\r\nPHẦN 2- 5: YÊU CẦU CỤ THỂ ĐỐI VỚI VI KHUẨN PANTOEA\r\nSTEWARTII (SMITH) MERGAERT
\r\n
Lời nói đầu
\r\n\r\nTCVN 12371-2-7: 2020 do Cục Bảo vệ thực\r\nvật biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu\r\nchuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.
\r\n\r\nBộ tiêu chuẩn TCVN 12371 Quy trình\r\ngiám định vi khuẩn, virus, phytoplasma gây bệnh thực vật gồm các phần sau:
\r\n\r\n- TCVN 12371-1:2019. Phần 1: Yêu cầu\r\nchung
\r\n\r\n- TCVN 12371-2-1:2018. Phần 2-1: Yêu cầu\r\ncụ thể đối với Plum pox virus
\r\n\r\n- TCVN 12371-2-2:2018. Phần 2-2: Yêu cầu\r\ncụ thể đối với vi khuẩn Xylella fastidiosa Wells et al.
\r\n\r\n- TCVN 12371-2-3:2019. Phần 2-3: Yêu cầu\r\ncụ thể đối với vi khuẩn Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis\r\n(Smith) Davis et al.
\r\n\r\n- TCVN 12371-2-4:2020. Phần 2-4: Yêu cầu\r\ncụ thể đối với Alfalfa mosaic virus
\r\n\r\n- TCVN 12371-2-5:2020. Phần 2-5: Yêu cầu\r\ncụ thể đối với vi khuẩn Pantoea stewartii (Smith) Mergaert
\r\n\r\n- TCVN 12371-2-6:2020. Phần 2-6: Yêu cầu\r\ncụ thể đối với vi khuẩn Potato spindle tuber viroid
\r\n\r\n\r\n\r\n
\r\nPHẦN 2- 5: YÊU CẦU CỤ THỂ ĐỐI VỚI VI KHUẨN PANTOEA STEWARTII (SMITH) MERGAERT
\r\n
Tiêu chuẩn này quy định các yêu cầu cụ\r\nthể đối với quy trình giám định vi khuẩn Pantoea stewartii (Smith)\r\nMergaert gây bệnh thực vật.
\r\n\r\n\r\n\r\nTài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết\r\ncho việc áp dụng tiêu chuẩn. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì\r\náp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố\r\nthì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).
\r\n\r\nTCVN 12371-1:2019. Quy trình giám định\r\nvi khuẩn, virus, phytoplasma gây bệnh thực vật. Phần 1: Yêu cầu chung.
\r\n\r\n\r\n\r\nSử dụng các thiết bị, dụng cụ thông\r\nthường của phòng thử nghiệm sinh học, theo TCVN 12371- 1:2019 (điều 3) và các\r\nthiết bị sau:
\r\n\r\n3.1 Bình tam giác
\r\n\r\n3.2 Túi ni lon:
3.3 Que cấy thẳng
\r\n\r\n3.4 Giấy lọc:
3.5 Ống nghiệm:
3.6 Máy ly tâm:
3.7 Que cấy vô trùng
\r\n\r\n\r\n\r\nChỉ sử dụng các hóa chất loại tinh khiết\r\nphân tích, trừ khi có quy định khác. Sử dụng hóa chất theo TCVN 12371-1:2019\r\n(điều 4) và một số hóa chất sau:
\r\n\r\n4.1
4.2
4.3
4.4
4.5
4.6
4.7
4.8
4.9
4.10 Glucose (C6H12O6)
\r\n\r\n4.11
4.12
4.13
4.14
4.15
4.16
4.17
4.18
4.19
4.20
4.21
4.22
4.23
4.24
4.25
4.26
4.27
4.28
4.29
4.30
4.31
4.32
4.33
4.34
4.35 Natri clorua (NaCI)
\r\n\r\n4.36 Dextrose
\r\n\r\n4.37 Môi trường King’s B
\r\n\r\n\r\n\r\n5.1 Lấy mẫu
\r\n\r\nLấy mẫu theo điều 5.1 của TCVN\r\n12371-1:2019.
