TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 12621:2019

PHÂN BÓN - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG AXIT AMIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

Fertilizers - Determination of amino acids content by high performance liquid chromatography method (HPLC)

Lời nói đầu

TCVN 12621:2019 do Viện Quy hoạch và Thiết kế Nông nghiệp biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

PHÂN BÓN - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG AXIT AMIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

Fertilizers - Determination of amino acids content by high performance liquid chromatography method (HPLC)

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng axit amin tự do (tổng hợp và tự nhiên) và axit amin ở dạng tổng số (liên kết peptit và tự do) trong phân bón bằng thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) có cột trao đổi ion.

Tiêu chuẩn này áp dụng cho các axit amin sau: tổng của cystin và cystein; methionin; lysin; threonin; alanin; arginin; axit aspartic; axit glutamic; glycin; histidin; iso leucin; leucin; phenylalanin; prolin; serin; tyrosin; valin.

Tiêu chuẩn này không phân biệt giữa các muối của axit amin, cũng không phân biệt các dạng đồng phân D và L của axit amin.

Tiêu chuẩn không áp dụng để xác định tryptophan hoặc các chất tương tự axit amin có chứa nhóm hydroxyl.

2  Thuật ngữ và định nghĩa

Tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ và định nghĩa sau:

2.1

Axit amin tự do (free amino acid)

Nhóm axit amin ưa nước, có liên kết chặt chẽ với môi trường nước và thường tạo liên kết hydro với môi trường và giữa các axit amin với nhau.

2.2

Axit amin ở dạng liên kết peptit (peptide-linked amino acids)

Nhóm axit amin kỵ nước không hoặc khó tan trong nước, do vậy phần lớn các axit amin nằm ở phần nội của protein.

2.3

Axit amin tổng (total amino acids)

Bao gồm axit amin tự do và axit amin ở dạng liên kết peptit.

3  Nguyên tắc

3.1  Các axit amin tự do

Các axit amin tự do được chiết với dung dịch axit clohydric loãng. Các chất đồng chiết xuất có phân tử lượng lớn chứa nitơ được kết tủa với axit sulfosalicylic và được loại bằng cách lọc. Dịch lọc được điều chỉnh pH tới 2,20. Các axit amin được tách riêng biệt bằng cột trao đổi ion trong thiết bị HPLC và xác định bằng phản ứng với ninhydrin sử dụng detector quang đo ở bước sóng 570 nm.

3.2  Các axit amin tổng số

Quá trình lựa chọn phụ thuộc vào các axit amin cần xác định. Cystin, cystein và methionin sẽ bị oxy hóa tạo thành axit cysteic và methionin sulfon tương ứng, trước giai đoạn thủy phân. Tyrosin được xác định trong dịch thủy phân của các mẫu không oxy hóa. Tất cả các axit amin còn lại nêu trong Điều 1 có thể được xác định cả ở dạng mẫu bị oxy hóa và không bị oxy hóa.

Quá trình oxy hóa được thực hiện ở 0 °C với hỗn hợp axit performic và phenol. Thuốc thử oxy hóa dư được loại bỏ bằng natri sulfit. Mẫu oxy hóa hoặc không oxy hóa đều được thủy phân trong môi trường axit clohydric 6 mol/L. Dịch thủy phân được điều chỉnh pH tới 2,20. Các axit amin được tách riêng biệt bằng cột trao đổi ion trong thiết bị HPLC và xác định bằng phản ứng với ninhydrin sử dụng detector quang đo ở bước sóng 570 nm. (bước sóng 440 nm đối với prolin).

4  Thuốc thử

Trừ khi có quy định khác, trong quá trình phân tích chỉ sử dụng các hóa chất, thuốc thử có cấp độ tinh khiết dùng cho phân tích sắc ký.

