QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH VI KHUẨN, VIRUS ,PHYTOPLASMA GÂY BỆNH THỰC VẬT
PHẦN 2-4: YÊU CẦU CỤ THỂ ĐỐI VỚI ALFAFA MOSAIC VIRUS
Procedure for identification of plant disease caused by bacteria, virus, phytoplasma
Part 2-4: Particular requirements for Alfalfa mosaic virus
Lời nói đầu
TCVN 12371-2-4:2020 do Cục Bảo vệ thực vật biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.
Bộ tiêu chuẩn TCVN 12371: Quy trình giám định vi khuẩn, virus, phytoplasma gây bệnh thực vật gồm các phần sau:
- TCVN 12371-1:2019: Phần 1: Yêu cầu chung
- TCVN 12371-2-1:2018: Phần 2-1: Yêu cầu cụ thể đối với Plum poxvirus
- TCVN 12371-2-2:2018: Phần 2-2: Yêu cầu cụ thể đối với vi khuẩn Xylellafastidiosa Wells et al.
- TCVN 12371-2-3:2019: Phần 2-3: Yêu cầu cụ thể đối với vi khuẩn Clavibactermichiganensis subsp. michiganensis (Smith) Davis et al.
- TCVN 12371-2-4:2020: Phần 2-4: Yêu cầu cụ thể đối với Alfalfa mosaic virus
- TCVN 12371-2-5:2020: Phần 2-5: Yêu cầu cụ thể đối với vi khuẩn Pantoea stewartii (Smith) Mergaert
- TCVN 12371-2-6:2020: Phần 2-6: Yêu cầu cụ thể đối với vi khuẩn Potato spindle tuber viroid
QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH VI KHUẨN, VIRUS,PHYTOPLASMA GÂY BỆNH THỰC VẬT
PHẦN 2-4: YÊU CẦU CỤ THỂ ĐỐI VỚI ALFAFA MOSAIC VIRUS
Procedure for identification of plant disease caused by bacteria, virus, phytoplasma
Part 2-4: Particular requirements for Alfalfa mosaic virus
Tiêu chuẩn này quy định các yêu cầu cụ thể đối với quy trình giám định Alfalfa mosaic virus gây bệnh thực vật.
Tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).
TCVN 12371-1:2019, Quy trình giám định vi khuẩn, virus, phytoplasma gây bệnh thực vật - Phần 1: Yêu cầu chung.
Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm sinh học, theo TCVN 12371- 1:2019 (điều 3) và các thiết bị sau:
3.1 Máy ly tâm: tốc độ từ 1 000 vòng/phút đến 18 000 vòng/phút
3.2 Ống effendorf 1,5 ml
Chỉ sử dụng các hóa chất loại tinh khiết phân tích, trừ khi có quy định khác. Sử dụng hóa chất theo TCVN 12371-1:2019 (điều 4) và một số hóa chất sau:
4.1 Agarose gel 2 %
4.2 Natri carbonat (Na2CO3)
4.3 Natri hidrocarbonat (NaHCO3)
4.4 Natri azua (NaN3)
4.5 Nước cất
5.1 Lấy mẫu
Lấy mẫu theo điều 5.1 của TCVN 12371-1:2019.
5.2 Bảo quản mẫu
Bảo quản mẫu khi giám định hoặc sau khi giám định như sau:
+ Các bộ phận tươi theo điều 5.2.2.1 của TCVN 12371-1:2019
+ Sản phẩm khô theo điều 5.2.2.2 của TCVN 12371-1:2019
Triệu chứng khác nhau tùy thuộc vào các dòng virus, cây kí chủ hay thời gian trong năm. Triệu chứng chung của bệnh là khảm, vết chấm lốm đốm và lốm đốm vàng. Triệu chứng gây hoại tử trên đậu Hà Lan hoặc cà chua, chết hoại từng phần trên cây con đậu cô ve.