\r\n\r\n5.2 Bảo quản mẫu
\r\n\r\nBảo quản mẫu khi giám định hoặc sau\r\nkhi giám định như sau:
\r\n\r\n+ Thân, lá bảo quản tươi hoặc ép khô\r\ntheo điều 5.2.1.1 của TCVN 12371-1:2019
\r\n\r\n+ Hạt bảo quản theo điều 5.2.1.2 của\r\nTCVN 12371-1:2019
\r\n\r\n\r\n\r\nGiai đoạn cây con: Cây héo rũ. Trên lá\r\ncủa cây bệnh có các sọc dọc màu xanh nhạt tới vàng viền vết bệnh bất định hoặc\r\nlượn song, vết bệnh có thể chạy song song theo gân lá và mở rộng ra toàn bộ phiến\r\nlá. Triệu chứng trên lá xuất hiện rất sớm từ khi mới hình thành lá. Cây bệnh bị\r\nchết ngọn gây hiện tượng chồi nách màu bạc. (hình 1)
\r\n\r\n![](\"00919298_files/image001.jpg\")
Giai đoạn cây trưởng thành: Phần thân\r\ngần mặt đất có thể bị nứt. Triệu chứng trên lá tương tự như trong giai đoạn cây\r\ncon.
\r\n\r\nKhi kiểm tra lô hàng cần chú ý các nước\r\nmà vi khuẩn có phân bổ (xem phụ lục A) và các loài cây mà vi khuẩn gây hại (xem\r\nphụ lục A).
\r\n\r\n7.1 Giám định
\r\n\r\n7.2 Giám định bằng phương pháp hình\r\nthái kết hợp với phản ứng sinh hóa
\r\n\r\n7.1.1 Phân lập vi khuẩn
\r\n\r\nPhân lập vi khuẩn theo điều 7.1.1.1 của\r\nTCVN 12371-1:2019:
\r\n\r\n+ Mẫu (thân, lá) được nghiền trong đệm\r\nphostphat (xem phụ lục B.1).
\r\n\r\n+ Tách chiết vi khuẩn từ hạt:
\r\n\r\nLượng mẫu hạt sử dụng: 100 hạt.
\r\n\r\nBước 1: Rửa sạch hạt dưới vòi nước chảy.\r\nMẫu hạt sau đó được cho vào bình tam giác (3.1) hoặc túi ni lon (3.2) kín (sau\r\nđây gọi là vật chứa)
\r\n\r\nBước 2: Thêm vào vật chứa dung dịch đệm\r\nphostphat (phụ lục B.1) với tỷ lệ (hạt: đệm phostphat) 1:2 theo khối lượng. Đặt\r\nvật chứa trong điều kiện từ 4 °C đến 10 °C trong 6 giờ đến 8 giờ.
\r\n\r\nBước 3: Mẫu hạt sau đó được lắc với tốc\r\nđộ 200 vòng/phút trong 1 giờ ở điều kiện phòng.
\r\n\r\nBước 4: Dịch thu được sau khi ngâm hạt\r\nđược đặt trong máy ly tâm (3.6) ly tâm với tốc độ 1 300 vòng/phút ở điều kiện\r\nnhiệt độ từ 4 °C đến 10 °C trong 10 phút. Thu phần kết tủa.
\r\n\r\nBước 5: Phần kết tủa thu được hòa tan\r\nlại trong đệm phosphat dung tích bằng 1/10 lượng đệm sử dụng trong bước 2.
\r\n\r\n+ Nuôi cấy trên môi trường King’ B\r\n(4.37) (xem phụ lục 8 của TCVN12371 -1:2019) với điều kiện nhiệt độ 25 °C đến\r\n27 °C thời gian từ 2 ngày đến 5 ngày.
\r\n\r\nChọn các khuẩn lạc có hình thái phù hợp\r\nvới mô tả hình thái khuẩn lạc của vi khuẩn Pantoea stewartii (Smith)\r\nMergaert: khuẩn lạc màu vàng sáng tới vàng cam, rìa nhẵn, khuẩn lạc nhô cao.
\r\n\r\n7.1.2 Nuôi cấy dòng thuần
\r\n\r\nNuôi cấy dòng thuần theo TCVN12371\r\n-1:2019 (điều 7.1.1.1) sử dụng môi trường King’ B (4.37) (xem phụ lục B của\r\nTCVN12371 -1:2019)
\r\n\r\n7.1.3 Phản ứng sinh hóa
\r\n\r\nCác phản ứng sinh hóa để định danh vi khuẩn\r\nPantoea stewartii (Smith) Mergaert bao gồm:
\r\n\r\n7.1.3.1 Phản ứng nhuộm Gram
\r\n\r\nPhản ứng nhuộm Gram theo điều 7.1.1.2\r\ncủa TCVN 12371-1:2019
\r\n\r\n7.1.3.2 Khả năng di động
\r\n\r\nDùng que cấy thẳng (3.3) lấy một khuẩn\r\nlạc (thu được từ điều 7.1.2) cấy theo chiều dọc vào ống nghiệm (3.5) chứa môi\r\ntrường thử khả năng di động của vi khuẩn (xem phụ lục B.2)
\r\n\r\nĐọc kết quả:
\r\n\r\n+ Vi khuẩn có khả năng di động (dương\r\ntính): Vi khuẩn phát tán ra toàn bộ ống nghiệm làm cho môi trường bị đục (thường\r\nlà mang màu vàng sáng)
\r\n\r\n+ Vi khuẩn không có khả năng di động\r\n(âm tính): Vi khuẩn chỉ phát triển theo vết cấy
\r\n\r\n7.1.3.3 Phản ứng Kovac’s oxidase
\r\n\r\nNhỏ 2 giọt đến 3 giọt NNN’N’-\r\ntetramethyl-p-phenyl diamine dihydrochloride 1 % (4.1) lên giấy lọc (3.4). Dùng\r\nque cấy vô trùng (3.7) lấy một khuẩn lạc (thu được từ điều 7.1.2) thoa lên bề mặt\r\ncủa giấy lọc. Đọc kết quả sau 30 đến 60 giây.