4.1  Nước, sử dụng nước cất hai lần hoặc nước có chất lượng tương tự (độ dẫn điện µS).

4.2  Hydro peroxit (H₂O₂) đậm đặc.

4.3  Axit formic (HCOOH) đậm đặc.

4.4  Axit clohydric (HCl) đậm đặc, d = 1,19 g/mL.

4.5  Natri hydroxit (NaOH) dạng hạt.

4.6  Phenol (C₆H₅OH) thể rắn.

4.7  Thiodiglycol (C₄H₁₀O₂S) độ tinh khiết > 99 %.

4.8  Axit 5-sulfosalicylic (C₇H₆O₂S.2H₂O) thể rắn.

4.9  Natri citrat (Na₃C₆H₅O₇.2H₂O) thể rắn.

4.10  Natri clorua (NaCl) thể rắn

4.11  Natri sulfit (Na₂SO₃) thể rắn.

4.12  Dung môi 1-octanol (C₈H₁₈O)

4.13  Dầu nhẹ, nhiệt độ sôi từ 40 °C đến 60 °C.

4.14  Norleucin, hay bất kỳ chất khác phù hợp để sử dụng làm chất nội chuẩn.

4.15  Khí nitơ 5.0.

4.16  Các axit amin.

4.16.1  Các chất chuẩn axit amin nêu trong Điều 1.

4.16.2  Axit cysteic.

4.16.3  Methionin sulfon.

CHÚ THÍCH 1: Sử dụng các hợp chất tinh khiết không chứa nước kết tinh. Làm khô trong chân không có chứa P₂O₅ hoặc H₂SO₄ trong 1 tuần trước khi sử dụng.

4.17  Dung dịch natri hydroxit 7,5 mol/L: Hòa tan 300 g natri hydroxit (4.5) trong nước và định mức đến 1000 mL.

4.18  Dung dịch natri hydroxit 1 mol/L: Hòa tan 40 g natri hydroxit (4.5) trong nước và định mức đến 1000 mL.

4.19  Hỗn hợp chiết (axit clohydric 0,1 mol/L chứa 2 % thiodiglycol): Hút 8,2 mL axit clohydric đậm đặc (4.4) pha loãng với khoảng 900 mL nước. Thêm 20 mL thiodiglycol (4.7) và định mức đến 1000 ml bằng nước.

CHÚ THÍCH 2: Không trộn trực tiếp axit clohydric đậm đặc (4.4) và thiodiglycol (4.7)

4.20  Dung dịch axit formic-phenol: Trộn 889 g axit formic (4.3) với 111 g nước và thêm 4,73 g phenol (4.6).

4.21  Hỗn hợp thủy phân (axit clohydric 6 mol/L chứa 1 g phenol): Hòa tan 1 g phenol (4.6) vào 492 mL axit clohydric đậm đặc (4.4) và định mức đến 1000 mL bằng nước.

4.22  Dung dịch axit sulfosalicylic 6 %: Hòa tan 60 g axit sulfosalicylic (4.7) trong nước và định mức đến 1000 mL bằng nước.

4.23  Hỗn hợp oxy hóa (axit performic-phenol)

Trộn 0,5 mL hydro peroxit (4.2) với 4,5 mL hỗn hợp axit formic-phenol (4.20) trong cốc nhỏ. Giữ ở nhiệt độ trong khoảng 20 °C đến 30 °C trong 1 h nhằm tạo ra axit performic, sau đó làm lạnh trong bể điều nhiệt ở 0 °C (15 min) trước khi thêm vào mẫu.

CHÚ THÍCH 3: Tránh tiếp xúc với da và nên mặc quần áo bảo hộ.

4.24  Đệm citrat (Na⁺: 0,2 mol/L), pH = 2,20.

Hòa tan 19,61 g natri citrat (4.9), 5 mL thiodiglycol (4.7), 1 g phenol (4.6) và 16,50 ml axit clohydric đậm đặc (4.4) trong khoảng 800 mL nước. Điều chỉnh pH tới 2,20. Định mức đến 1000 mL bằng nước.

4.25  Đệm rửa giải, chuẩn bị theo các điều kiện của thiết bị phân tích được sử dụng.

