 1 mẫu nhỏ vào 3 giếng, 1,5 ml máu mỗi giếng;

- Nhỏ 100 μl dung dịch PBS vào mỗi giếng đã có mẫu máu;

- Nhỏ 100 μl dung dịch Bovigam avian PPD vào mỗi giếng đã có mẫu máu;

- Nhỏ 100 μl dung dịch Bovigam bovine PPD vào mỗi giếng đã có mẫu máu;

- Trộn đều các dung dịch trong giếng mẫu bằng pipet đa kênh (trộn khoảng 1 min), tránh thao tác hút nhả dung dịch tạo bọt khí.

- Ủ đĩa mẫu ở điều kiện nhiệt độ 37 °C trong thời gian từ 16 h đến 24 h;

- Ly tâm cả đĩa mẫu với gia tốc 500 g trong 10 min ở nhiệt độ phòng.

CHÚ THÍCH: Trong trường hợp không có máy ly tâm cho cả đĩa mẫu thì dùng pipet hút chuyển mẫu sang ống ly tâm để ly tâm thu dịch nổi phía trên.

- Hút 500 μl dịch nổi phía trên ống ly tâm (5.18) vào ống lưu.

- Ống lưu mẫu được ghi ký hiệu và bảo quản ở nhiệt độ 2 °C đến 8 °C. Mẫu đã được xử lý phải được ghi ký hiệu rõ ràng, đảm bảo nhận biết được tên mẫu, xử lý với lao tố nào, ngày thu mẫu.

VÍ DỤ: Mẫu 1 được xử lý với PBS có ký hiệu là M1-PBS; Mẫu 1 được xử lý với lao tố gà có ký hiệu là M1-PPDA; Mẫu 1 được xử lý với lao tố bò có ký hiệu là M1-PPDB.

- Ở nhiệt độ mát từ 2 °C đến 8 °C bảo quản mẫu được 1 tuần và ở nhiệt độ - 20 °C bảo quản mẫu được khoảng 3 tháng.

C.3  Tiến hành ELISA

Sử dụng kít ELISA để phát hiện IFN-gamma có trong mẫu máu đã được xử lý bằng lao tố. Các bước tiến hành tuân theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: Bộ sandwich ELISA phát hiện IFN-gamma của hãng IDvet

- Các nguyên liệu được chuẩn bị trước và để ở nhiệt độ phòng khoảng 30 min trước khi bắt đầu làm phản ứng (trừ dung dịch Conjugate được pha xong phải bảo quản ở nhiệt độ 2 °C đến 8 °C).

- Pha loãng các dung dịch:

Đối chứng dương ở trạng thải đông khô (1 mg/ml) lấy 1 ml nước cất cho vào lọ đông khô, để yên 5 min rồi lắc nhẹ cho tan hoàn toàn. Chia nhỏ đối chứng dương vào các ống nhỏ và bảo quản ở nhiệt độ - 20 °C. Nếu đối chứng dương bảo quản ở nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C được sử dụng trong vòng 1 tuần.

LƯU Ý: Các ống đối chứng dương chỉ được sử dụng khi bị rã đông không quá 3 lần.

Dung dịch rửa (Wash Solution) 1 X: được pha loãng từ dung dịch rửa đậm đặc 20 X (Wash Solution 20 X) với nước cất theo tỷ lệ H1 phần thể tích dung dịch 20 X với 19 phần thể tích nước cất.

Dung dịch Conjugate 1 X: được pha loãng từ dung dịch Conjugate 10X với dung dịch pha loãng mẫu 1 X theo tỷ lệ 1 phần thể tích dung dịch Conjugate 10 X với 9 phần thể tích dung dịch pha loãng mẫu 1 X.