\r\n\r\nĐọc kết quả:
\r\n\r\n- Dương tính: giấy lọc chuyển màu xanh\r\ntím
\r\n\r\n- Âm tính: giấy lọc không chuyển màu.
\r\n\r\n7.1.3.4 Sản sinh Acetoin
\r\n\r\nBước 1: Lấy một khuẩn lạc (thu được từ\r\nđiều 7.1.2) đặt vào ống nghiệm (3.5) chứa 5 ml môi trường Voges-Proskauer (xem\r\nphụ lục B.3) trong điều kiện nhiệt độ 28 °C trong từ 3 ngày đến 5 ngày.
\r\n\r\nBước 2: Chuyển mỗi 1 ml dung dịch nuôi\r\ncấy thu được ở bước 1 vào ống nghiệm (3,5) vô trùng khác.
\r\n\r\nBước 3: Cho vào ống nghiệm (3.5) 3 giọt\r\nđến 5 giọt thuốc thử Methyl red (xem phụ lục B.4)
\r\n\r\nĐọc kết quả:
\r\n\r\n+ Dương tính: dung dịch nuôi cấy trong\r\nống nghiệm chuyển màu đỏ
\r\n\r\n+ Âm tính: dung dịch nuôi cấy trong ống\r\nnghiệm chuyển màu vàng
\r\n\r\n7.1.3.5 Phản ứng Indole
\r\n\r\nBước 1: Lấy một khuẩn lạc (thu được từ\r\nđiều 7.1.2) nuôi cấy trong môi trường thử indole (xem phụ lục B.5). Đặt các ống\r\nnghiệm (3.5) có khuẩn lạc ở nhiệt độ 28 °C trong từ 3 ngày đến 5 ngày.
\r\n\r\nBước 2: Chuyển 5 ml dịch từ ống nghiệm\r\n(3.5) ở bước 1 vào một ống nghiệm (3.5) mới, thêm vào 0,5 ml thuốc thử Kovacs\r\n(xem phụ lục B.6)
\r\n\r\nĐọc kết quả:
\r\n\r\n+ Dương tính: dung dịch chuyển màu đỏ
\r\n\r\n+ Âm tính: dung dịch không chuyển màu
\r\n\r\n7.1.3.6 Phản ứng phân giải Nitrate
\r\n\r\nBước 1: Dùng que cấy thẳng (3.3) lấy một\r\nkhuẩn lạc (thu được từ điều 7.1.2) nuôi cấy trong môi trường Nitrate (xem phụ lục\r\nB.7). Đặt ống nghiệm (3.5) có khuẩn lạc ở nhiệt độ 28 °C trong từ 3 đến 5 ngày.
\r\n\r\nBước 2: Thêm 0,5 ml dung dịch thuốc thử\r\nnitrate (xem phụ lục B.8) vào ống nghiệm (3.5) ở bước 1
\r\n\r\nĐọc kết quả:
\r\n\r\n+ Dương tính: dung dịch chuyển màu đỏ
\r\n\r\nTrong trường hợp dung dịch chuyển màu\r\nhồng nhạt hoặc không chuyển màu. Thêm vào 2 đến 3 hạt kẽm và lắc đều. Nếu dung\r\ndịch trong ống nghiệm xuất hiện màu đỏ phản ứng được coi là âm tính. Nếu dung dịch\r\ntrong ống không chuyển màu thì phản ứng được coi là dương tính.
\r\n\r\n7.1.3.7 Phản ứng phân giải Aesculin
\r\n\r\nLấy một khuẩn lạc (thu được từ điều\r\n7.1.2) nuôi cấy trong môi trường phân giải Aesculin (xem phụ lục B.9). Đặt ống\r\nnghiệm (3.5) có khuẩn lạc ở nhiệt độ 28 °C trong 7 ngày.