4.26  Thuốc thử ninhydrin, chuẩn bị theo các điều kiện của thiết bị phân tích được sử dụng.

4.27  Dung dịch chuẩn của các axit amin

4.27.1  Dung dịch chuẩn gốc axit amin (theo Điều 1) có nồng độ là 2,5 µmol/mL trong axit HCl.

Các dung dịch này thường có sẵn trên thị trường.

4.27.2  Dung dịch chuẩn gốc axit cysteic và methionin sulfon, 1,25 µmol/mL.

Hòa tan 0,2115 g axit cysteic (4.16.2) và 0,2265 g methionin sulfon (4.16.3) trong đệm citrat (4.24) vào bình định mức dung tích 1000 mL và định mức đến vạch bằng đệm citrat.

CHÚ THÍCH 4: Các dung dịch chuẩn được bảo quản dưới 5 °C không quá 12 tháng. Dung dịch này không nên dùng nếu dung dịch chuẩn gốc (4.27.1) có chứa axit cysteic và methionin suIfon.

4.27.3  Dung dịch chuẩn gốc và chất nội chuẩn, ví dụ như norleucin 20 µmol/mL.

Hòa tan 0,6560 g norleucin (4.14) trong đệm citrat (4.24) vào bình định mức dung tích 250 mL và định mức đến vạch bằng đệm citrat. Bảo quản dưới 5 ⁰°C không quá 6 tháng.

4.27.4  Dung dịch chuẩn làm việc của các chất chuẩn axit amin, sử dụng cho các dịch thủy phân, axit cysteic và methionin sulfon có nồng độ 0,1 µmol/mL và các axit amin khác là 0,2 µmol/mL.

Hòa tan 2,2 g natri clorua (4.10) trong cốc dung tích 100 mL với 30 mL đệm citrat (4.24). Thêm 4,00 mL dung dịch chuẩn gốc axit amin (4.27.1), 4,00 mL dung dịch chuẩn gốc axit cysteic và methionin sulfon (4.27.2), và 0,50 mL chuẩn gốc của dung dịch nội chuẩn (4.27.3) nếu cần sử dụng. Điều chỉnh pH tới 2,20 bằng dung dịch natri hydroxit 1 mol/L (4.18). Chuyển định lượng vào bình định mức dung tích 50 mL và định mức bằng đệm citrat (4.24), trộn đều. Bảo quản dưới 5 °C không quá 3 tháng.

4.27.5  Dung dịch hiệu chuẩn của các chất chuẩn axit amin

Đối với đường chuẩn của các axit amin (Điều 1) sử dụng các dịch chiết được chuẩn bị theo (6.2) và với dịch thủy phân được chuẩn bị theo 6.3.2

Đối với đường chuẩn axit cysteic và methionin sulfon chuẩn bị dung dịch tương tự 4.27.4 nhưng không dùng natri clorua. Bảo quản dung dịch này dưới 5 °C không quá 3 tháng.

5  Thiết bị và dụng cụ

Sử dụng các thiết bị dụng cụ thông thường trong phòng thí nghiệm và các dụng cụ, thiết bị sau:

5.1  Bình cầu đáy tròn, dung tích 100 mL hoặc 250 mL có sinh hàn hồi lưu.

5.2  Bình thủy tinh bosilicat, dung tích 100 mL với nắp bằng cao su/teflon (ví dụ: Duran, Schott) chịu nhiệt.

5.3  Tủ sấy, có điều khiển nhiệt độ.

5.4  Thiết bị đo pH, đọc được đến ba số thập phân.

5.5  Màng lọc, 0,2 µm.

5.6  Máy ly tâm.

5.7  Bộ cất quay chân không.

5.8  Máy lắc và mấy khuấy từ.

5.9  Rây 0,25 mm.

5.10  Bể điều nhiệt.

5.11  Thiết bị HPLC có cột trao đổi ion, thiết bị dẫn suất sau cột cho ninhydrin và detector quang.

Cột được nhồi với các hạt nhựa polystyren đã được sulfonat hóa có khả năng tách axit amin ra khỏi nhau và khỏi các chất khác dương tính với ninhydrin. Tốc độ dòng của dung dịch đệm và ninhydrin được điều chỉnh bằng bơm để có tốc độ dòng ổn định ± 0,5 % trong suốt quá trình chạy đường chuẩn và phân tích mẫu.