- Nhỏ 25 μl dung dịch Đệm pha loãng 1 (Dilution Buffer) vào tất cả các giếng trong đĩa;

- Nhỏ 25 μl đối chứng âm (vào giếng A1 và B1), đối chứng dương (vào giếng C1 và D1);

- Nhỏ 25 μl mẫu (mẫu đã được xử lý ở bước trên) vào các giếng theo sơ đồ bố trí thí nghiệm;

- Đậy nắp đĩa thí nghiệm, lắc nhẹ đĩa trong 2 min. Ủ đĩa trong tủ ấm ở 37 °C (± 2 °C) trong 1 h;

- Đổ bỏ dung dịch trong đĩa thí nghiệm. Rửa đĩa bằng dung dịch rửa 1 X. Nhỏ 300 μl dung dịch rửa mỗi giếng. Đổ bỏ dung dịch trong đĩa thí nghiệm. Rửa đĩa bằng dung dịch rửa 1 X. Nhỏ 300 μl dung dịch rửa mỗi giếng. Rửa lặp lại 6 lần.

- Nhỏ 100 μl dung dịch Conjugate 1 X vào tất cả các giếng trong đĩa;

- Đậy nắp đĩa thí nghiệm. Ủ đĩa trong tủ ấm 37 °C (± 2 °C) trong 1 h;

- Đổ bỏ dung dịch trong đĩa thí nghiệm. Rửa đĩa bằng dung dịch rửa 1 X. Nhỏ 300 μl dung dịch rửa mỗi giếng. Rửa lặp lại 6 lần.

- Nhỏ 100 μl dung dịch cơ chất (Substrate Solution) vào tất cả các giếng trong đĩa;

- Để đĩa ở nhiệt độ phòng trong 15 min và tránh ánh sáng;

- Nhỏ 100 μl dung dịch dừng phản ứng (Stop Solution) vào tất cả các giếng trong đĩa;

- Đo giá trị OD ở bước sóng 450 nm.

Đọc kết quả:

Phản ứng ELISA có ý nghĩa khi: Giá trị OD ở giếng đối chứng dương > 0,5 và tỷ số giá trị OD ở giếng đối chứng dương với giá trị OD ở giếng đối chứng âm > 3.

Nếu giá trị OD ở các giếng đối chứng không có ý nghĩa thì phải tiến hành lại phản ứng.

Tính tỷ số S/P của từng mẫu theo Công thức sau:

- Mẫu dương tính: S/P ≥ 35 % (có sản sinh IFN-gamma)

- Mẫu âm tính: S/P < 35 % (không sản sinh IFN-gamma)

VÍ DỤ: Bộ kít BOVIGAM^® TB (Cat. No. 63320) của hãng Prionics™

- Các nguyên liệu được chuẩn bị trước và để ở nhiệt độ phòng khoảng 30 min trước khi bắt đầu làm phản ứng (trừ dung dịch Conjugate được pha xong phải bảo quản ở nhiệt độ 2 °C đến 8 °C).

- Pha loãng các dung dịch:

Dung dịch rửa 1 X: Được pha loãng từ dung dịch rửa 20 X với nước cất theo tỷ lệ 1 phần thể tích dung dịch 20 X với 19 phần thể tích nước cất.

Dung dịch pha loãng mẫu 1X: Được pha loãng từ dung dịch dung dịch pha loãng màu xanh (Blue Diluents 5X) với nước cất theo tỷ lệ 1 phần thể tích dung dịch pha loãng màu xanh 5 X với 4 phần thể tích nước cất.

Dung dịch Conjugate 1 X: Được pha loãng từ dung dịch Conjugate 100 X với dung dịch pha loãng mẫu 1 X theo tỷ lệ 1 phần thể tích dung dịch Conjugate 100 X với 99 phần thể tích dung dịch pha loãng mẫu 1 X.

Dung dịch chromogen 1 X: Được pha loãng từ dung dịch chromogen 100 X với dung dịch đệm cơ chất enzym theo tỷ lệ 1 phần thể dung dịch chromogen 100 X với 99 phần thể tích dung dịch đệm cơ chất enzym.