\r\n\r\nĐọc kết quả:
\r\n\r\n+ Dương tính: dung dịch chuyển màu nâu\r\nhoặc đen
\r\n\r\n+ Âm tính: dung dịch không chuyển màu
\r\n\r\n7.1.3.8 Phản ứng phân hủy và oxi hóa\r\ncarbonhydrate (Maltose, Arbutin, Salicin, Raffinose)
\r\n\r\nDùng que cấy thẳng (3.3) lấy một khuẩn\r\nlạc (thu được từ điều 7.1.2) nuôi cấy trong môi trường thủy phân (xem phụ lục\r\nB.10). Đặt ống nghiệm (3.5) có khuẩn lạc ở nhiệt độ 28 °C trong 3 tuần. Đọc kết\r\nquả:
\r\n\r\n+ Dương tính: môi trường chuyển sang\r\nmàu vàng.
\r\n\r\n+ Âm tính: môi trường không đổi màu
\r\n\r\n7.1.3.9 Phản ứng phân giải Malonate
\r\n\r\nLấy một khuẩn lạc (thu được từ điều\r\n7.1.2) nuôi cấy trong môi trường phân giải Malonate (xem phụ lục B.11). Đặt ống\r\nnghiệm (3.5) có khuẩn lạc ở nhiệt độ 35 °C trong 1 ngày đến 2 ngày.
\r\n\r\nĐọc kết quả:
\r\n\r\n+ Dương tính: môi trường chuyển sang\r\nmàu xanh nước biển.
\r\n\r\n+ Âm tính: môi trường không đổi màu
\r\n\r\n7.1.3.10 Đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn\r\nPantoea stewartii (Smith) Mergaert
\r\n\r\n| \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Phản ứng nhuộm Gram \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Khả năng di động \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Phản ứng Kovac’s oxidase \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Sản sinh Acetoin \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Phản ứng Indole \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Phản ứng phân giải Nitrate \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Phản ứng phân giải Aesculin \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Phản ứng phân hủy và oxi hóa\r\n carbonhydrate (Maltose, Arbutin, Salicin) \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Phản ứng phân hủy và oxi hóa carbonhydrate\r\n (Raffinose) \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n Phản ứng phân giải Malonate \r\n | \r\n \r\n | \r\n
7.2
Thực hiện theo điều 7.1.2 của TCVN\r\n12371-1: 2019
\r\n\r\nSử dụng các loại dịch mẫu đã nêu trong\r\nđiều 7.1.2.2 của TCVN 12371-1:2019 ngoài ra có thể sử dụng dịch mẫu tách chiết\r\ntừ hạt như điều 7.1.1 phần tách chiết vi khuẩn từ hạt.
\r\n\r\n7.3 Giám định bằng PCR
\r\n\r\nThực hiện theo điều 7.1.3 của TCVN\r\n12371-1: 2019
\r\n\r\nSử dụng một trong những cặp mồi đặc hiệu:
\r\n\r\n- Cặp mồi 1 (AGES, AT)
\r\n\r\nPST-1: 5’ CCT CAC ACC ATC GGA TGT G\r\n-3’
\r\n\r\nPST-R: 5’ ATG AGG TTA TTA ACC TCA CCA-\r\n3’
\r\n\r\nVới chu trinh nhiệt:
\r\n\r\n| \r\n 95 °C trong 5 phút \r\n | \r\n \r\n \r\n | \r\n
| \r\n 94 °C trong 30 giây \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n 58 °C trong 30 giây \r\n | \r\n |
| \r\n 72 °C trong 30 giây \r\n | \r\n |
| \r\n 72 °C trong 7 phút \r\n | \r\n \r\n \r\n | \r\n
Đọc kết quả
\r\n\r\nSản phẩm được điện di bằng gel agarose\r\n1,5 % (4.2).
\r\n\r\nMẫu dương tính cho đoạn gen kích thước\r\n263 bp.
\r\n\r\nCặp mồi 2 (Coplin & Majerczak\r\n(2002))
\r\n\r\nES16-1: 5’GCG AAC TTG GCA GAG AT -3’
\r\n\r\nESIG2c-R: 5' GCG CTT GCG TGT TAT GAG-\r\n3’
\r\n\r\nVới chu trình nhiệt:
\r\n\r\n| \r\n 95 °C trong 4 phút \r\n | \r\n \r\n \r\n | \r\n
| \r\n 94 °C trong 30 giây \r\n | \r\n \r\n | \r\n
| \r\n 55 °C trong 30 giây \r\n | \r\n |
| \r\n 72 °C trong 45 giây \r\n | \r\n |
| \r\n 72 °C trong 7 phút \r\n | \r\n \r\n \r\n | \r\n
Đọc kết quả
\r\n\r\nSản phẩm được điện di bằng gel agarose\r\n1,5 % (4.2).
