TIÊU\r\nCHUẨN QUỐC GIA

TCVN\r\n12371-2-4:2020

QUY\r\nTRÌNH GIÁM ĐỊNH VI KHUẨN, VIRUS ,PHYTOPLASMA GÂY BỆNH THỰC VẬT
\r\nPHẦN 2-4: YÊU CẦU CỤ THỂ ĐỐI VỚI ALFAFA MOSAIC\r\nVIRUS

Procedure for\r\nidentification of plant disease caused by bacteria, virus, phytoplasma
\r\nPart\r\n2-4: Particular requirements for Alfalfa mosaic virus

Lời nói đầu

TCVN 12371-2-4:2020 do Cục Bảo vệ thực\r\nvật biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu\r\nchuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

Bộ tiêu chuẩn TCVN 12371: Quy trình\r\ngiám định vi khuẩn, virus, phytoplasma gây bệnh thực vật gồm các phần sau:

- TCVN 12371-1:2019: Phần 1: Yêu cầu\r\nchung

- TCVN 12371-2-1:2018: Phần 2-1: Yêu cầu\r\ncụ thể đối với Plum poxvirus

- TCVN 12371-2-2:2018: Phần 2-2: Yêu cầu\r\ncụ thể đối với vi khuẩn Xylella fastidiosa Wells et al.

- TCVN 12371-2-3:2019: Phần 2-3: Yêu cầu\r\ncụ thể đối với vi khuẩn Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis\r\n(Smith) Davis et al.

- TCVN 12371-2-4:2020: Phần 2-4: Yêu cầu\r\ncụ thể đối với Alfalfa mosaic virus

- TCVN 12371-2-5:2020: Phần 2-5: Yêu cầu\r\ncụ thể đối với vi khuẩn Pantoea stewartii (Smith) Mergaert

- TCVN 12371-2-6:2020: Phần 2-6: Yêu cầu\r\ncụ thể đối với vi khuẩn Potato spindle tuber viroid

QUY TRÌNH\r\nGIÁM ĐỊNH VI KHUẨN, VIRUS, PHYTOPLASMA GÂY BỆNH\r\nTHỰC VẬT
\r\nPHẦN 2-4: YÊU CẦU CỤ THỂ ĐỐI VỚI ALFAFA MOSAIC VIRUS

Procedure for\r\nidentification of plant disease caused by bacteria, virus, phytoplasma
\r\nPart\r\n2-4: Particular requirements for Alfalfa mosaic virus

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định các yêu cầu cụ\r\nthể đối với quy trình giám định Alfalfa mosaic virus gây bệnh thực vật.

2  Tài liệu viện dẫn

Tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết\r\ncho việc áp dụng tiêu chuẩn. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì\r\náp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố\r\nthì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 12371-1:2019, Quy trình giám định\r\nvi khuẩn, virus, phytoplasma gây bệnh thực vật - Phần 1: Yêu cầu chung.

3  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông\r\nthường của phòng thử nghiệm sinh học, theo TCVN 12371- 1:2019 (điều 3) và các\r\nthiết bị sau:

3.1  Máy ly tâm: tốc độ từ 1\r\n000 vòng/phút đến 18 000 vòng/phút

3.2  Ống effendorf 1,5 ml

4  Hóa chất

Chỉ sử dụng các hóa chất loại tinh khiết\r\nphân tích, trừ khi có quy định khác. Sử dụng hóa chất theo TCVN 12371-1:2019\r\n(điều 4) và một số hóa chất sau:

4.1  Agarose gel 2\r\n%

4.2  Natri carbonat (Na₂CO₃)

4.3  Natri hidrocarbonat (NaHCO₃)

4.4  Natri azua (NaN₃)

4.5  Nước cất

5  Lấy mẫu và bảo quản\r\nmẫu

5.1  Lấy mẫu

Lấy mẫu theo điều 5.1 của TCVN\r\n12371-1:2019.

5.2  Bảo quản mẫu

Bảo quản mẫu khi giám định hoặc sau\r\nkhi giám định như sau:

+ Các bộ phận tươi theo điều 5.2.2.1 của\r\nTCVN 12371-1:2019

+ Sản phẩm khô theo điều 5.2.2.2 của\r\nTCVN 12371-1:2019

6  Phát hiện bệnh

Triệu chứng khác nhau tùy thuộc vào\r\ncác dòng virus, cây kí chủ hay thời gian trong năm. Triệu chứng chung của bệnh\r\nlà khảm, vết chấm lốm đốm và lốm đốm vàng. Triệu chứng gây hoại tử trên đậu Hà\r\nLan hoặc cà chua, chết hoại từng phần trên cây con đậu cô ve.