Đối với một số thiết bị, quá trình thủy phân có thể được sử dụng mà trong đó dịch thủy phân có nồng độ natri 0,8 mol/L và chứa tất cả lượng axit formic dư từ bước oxy hóa. Một số thiết bị khác sẽ không tách tốt một số axit amin nhất định nếu dung dịch thủy phân chứa nồng độ axit formic quá dư và/hoặc nồng độ ion natri cao. Trong trường hợp này, giảm thể tích axit bằng cách làm bay hơi tới xấp xỉ 5 mL sau khi thủy phân và trước khi điều chỉnh pH. Quá trình bay hơi nên thực hiện trong điều kiện chân không ở nhiệt độ không vượt quá 40 °C.

6  Cách tiến hành

6.1  Chuẩn bị mẫu thử

6.1.1  Phân bón dạng rắn

Nghiền mẫu cho đến khi lọt qua lỗ sàng 0,25 mm. Các mẫu có độ ẩm cao sẽ được sấy khô bằng không khí ở nhiệt độ không quá 50 °C hoặc đông khô trước khi nghiền. Các mẫu có hàm lượng chất béo cao sẽ được chiết với dầu nhẹ (4.13) trước khi nghiền.

6.1.2  Phân bón dạng lỏng

Dạng dung dịch: Mẫu lấy ban đầu không ít hơn 50 mL, trước khi lấy mẫu để tiến hành phép thử mẫu phải được lắc đều.

Dạng lỏng sền sệt: Mẫu lấy ban đầu không ít hơn 200 g, trước khi lấy mẫu để tiến hành phép thử, mẫu phải được trộn đều.

6.2  Xác định các axit amin tự do

Cân một lượng mẫu phân bón phù hợp (1 g đến 5 g) chính xác đến 0,0001 g đã được chuẩn bị theo (6.1) vào bình tam giác và thêm 100 mL của hỗn hợp dịch chiết (4.19). Lắc đều trong 60 min, sử dụng máy lắc hoặc máy khuấy từ. Để cho lắng cặn rồi dùng pipet hút 10 mL dung dịch phía trên cho vào cốc có mỏ dung tích 100 mL.

CHÚ THÍCH 5: Lượng mẫu cân nên chứa lượng nitơ khoảng 10 mg và lượng nước không vượt quá 100 mg; Lượng mẫu cần chuẩn bị được tính toán như sau:

trong đó:

N_s là lượng nitơ trong mẫu thử, tính bằng phần trăm (%);

W_s là khối lượng của phần mẫu thử tương đương với lượng nitơ khoảng 10 mg, tính bằng miligam (mg).

Thêm 5 mL dung dịch axit sulfosalicylic 6 % (4.22), trong khi dịch vẫn đang khuấy và tiếp tục khuấy bằng máy khuấy từ trong 5 min. Lọc hoặc ly tâm phần nổi phía trên để loại bỏ kết tủa. Lấy 10 mL dung dịch vào cốc dung tích 100 mL, điều chỉnh pH tới 2,20 bằng dung dịch natri hydroxit 1 moL/L (4.18). Chuyển toàn bộ dung dịch vào bình định mức dung tích 100 mL, tráng rửa bằng đệm citrat (4.24) và định mức đến vạch bằng dung dịch đệm (4.24).

Nếu sử dụng chất nội chuẩn, thêm 1,00 mL dung dịch nội chuẩn (4.27.3) cho mỗi 100 mL dịch cuối và định mức đến vạch bằng dung dịch đệm citrat (4.24).

Chạy sắc ký tiếp theo 6.4

Nếu dịch chiết không được sử dụng cùng ngày thì phải bảo quản ở nhiệt độ dưới 5 °C.