\r\n\r\nMẫu dương tính cho đoạn gen kích thước\r\n920 bp.
\r\n\r\n7.4 Kết luận
\r\n\r\nMẫu giám định được kết luận là loài vi\r\nkhuẩn Pantoea stewartii (Smith) Mergaert khi:
\r\n\r\n- Có kết quả dương tính với phương\r\npháp giám định bằng PCR
\r\n\r\nhoặc
\r\n\r\n- Có kết quả dương tính với phương\r\npháp giám định bằng ELISA
\r\n\r\nhoặc
\r\n\r\n- Vi khuẩn có đặc điểm sinh hóa phù hợp\r\nvới đặc điểm sinh hóa được mô tả tại điều 7.1.3.10
\r\n\r\n\r\n\r\nNội dung phiếu kết quả giám định gồm\r\nnhững thông tin cơ bản sau:
\r\n\r\n- Thông tin về mẫu giám định.
\r\n\r\n- Phương pháp giám định
\r\n\r\n- Người giám định/cơ quan giám định
\r\n\r\n- Kết quả giám định: Tên khoa học của\r\nloài
\r\n\r\nPhiếu kết quả giám định chi tiết tham\r\nkhảo phụ lục C.
\r\n\r\n\r\n\r\n
A.1 Tên khoa học và\r\nvị trí phân loại
\r\n\r\nTên tiếng Việt: Bệnh vi khuẩn héo rũ\r\nngô
\r\n\r\nTên khoa học: Pantoea stewartii\r\n(Smith) Mergaert
\r\n\r\nTên khác:
\r\n\r\nAplanobacter stewartii
Bacillus stewartii
Bacterium stewartii
Erwinia stewartii
Pantoea stewartii
Phytomonas stewartii
Pseudobacterium stewartii
Pseudomonas stewartii
Xanthomonas stewartii
Vị trí phân loại:
\r\n\r\nBộ: Enterobacteriales
\r\n\r\nHọ: Enterobacteriaceae
\r\n\r\n\r\n\r\nTrong nước: Bệnh chưa có ở Việt Nam
\r\n\r\nTrên thế giới: Châu Á: Korea; Châu\r\nMỹ: USA, Canada, Costa Rica, Puerto Rico, Trinidad and Tobago, Argentina,\r\nBolivia, Brazil, Guyana, Paraguay, Peru; Châu Âu: Switzeland
\r\n\r\n\r\n\r\nZea mays (ngô), Zea mays
Agrostis gigantea, Coix lacryma-jobi,\r\nDactylis glomerata, Digitaria, Dracaena sanderiana, Panicum capillare, Panicum\r\ndichotomiflorum, Poa pratensis, Set aria lutescens, Sorghum sudanense,\r\nTripsacum dactyloides, Triticum aestivum (lúa mì)
\r\n\r\n\r\n\r\nP. stewartii tồn tại trong mô sống\r\ncủa cây và hạt. Khả năng truyền qua hạt của vi khuẩn liên quan chặt chẽ tới mức\r\nđộ gây hại của bệnh trên cây sản xuất hạt giống và cũng liên quan tới mức độ cảm\r\nnhiễm hay kháng của cây bố mẹ.
\r\n\r\nSự thay đổi về giải phẫu học khi bệnh\r\nphát triển trong tế bao đã được nghiên cứu trên các giống ngô nhiễm và chống chịu\r\nbệnh sử dụng ánh sáng và kính hiển vi điện tử. Khi lá của cây ở giai đoạn trổ cờ\r\nđược lây nhiễm vi khuẩn này, vết bệnh trên các giống nhiễm phát triển nhanh gấp\r\n3 đến 4 lần giống kháng. Màng ngăn giữa các tế bào bó mạch bị bao phủ bởi các vật\r\nchất tương tự như exopolysaccharide của vi khuẩn khi mật độ vi khuẩn trong mạch\r\ndẫn vẫn còn rất thấp. Bó mạch bị bít tắc hoàn toàn bằng tế bào vi khuẩn và\r\nexopolysaccharide khi mật độ vi khuẩn tăng cao. Khả năng sản sinh\r\nexopolysaccharide và độc tính có quan hệ với nhau. Khả năng thủy phân\r\npolysaccharide vỏ và độc tính của P. stewartii chịu tác động của giao tiếp\r\nsinh học thông qua phân tử tín hiệu (quorum-sensing regulatory proteins). Chất\r\nlàm dính (agglutinin) vi khuẩn đã được chiết xuất từ các hạt ngô trên mặt đất\r\ncà phản ứng của chất này đã được thử nghiệm với 22 dòng vi khuẩn có độc tính\r\nkhác nhau. Khả năng ngưng kết đặc hiệu (Specific agglutination) tỷ lệ nghịch với\r\nđộc tính của vi khuẩn. Dòng độc của vi khuẩn đã được nghiên cứu rất kĩ về mặt\r\nsinh học phân tử. Một nhóm gen độc 24kb của vi khuẩn cần thiết để tạo ra hiện\r\ntượng đốm sũng nước và héo cây con nhưng cụm gen này không bắt buộc cho sự phát\r\ntriển ban đầu của vi khuẩn.