Hình 1- Ví dụ triệu chứng bệnh do Alfalfa mosaic virus gây ra trên cỏ linh lăng
Khi kiểm tra lô hàng cần chú ý các nước mà virus có phân bố (xem phụ lục A) và các loài cây mà virus gây hại (xem phụ lục A).
7.1 Giám định bằng ELISA
7.1.1 Tách chiết mẫu
Nghiền lá trong đệm Cacbonate (phụ lục B.1), Đặt ống effendorf (3.2) chứa dịch mẫu đã nghiền vào máy ly tâm (3.1), ly tâm ở 3 000 vòng/phút trong 30 giây thu phần dịch trong.
7.1.2 Quy trình thực hiện ELISA
Thực hiện theo điều 7.1.2.3 của TCVN 12371 -1:2019
7.2 Giám định bằng RT-PCR
7.2.1 Tách chiết RNA
Thực hiện theo điều 7.2.1 của TCVN 12371-1:2019
7.2.2 Nhân gen
Sử dụng cặp mồi đặc hiệu (Bhat, 2002):
AMV-F 5'-CCATCATGAGTTCTTCACAAAAG-3'
AMV-R 5'-TCGTCACGTCATCAGTGAGAC-3'
Chu trình nhiệt:
94 °C trong 5 phút |
|
95 °C trong 30 giây | Lặp lại 35 chu kì |
58 °C trong 30 giây | |
72 °C trong 30 giây | |
72 °C trong 7 phút |
|
7.2.3 Đọc kết quả
Sản phẩm được điện di bằng agarose gel 2 % (4.1).
Mẫu dương tính cho đoạn gen kích thước 351 kb.
7.3 Kết luận
Mẫu được kết luận là loài Alfalfa mosaic virus khi:
- Có kết quả dương tính với phương pháp giám định bằng ELISA
hoặc
- Có kết quả dương tính với phương pháp giám định bằng RT-PCR 8 Báo cáo kết quả
Nội dung phiếu kết quả giám định gồm những thông tin cơ bản sau:
- Thông tin về mẫu giám định.
- Phương pháp giám định
- Người giám định/cơ quan giám định
- Kết quả giám định: Tên khoa học của loài
Phiếu kết quả giám định chi tiết tham khảo phụ lục C.
A.1 Tên khoa học và vị trí phân loại
Tên tiếng Việt: Bệnh virus khảm lá cỏ linh lăng
Tên khoa học: Alfalfa mosaic virus (AMV)
Tên khác:
Alfalfa mosaic alfamovirus
Alfalfa virus1 and 2
Lucerne mosaic virus
Marmor medicaginis
Potato calico virus
Vị trí phân loại:
Bộ: Nidovirales
Họ: Bromoviridae
A.2 Phân bố
Trong nước: Bệnh chưa có ở Việt Nam
Trên thế giới: Châu Á: Bangladesh, China, India, Iran, Iraq, Israel, Japan, Jordan, Korea, Kyrgyzstan, Lebanon, Nepal, Oman, Pakistan, Saudi Arabia, Syria, Taiwan, Tajikistan, Turkey, Uzbekistan, Yemen, Myanmar; Châu Phi: Algeria, Egypt, Ethiopia, Libya, Morocco, Nigeria, South Africa, Sudan, Tunisia, Zambia, Kenya, Tanzania; Châu Mỹ: Canada, Mexico, USA, Argentina, Brazil, Chile, Colombia, Peru, Venezuela; Châu Âu: Austria, Belarus, Belgum, Bulgaria, Croatia, Cyprus, Czech, Czechoslovakia, Denmark, Finland, France, Germany, Greece, Hungary, Ireland, Italy, Lithuania, Poland, Portugal, Romania, Russian Federation, Serbia, Slovakia, Slovenia, Spain, Switzeland, Ukraine, Yugoslavia, Netherlands, UK; Châu đại dương: Australia, New Zealand.