6.3  Xác định các axit amin tổng số

6.3.1  Quá trình oxy hóa

Cân một lượng mẫu phân bón phù hợp (1 g đến 5 g) chính xác đến 0,0001 g đã được chuẩn bị theo (6.1) cho vào

- Bình tam giác dung tích 100 mL để thủy phân hở (6.3.2.3), hoặc

- Bình tam giác dung tích 250 mL nếu yêu cầu nồng độ natri thấp (6.3.3.2) hoặc

- Bình dung tích 100 mL có nút nhám đậy để thủy phân kín (6.3.2 4).

Phần mẫu thử được cân nên chứa khoảng 10 mg nitơ (theo CHÚ THÍCH 5). Đặt bình đựng mẫu vào bể điều nhiệt và làm lạnh về 0 °C. Thêm 5 mL hỗn hợp oxy hóa (4.23) và trộn đều bằng cách sử dụng que khuấy thủy tinh có đầu cong. Đậy kín bình đựng mẫu có chứa que khuấy bằng màng bọc kín khí, đặt bể điều nhiệt có chứa bình mẫu vào tủ lạnh ở 0 °C trong 16 h. Sau 16 h, lấy mẫu ra khỏi tủ lạnh và khử phần chất oxy hóa còn dư bằng cách thêm vào bình mẫu 0,84 g natri sulfit (4.11).

Quy trình tiếp tục theo 6.3.2.1.

6.3.2  Quá trình thủy phân

6.3.2.1  Thủy phân mẫu đã được oxy hóa

Đối với mẫu đã oxy hóa được chuẩn bị như 6.3.1, thêm 25 mL hỗn hợp thủy phân (4.21), tráng cẩn thận bình mẫu để lấy hết lượng mẫu còn bám trên thành bình và que khuấy. Tùy thuộc vào quá trình thủy phân được sử dụng, quy trình được thực hiện theo các bước nêu tại 6.3.2.3 hoặc 6.3.2.4.

6.3.2.2  Thủy phân các mẫu chưa được oxy hóa

Cân một lượng mẫu phân bón phù hợp (1 g đến 5 g) chính xác đến 0,0001g đã được chuẩn bị theo (6.1) cho vào bình tam giác dung tích 100 mL hoặc 250 mL hoặc vào bình có nắp đậy dung tích 100 mL. Phần mẫu thử được cân nên chứa khoảng 10 mg nitơ (theo CHÚ THÍCH 5). Thêm cẩn thận vào bình 25 mL hỗn hợp thủy phân (4.21) và trộn đều mẫu. Quy trình được tiếp tục thực hiện theo các bước 6.3.2.3 hoặc 6.3.2.4.

6.3.2.3 Thủy phân hở

Thêm ba viên thủy tinh trợ sôi vào bình đựng mẫu (đã được chuẩn bị ở 6.3.2.1 hoặc 6.3.2.2) và đun hồi lưu liên tục trong 23 h. Khi quá trình thủy phân kết thúc, rửa sinh hàn từ trên xuống bằng 5 mL dung dịch đệm citrat (6.24). Tháo bình mẫu và làm lạnh trong bể điều nhiệt ở 0 °C. Quá trình tiếp tục thực hiện theo 6.3.3.

6.3.2.4  Thủy phân kín

Đặt bình có chứa hỗn hợp mẫu đã được chuẩn bị theo 6.3.2.1 và 6.3.2.2 vào tủ sấy đặt ở 110 °C. Trong 1 h đầu tiên, nhằm để ngăn sự tăng áp suất (do sự thoát ra của các chất khí) và để tránh bị nổ, đặt nắp đậy lên trên bình. Không vặn chặt nắp. Sau 1 h, vặn nắp bình đựng mẫu và đặt vào nồi hấp ở 140 °C trong 3 h. Khi quá trình thủy phân kết thúc, lấy bình mẫu ra khỏi tủ sấy, cẩn thận mở nút bình và đặt bình vào bể điều nhiệt xuống ở 0 °C.

Tùy thuộc vào quá trình điều chỉnh pH (6.3.3), chuyển định lượng mẫu trong bình sang bình tam giác dung tích 250 mL hoặc bình cầu đáy tròn dung tích 250 mL sử dụng dung dịch đệm citrat (4.24).