\r\n\r\nP. stewartii là một sinh vật có hệ\r\ngen đồng nhất, Một trăm hai mươi tư mẫu phân lập từ đông bắc, trung tây và\r\ntrung tâm bang Atlantic tại Mỹ có kiểu chuyển hóa giống nhau tới 93%. 2 phần 3\r\nmẫu phân lập tạo thành 18 nhóm khác nhau có kiểu chuyển hóa giống nhau trong đó\r\n1/3 còn lại có sự khác biệt nhất định. Sự đồng bộ về kiểu hình (phenotypic) là\r\nmột dẫn chứng cho thấy tác nhân gây bệnh được tổ chức hợp lý để tồn tại trong một\r\nkí chủ nhất định (ví dụ Zea mays và C. pulicaria). Bệnh không gây\r\nhại nặng trên các kí chủ khác và vi khuẩn không được truyền hữu hiệu bởi các\r\nmôi giới khác.
\r\n\r\n\r\n\r\n
Thành phần:
\r\n\r\nNa2HPO4 (4.3) 4,26\r\ng
\r\n\r\nKH2PO4 (4.4) 2,72\r\ng
\r\n\r\nNước cất (4.5)
Hòa tan các thành phần trên vào nước cất\r\n(4.5).
\r\n\r\nĐiều chỉnh pH của môi trường về pH 7,4
\r\n\r\nB.2 Môi trường thử khả\r\nnăng di động của vi khuẩn
\r\n\r\nThành phần
\r\n\r\n| \r\n Chất chiết nấm men (4.6) \r\n | \r\n \r\n 3g \r\n | \r\n
| \r\n Peptone (4.7) \r\n | \r\n \r\n 5 g \r\n | \r\n
| \r\n Agar (4.8) \r\n | \r\n \r\n 2,5 g \r\n | \r\n
| \r\n Nước cất (4.5) \r\n | \r\n \r\n 1 000 ml \r\n | \r\n
Chuẩn bị:
\r\n\r\nHòa tan các thành phần trên vào nước cất\r\n(4.5).
\r\n\r\nĐiều chỉnh pH của môi trường về pH 7,2
\r\n\r\nHấp khử trùng theo B.1 phụ lục B của TCVN\r\n12371-1:2019
\r\n\r\nB.3 Môi trường\r\nVoges- Proskauer
\r\n\r\nThành phần
\r\n\r\n| \r\n Peptone (4.7) \r\n | \r\n \r\n 5g \r\n | \r\n
| \r\n K2HP | \r\n \r\n 5g \r\n | \r\n
| \r\n Glucose (4.10) \r\n | \r\n \r\n 5 g \r\n | \r\n
| \r\n Nước cất (4.5) \r\n | \r\n \r\n 1 000 ml \r\n | \r\n
Chuẩn bị:
\r\n\r\nHòa tan các thành phần trên vào nước cất\r\n(4.5), chỉnh pH 7,5.
\r\n\r\nHấp khử trùng theo B.1 phụ lục B của\r\nTCVN 12371-1:2019
\r\n\r\n\r\n\r\nThành phần
\r\n\r\nMethyl red (4.11)
Ethanol 95% (4.12) 300 ml
\r\n\r\nHòa tan hoàn toàn các thành phần thêm\r\nnước cất (4.5) cho đủ dung tích 500 ml
\r\n\r\n\r\n\r\nThành phần
\r\n\r\n| \r\n Tryptone (4.13) \r\n | \r\n \r\n 10 g \r\n | \r\n
| \r\n L-trytophan (4.14) \r\n | \r\n \r\n 1 g \r\n | \r\n
| \r\n Nước cất (4.5) \r\n | \r\n \r\n 1 000 ml \r\n | \r\n
Chuẩn bị:
\r\n\r\nHòa tan các thành phần vào nước cất\r\n(4.5), chỉnh pH từ 7,2 đến 7,4.