- Nhỏ 50 μl dung dịch pha loãng mẫu vào tất cả các giếng trong đĩa;

- Nhỏ 50 μl đối chứng âm, đối chứng dương vào các giếng theo sơ đồ bố trí thí nghiệm;

- Nhỏ 50 μl mẫu (mẫu đã được xử lý ở bước trên) vào các giếng theo sơ đồ bố trí thí nghiệm;

- Trộn đều mẫu bằng máy lắc (5.11) trong 1 min; hoặc pipet lên xuống 5 lần; hoặc đậy nắp đĩa thí nghiệm và lắc đĩa bằng máy lắc (5.11) với tốc độ 600 rpm trong 1 min.

- Để đĩa ở nhiệt độ phòng khoảng 22 °C ± 3 °C trong 60 min;

Bảng C.1 - Sơ đồ bố trí thí nghiệm

CHÚ THÍCH: ĐC (-) là đối chứng âm; ĐC (+) là đối chứng dương; M-PBS là mẫu được xử lý với PBS; M-PPDA là mẫu được xử lý với lao tố gà; M-PPDB là mẫu được xử lý với lao tố bò.

- Đổ bỏ dung dịch trong đĩa thí nghiệm. Rửa đĩa bằng dung dịch rửa 1 X. Nhỏ 300 μl dung dịch rửa mỗi giếng. Rửa lặp lại 6 lần.

- Nhỏ 100 μl dung dịch Conjugate 1 X vào tất cả các giếng trong đĩa;

- Đậy nắp đĩa thí nghiệm và lắc đĩa bằng máy lắc (5.11) với tốc độ 600 rpm trong 60 min ở nhiệt độ phòng khoảng 22 °C ± 3 °C.

- Đổ bỏ dung dịch trong đĩa thí nghiệm. Rửa đĩa bằng dung dịch rửa 1 X. Nhỏ 300 μl dung dịch rửa mỗi giếng. Rửa lặp lại 6 lần.

- Nhỏ 100 μl dung dịch chromogen 1 X vào tất cả các giếng trong đĩa;

- Đậy nắp đĩa thí nghiệm và lắc đĩa bằng máy lắc (5.11) với tốc độ 600 rpm trong 1 min.

- Để đĩa ở nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng trong 30 min;

- Nhỏ 50 μl dung dịch ngăn tạo enzym vào tất cả các giếng;

- Đợi 5 min và đo giá trị OD ở bước sóng 450 nm.

Đọc kết quả:

Phản ứng ELISA có ý nghĩa khi: Giá trị OD ở giếng đối chứng âm < 0,13 ± 0,04 và giá trị OD ở giếng đối chứng dương > 0,70 ± 0,21.

Nếu giá trị OD ở các giếng đối chứng không có ý nghĩa thì phải tiến hành lại phản ứng.

- Mẫu dương tính: Khi giá trị OD ở giếng PPDB - giá trị OD ở giếng PPDA ≥ 0,1 và giá trị OD ở giếng PPDB - giá trị OD ở giếng PPD PBS ≥ 0,1.

- Mẫu âm tính: Khi giá trị OD ở giếng PPDB - giá trị OD ở giếng PPDA < 0,1 và giá trị OD ở giếng PPDB - giá trị OD ở giếng PPD PBS < 0,1.

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] OIE, 2018. Mannual of Diagnostic Test and Vaccines for Terrestrial Animals. Chapter 3.4.6,- Bovine tuberculosis.

[2] P. J. Quinn, M. E. Carter, B. Markey, G. R. Carter, 2004. Clinical Veterinary Microbiology, Part 12: Mycobacterium species. The 6th edition. Printed in Spain, p.156 - 169.

[3] JICA, 2003. Standard Diagnostic Manual for livestock diseases in Thailand.

[4] Nguyễn Bá Hiên, Huỳnh Thị Mỹ Lệ, Lê Văn Lãnh, Đỗ Ngọc Thúy, 2012. Giáo trình bệnh truyền nhiễm thú y. Chương 2: Bệnh truyền nhiễm chung giữa người và động vật - Phần 7: Bệnh Lao, trang 130 - 144.