Tiến hành tiếp tục theo 6.3.3.

6.3.3  Điều chỉnh pH

6.3.3.1  Tùy thuộc vào mức độ dung nạp natri của thiết bị sử dụng để phân tích axit amin, quá trình tiếp tục được thực hiện theo 6.3.3.2 hoặc 6.3.3.3 để điều chỉnh pH.

6.3.3.2  Khi thiết bị phân tích axit amin đòi hỏi nồng độ natri thấp (thì thể tích axit phải giảm xuống) và đối với hệ thống cột trao đổi ion cũng yêu cầu độ natri thấp, thì nên sử dụng dung dịch chuẩn gốc của chất nội chuẩn (4.27.3).

Trong trường hợp này, thêm 2,00 mL dung dịch chuẩn gốc của chất nội chuẩn (4.27.3) để thủy phân trước khi làm bay hơi. Thêm 2 giọt dung dịch 1-octanol (4.12) vào dung dịch thủy phân thu được từ 6.3.2.3 hoặc 6.3.2.4.

Sử dụng thiết bị cất quay chân không để làm giảm thể tích xuống 5 mL đến 10 mL dưới điều kiện chân không ở 40 °C. Nếu thể tích dung dịch còn dưới 5 mL, mẫu thủy phân phải bỏ đi và thực hiện lại quá trình phân tích từ đầu.

Điều chỉnh pH đến 2,20 bằng dung dịch natri hydroxit 1 mol/L (4.18) và thực hiện theo 6.3.2.4.

6.3.3.3  Đối với hệ thống cột trao đổi ion không yêu cầu nồng độ natri thấp, lấy mẫu thủy phân thu được theo 6.3.2.3 và 6.3.2.4 và trung hòa từ từ, cẩn thận bằng cách thêm 17 mL dung dịch natri hydroxit 7,5 mol/L (4.17), sử dụng máy khuấy từ, trong suốt quá trình này nhiệt độ phải luôn được giữ ở mức dưới 40 °C.

Điều chỉnh pH đến 2,20 ở nhiệt độ phòng bằng dung dịch natri hydroxit 7,5 mol/L (4.17) và cuối cùng bằng dung dịch natri hydroxit 1 mol/L (4.18). Tiếp tục thực hiện theo 6.4.

6.3.3.4  Dung dịch mẫu thử cho chạy sắc ký

Chuyển toàn bộ lượng dịch thủy phân đã điều chỉnh pH (6.3.3.2 hoặc 6.3.3.3) cùng dung dịch đệm citrat (4.24) vào bình định mức dung tích 200 mL và định mức đến vạch mức bằng dung dịch đệm.

Nếu chất nội chuẩn không có sẵn, thêm 2 mL dung dịch chuẩn gốc của chất nội chuẩn (4.27.3) và định mức đến vạch mức bằng dung dịch đệm citrat (4.24). Trộn đều cẩn thận.

Thực hiện bước chạy sắc ký (6.4)

Nếu dung dịch mẫu không được thực hiện trong cùng ngày, mẫu phải được bảo quản dưới 5 °C.

6.4  Chạy sắc ký

Trước khi thực hiện chạy sắc ký, đưa dịch chiết (6.2) hoặc dịch thủy phân (6.3.3.4) về nhiệt độ phòng. Lắc đều hỗn hợp và lọc một lượng phù hợp qua màng lọc cỡ 0,2 µm. Đưa dịch lọc sạch vào cột trao đổi ion, sử dụng thiết bị HPLC.

Bơm mẫu có thể thực hiện bằng tay hoặc tự động. Điều quan trọng là đưa lên cột phân tích cùng một lượng dung dịch chất chuẩn và mẫu thử không sai khác quá 0,5 % trừ khi chất nội chuẩn được sử dụng, tỷ lệ giữa lượng natri:axit amin trong chất chuẩn và dung dịch mẫu là tương tự nhau thì mới có thể thực hiện được.