\r\n\r\nHấp khử trùng theo B.1 phụ lục B của\r\nTCVN 12371-1:2019
\r\n\r\n\r\n\r\nHòa tan 5 g\r\np-dimethylaminobenzaldehyde (4.15) trong 75 ml 1 pentanol (4.16) trong bể ổn\r\nnhiệt. Để nguội và thêm vào 25 ml HCI 35 % (4.17).
\r\n\r\n\r\n\r\nThành ph
| \r\n Peptone (4.7) \r\n | \r\n \r\n 5 | \r\n
| \r\n Chất chiết nấm men (4.6) \r\n | \r\n \r\n 1 g \r\n | \r\n
| \r\n K2H | \r\n \r\n 5 | \r\n
| \r\n KNO | \r\n \r\n 1 g \r\n | \r\n
| \r\n Agar (4.8) \r\n | \r\n \r\n 3g \r\n | \r\n
| \r\n Nước cất (4.5) \r\n | \r\n \r\n 1 000 ml \r\n | \r\n
Chuẩn bị:
\r\n\r\nHòa tan các thành phần vào nước cất\r\n(4.5), chỉnh pH 7,2
\r\n\r\nChia vào mỗi ống nghiệm (3.5) 10 ml\r\nmôi trường.
\r\n\r\nHấp khử trùng theo B.1 phụ lục B của\r\nTCVN 12371-1:2019
\r\n\r\n\r\n\r\nDung dịch A: hòa tan 1,6 g sunphanilic\r\nacid (4.19) trong 60 ml axit acetic băng (4.20) và 140 nước cất (4.5) trong bể ổn\r\nnhiệt.
\r\n\r\nDung dịch B: hòa tan 0,2 g 8-amino-2-napthlenesulfonic\r\nacid (4.21) trong 120 ml nước cất (4.5) trong bể ổn nhiệt. Sau đó thêm vào 30\r\nml axit acetic băng (4.20).
\r\n\r\nB. 9 Môi trường phân\r\ngiải Aesculin
\r\n\r\nThành phần
\r\n\r\n| \r\n Peptone (4.7) \r\n | \r\n \r\n 10 g \r\n | \r\n
| \r\n Aesculin (4.22) \r\n | \r\n \r\n 1 g \r\n | \r\n
| \r\n Sắt citrat (4.23) \r\n | \r\n \r\n 50 mg \r\n | \r\n
| \r\n Natri citrat (4.24) \r\n | \r\n \r\n 1 g \r\n | \r\n
| \r\n Nước cất (4.5) \r\n | \r\n \r\n 1 000 ml \r\n | \r\n
Chuẩn bị:
\r\n\r\nHòa tan các thành phần vào nước cất\r\n(4.5), chỉnh pH 7,2
\r\n\r\nChia vào mỗi ống nghiệm (3.5) 10 ml\r\nmôi trường.
\r\n\r\nHấp khử trùng theo B.1 phụ lục B của\r\nTCVN 12371-1:2019
\r\n\r\n\r\n\r\nThành phần
\r\n\r\n| \r\n (NH4)H2P | \r\n \r\n 1 g \r\n | \r\n
| \r\n KCI (4.26) \r\n | \r\n \r\n 0,2 g \r\n | \r\n
| \r\n MgSO4 | \r\n \r\n 0,2 g \r\n | \r\n
| \r\n Peptone (4.7) \r\n | \r\n \r\n 1 g \r\n | \r\n
| \r\n Bromothymol blue (4.28) \r\n | \r\n \r\n 0,03 g \r\n | \r\n
| \r\n Agar (4.8) \r\n | \r\n \r\n 3g \r\n | \r\n
| \r\n Nước cất (4.5) \r\n | \r\n \r\n 1 000 ml \r\n | \r\n
Chuẩn bị:
\r\n\r\n+ Dung dịch môi trường: Hòa tan hoàn\r\ntoàn các thành phần (trừ Agar (4.8) và Bromothymol blue (4.28)) vào nước cất\r\n(4.5), chỉnh pH 7 đến 7,2. Thêm Agar (4.8) và Bromothymol blue (4.28) đun tới\r\nkhi hòa tan hoàn toàn. Sau đó, hấp khử trùng ở 121 °C trong 15 phút. Môi trường\r\nthu được có màu xanh lá cây đến xanh lam.