A.3 Ký chủ
Apium graveolens (cần tây), Apium graveolens var. rapaceum, Arabidopsis thaliana, Capsicum annuum (ớt chuông), Cicer arietinum, Cucurbitaceae (họ bầu bí), Glycine max (đậu tương), Lablab purpureus, Lactuca sativa (rau diếp), Medicago sativa (cỏ linh lăng), Nicotiana tabacum (thuốc lá), Phaseolus (đậu), Solanum lycopersicum (cà chua), Solanum tuberosum (khoai tây), Trifolium incarnatum (cỏ ba lá Crimson), Trifolium pratense (cỏ ba lá tím), Trifolium repens (cỏ ba lá trắng), Trifolium subterraneum, Viburnum opulus, Vigna radiata (đậu xanh), Vigna unguiculata (đậu đũa), Coriandrum sativum (rau mùi), Cucumis sativus (dưa chuột), Cajanus cajan (đậu điều), Pisum sativum (đậu hà lan), Capsicum (ớt), Cyphomandra betacea, Solanum melongena (cà tím), Vitis vinifera (nho) ....
A.4 Đặc điểm sinh học
AMV lan truyền qua vòi hút của Acyrthosiphonpisum và Myzuspersicae. Virus truyền bệnh qua rệp theo phương thức không bền vững. Virus qua đông trên cây họ đậu và lan truyền qua hạt và củ khoai tây.
Các chủng hoặc biến thể của AMV đã được phân biệt bằng triệu chứng, ký chủ, hình thức tập hợp các hạt trong tế bào thuốc lá, thành phần hóa học của lớp vỏ protein, phấn hoa và hạt cây.
B.1 Đệm cacbonate
Na2CO3 (4.2) | 1,59g |
NaHCO3(4.3) | 2,93g |
NaN3(4.4) | 0,2g |
Hoà tan các thành phần trên trong 1 000 ml nước cất (4.5), chỉnh pH 9,6 bảo quản ở 4 °C
Phụ lục C
Cơ quan giám định ....................................... | CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM |
| ………., ngày ... tháng ... năm 20..…... |
PHIẾU KẾT QUẢ GIÁM ĐỊNH
1. Tên hàng hóa:
2. Nước xuất khẩu:
3. Xuất xứ:
4. Phương tiện vận chuyển: Khối lượng:
5. Địa điểm lấy mẫu:
6. Ngày lấy mẫu:
7. Người lấy mẫu:
8. Tình trạng mẫu:
9. Ký hiệu mẫu:
10. Số mẫu lưu:
11. Người giám định:
12. Phương pháp giám định: Theo TCVN 12371-2-4:2020. Quy trình giám định vi khuẩn,virus, phytoplasma gây bệnh thực vật. Phần 2-4: Yêu cầu cụ thể đối với Alfalfa mosaic virus
13. Kết quả giám định:
Tên tiếng Việt: Bệnh virus khảm lá cỏ linh lăng
Tên khoa học: Alfalfa mosaic virus
Tên khác:
Alfalfa mosaic alfamovirus
Alfalfa virus 1 and 2
Lucerne mosaic virus
Marmor medicaginis
Potato calico virus
Vị trí phân loại:
Bộ: Nidovirales
Họ: Bromoviridae
TRƯỞNG PHÒNG KỸ THUẬT | THỦ TRƯỞNG ĐƠN VỊ |
[1] Bradbury J. F (1986), Guide to Plant Pathogenic Bacteria, C.A.B International, United Kingdom.
[2] CABI (2017), Crop Protection Compedium.
[3] Commonwealth Mycologycal Institute (1983), Plant Pathologist’s Pocketbook.
[4] IPPC (2006), ISPM 27 Diagnostic protocols for regulated pests.
[5] Viện Bảo vệ thực vật (1997),Tập 1: Phương pháp điều tra cơ bản dịch hại nông nghiệp và thiên địch của chúng, Phương pháp nghiên cứu bảo vệ thực vật, NXB Nông nghiệp.