Nói chung, tần suất chạy dung dịch chuẩn phụ thuộc độ ổn định của thuốc thử ninhydrin và hệ thống phân tích. Pha loãng chất chuẩn hoặc mẫu với dung dịch đệm citrat (4.24) để có được diện tích pic của chất chuẩn vào khoảng 30 % đến 200 % diện tích pic mẫu axit amin.

Sắc ký đồ của axit amin sẽ thay đổi một ít tùy theo máy phân tích và chất nhồi cột được sử dụng. Hệ thống phân tích được chọn phải có khả năng tách được các axit amin ra khỏi nhau và ra khỏi các chất dương tính với ninhydrin. Trong phạm vi hoạt động, hệ thống sắc ký phải đáp ứng tuyến tính với các thay đổi về lượng axit amin đưa vào cột.

Trong suốt quá trình chạy sắc ký, tỷ số giữa chiều cao lõm:pic đề cập ở dưới đây được áp dụng khi dung dịch có cùng nồng độ mol (của các axit đang xác định) được phân tích. Dung dịch axit amin cùng nồng độ mol này chứa ít nhất 30 % của lượng axit amin tải tối đa của mỗi axit amin mà có thể đo được chính xác.

Để tách threonin và serin, tỷ số giữa chiều cao lõm:pic của pic thấp hơn trong hai axit amin chồng lên nhau trong sắc ký đồ không vượt quá 2:10 (nếu chỉ cystein, methionin và lysin được xác định, sự tách không rõ ràng giữa các pic liền kề sẽ gây sai số đến phép đo). Đối với tất cả các axit amin tỷ số tách tốt hơn nên là 1:10.

Hệ thống nên đảm bảo rằng lysin được tách khỏi "lysin nhân tạo" và ornithin.

7  Biểu thị kết quả

Diện tích pic của mẫu và chất chuẩn được đo cho mỗi axit amin và lượng mẫu được tính theo gam axit amin /kilogam mẫu, được tính theo công thức (1):

 (1)

Nếu chất nội chuẩn được sử dụng, thì nhân với

trong đó

A_e là diện tích pic của chất trong dịch thủy phân;

A_c là diện tích pic của chất trong dung dịch chuẩn hiệu chuẩn;

A_ie là diện tích pic của chất nội chuẩn trong dịch thủy phân;

A_ic là diện tích pic của chất nội chuẩn trong dung dịch chuẩn hiệu chuẩn;

M là khối lượng phân tử của axit amin được xác định;

C là nồng độ của chất chuẩn, µmol/mL;

m là khối lượng mẫu, tính bằng g (tính về khối lượng ban đầu nếu mẫu được làm khô hoặc loại chất béo);

V_e là tổng thể tích của dịch thủy phân (6.3.3.4) hoặc tổng thể tích pha loãng của dịch chiết (6.2), tính bằng mililit.

Cả cystin và cystein được xác định giống như axit cysteic trong thủy phân mẫu đã oxy hóa, nhưng được tính theo tổng của cystein và cystin sử dụng M = 120,15 g (= 0,5 x 240,30) (C₆H₁₂N₂O₄S₂, M = 240,30 g).

Methionin được xác định như methionin sulfon trong thủy phân mẫu đã được oxy hóa, nhưng tính toán bằng cách sử dụng M của methionin = 149,21 g.

Methionin tự do thêm vào được xác định sau khi chiết tách như methionin; tính toán tương tự sử dụng cùng chung M.

Tổng thể tích của dịch chiết pha loãng (V_e) dùng để xác định các axit amin tự do được tính theo công thức (2)

 (2)

trong đó

V_ef là thể tích chiết cuối cùng, tính bằng mililit.

Các kết quả có thể chuyển đổi sang phần trăm (%):

Kết quả tính theo % = 0,1 x kết quả tính theo gam trên kilogam.

8  Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm bao gồm ít nhất những thông tin sau:

a) Viện dẫn tiêu chuẩn này;

b) Đặc điểm nhận dạng mẫu;

c) Kết quả thử nghiệm,

d) Mọi thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc dược coi là tùy chọn và các yếu tố có thể ảnh hưởng đến kết quả thử nghiệm;

e) Ngày thử nghiệm.