\r\n\r\n+ Môi trường thủy phân: Nhỏ 5 ml dung\r\ndịch Arbutin 10 % (4.29), Maltose 10 % (4.30), Salicin 10% (4.31), Raffinose\r\n10% (4.32) đã vô trùng vào dung dịch môi trường chia vào các ống nghiệm (3.5)\r\nvô trùng
\r\n\r\nB.11 Môi trường phân\r\ngiải Malonate
\r\n\r\nThành phần
\r\n\r\n| \r\n Natri malonat (4.33) \r\n | \r\n \r\n 3g \r\n | \r\n
| \r\n (NH4)2S | \r\n \r\n 2g \r\n | \r\n
| \r\n NaCI (4.35) \r\n | \r\n \r\n 2g \r\n | \r\n
| \r\n Chất chiết n | \r\n \r\n 1 g \r\n | \r\n
| \r\n K2HP | \r\n \r\n 0,6 g \r\n | \r\n
| \r\n KH2P | \r\n \r\n 0,4 g \r\n | \r\n
| \r\n Dextrose (4.36) \r\n | \r\n \r\n 0,25 mg \r\n | \r\n
| \r\n Bromothymol blue (4.28) \r\n | \r\n \r\n 0,025 mg \r\n | \r\n
Chuẩn bị:
\r\n\r\nHòa tan các thành phần vào nước cất\r\n(4.5), chỉnh pH 6,7
\r\n\r\n\r\n\r\n
| \r\n Cơ quan giám định \r\n............................. \r\n | \r\n \r\n
| \r\n
| \r\n \r\n | \r\n \r\n | \r\n
\r\n\r\n
1. Tên hàng hóa:
\r\n\r\n2. Nước xuất khẩu:
\r\n\r\n3. Xuất xứ:
\r\n\r\n4. Phương tiện vận chuyển: Khối\r\nlượng:
\r\n\r\n5. Địa điểm lấy mẫu:
\r\n\r\n6. Ngày lấy mẫu:
\r\n\r\n7. Người lấy mẫu:
\r\n\r\n8. Tình trạng mẫu:
\r\n\r\n9. Ký hiệu mẫu:
\r\n\r\n10. Số mẫu lưu:
\r\n\r\n11. Người giám định:
\r\n\r\n12. Phương pháp giám định: Theo TCVN\r\n12371-2-5:2020. Quy trình giám định vi khuẩn, virus, phytoplasma gây bệnh thực\r\nvật. Phần 2-5: Yêu cầu cụ thể đối với vi khuẩn Pantoea stewartii (Smith)\r\nMergaert
\r\n\r\n13. Kết quả giám định:
\r\n\r\nTên tiếng Việt: Bệnh vi khuẩn héo rũ\r\nngô
\r\n\r\nTên khoa học: Pantoea stewartii\r\n(Smith) Mergaert
\r\n\r\nTên khác:
\r\n\r\nAplanobacter stewartii
Bacillus stewartii
Bacterium stewartii
Erwinia stewartii
Pantoea stewartii
Phytomonas stewartii
Pseudobacterium stewartii
Pseudomonas stewartii
Xanthomonas stewartli
Vị trí phân loại:
\r\n\r\nBộ: Enterobacteriales
\r\n\r\nHọ: Enterobacteriaceae
\r\n\r\n\r\n\r\n
| \r\n
| \r\n \r\n
| \r\n
\r\n\r\n
[1] Bradbury J. F (1986), Guide to\r\nPlant Pathogenic Bacteria, C.A.B International, United Kingdom.
\r\n\r\n[2] CABI (2017), Crop Protection\r\nCompedium.
\r\n\r\n[3] Commonwealth Mycolog
[4] IPPC (2006), ISPM 27 Diagnostic\r\nprotocols for regulated pests.
\r\n\r\n[5] TCVN 8597: 2010, Kiểm dịch thực\r\nvật - Phương pháp luận về việc lấy mẫu chuyến hàng.
\r\n\r\n[6] Viện Bảo vệ thực vật (1997), Tập\r\n1: Phương pháp điều tra cơ bản dịch hại nông nghiệp và thiên địch của chúng,\r\nPhương pháp nghiên cứu bảo vệ thực vật, NXB Nông nghiệp.
\r\n\r\nFile gốc của Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12371-2-5:2020 về Quy trình giám định vi khuẩn, virus, phytoplasma gây bệnh thực vật – Phần 2-5: Yêu cầu cụ thể đối với vi khuẩn Pantoea stewartii (Smith) Mergaert đang được cập nhật.
Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12371-2-5:2020 về Quy trình giám định vi khuẩn, virus, phytoplasma gây bệnh thực vật – Phần 2-5: Yêu cầu cụ thể đối với vi khuẩn Pantoea stewartii (Smith) Mergaert
Tóm tắt
| Cơ quan ban hành | Đã xác định |
| Số hiệu | TCVN12371-2-5:2020 |
| Loại văn bản | Tiêu chuẩn Việt Nam |
| Người ký | Đã xác định |
| Ngày ban hành | 2020-01-01 |
| Ngày hiệu lực | |
| Lĩnh vực | Nông nghiệp |
| Tình trạng | Còn hiệu lực |