Hình 1- Ví dụ\r\ntriệu chứng bệnh do Alfalfa mosaic virus gây ra trên cỏ linh lăng

Khi kiểm tra lô hàng cần chú ý các nước\r\nmà virus có phân bố (xem phụ lục A) và các loài cây mà virus gây hại (xem phụ lục\r\nA).

7  Giám định

7.1  Giám định bằng ELISA

7.1.1  Tách chiết mẫu

Nghiền lá trong đệm Cacbonate (phụ lục\r\nB.1), Đặt ống effendorf (3.2) chứa dịch mẫu đã nghiền vào máy ly tâm (3.1), ly\r\ntâm ở 3 000 vòng/phút trong 30 giây thu phần dịch trong.

7.1.2  Quy trình thực hiện ELISA

Thực hiện theo điều 7.1.2.3 của TCVN\r\n12371 -1:2019

7.2  Giám định bằng RT-PCR

7.2.1  Tách chiết RNA

Thực hiện theo điều 7.2.1 của TCVN\r\n12371-1:2019

7.2.2  Nhân gen

Sử dụng cặp mồi đặc hiệu (Bhat, 2002):

AMV-F 5'-CCATCATGAGTTCTTCACAAAAG-3'

AMV-R 5'-TCGTCACGTCATCAGTGAGAC-3'

Chu trình nhiệt:

7.2.3  Đọc kết quả

Sản phẩm được điện di bằng agarose gel\r\n2 % (4.1).

Mẫu dương tính cho đoạn gen kích thước\r\n351 kb.

7.3  Kết luận

Mẫu được kết luận là loài Alfalfa\r\nmosaic virus khi:

- Có kết quả dương tính với phương\r\npháp giám định bằng ELISA

hoặc

- Có kết quả dương tính với phương\r\npháp giám định bằng RT-PCR 8 Báo cáo kết quả

Nội dung phiếu kết quả giám định gồm\r\nnhững thông tin cơ bản sau:

- Thông tin về mẫu giám định.

- Phương pháp giám định

- Người giám định/cơ quan giám định

- Kết quả giám định: Tên khoa học của\r\nloài

Phiếu kết quả giám định chi tiết tham\r\nkhảo phụ lục C.

Phụ\r\nlục A

(Tham\r\nkhảo)

Thông tin chung

A.1 Tên khoa học và vị trí phân loại

Tên tiếng Việt: Bệnh virus khảm lá cỏ\r\nlinh lăng

Tên khoa học: Alfalfa mosaic virus\r\n(AMV)

Tên khác:

Alfalfa mosaic alfamovirus

Alfalfa virus1 and 2

Lucerne mosaic virus

Marmor medicaginis

Potato calico virus

Vị trí phân loại:

Bộ: Nidovirales

Họ: Bromoviridae

A.2  Phân bố

Trong nước: Bệnh chưa có ở Việt Nam

Trên thế giới: Châu Á: Bangladesh,\r\nChina, India, Iran, Iraq, Israel, Japan, Jordan, Korea, Kyrgyzstan, Lebanon,\r\nNepal, Oman, Pakistan, Saudi Arabia, Syria, Taiwan, Tajikistan, Turkey,\r\nUzbekistan, Yemen, Myanmar; Châu Phi: Algeria, Egypt, Ethiopia, Libya, Morocco,\r\nNigeria, South Africa, Sudan, Tunisia, Zambia, Kenya, Tanzania; Châu Mỹ:\r\nCanada, Mexico, USA, Argentina, Brazil, Chile, Colombia, Peru, Venezuela; Châu\r\nÂu: Austria, Belarus, Belgum, Bulgaria, Croatia, Cyprus, Czech, Czechoslovakia,\r\nDenmark, Finland, France, Germany, Greece, Hungary, Ireland, Italy, Lithuania,\r\nPoland, Portugal, Romania, Russian Federation, Serbia, Slovakia, Slovenia,\r\nSpain, Switzeland, Ukraine, Yugoslavia, Netherlands, UK; Châu đại dương:\r\nAustralia, New Zealand.

A.3  Ký chủ

Apium graveolens (cần tây), Apium\r\ngraveolens var. rapaceum, Arabidopsis thaliana, Capsicum annuum\r\n(ớt chuông), Cicer arietinum, Cucurbitaceae (họ bầu bí), Glycine max\r\n(đậu tương), Lablab purpureus, Lactuca sativa (rau diếp), Medicago\r\nsativa (cỏ linh lăng), Nicotiana tabacum (thuốc lá), Phaseolus (đậu), Solanum\r\nlycopersicum (cà chua), Solanum tuberosum (khoai tây), Trifolium\r\nincarnatum (cỏ ba lá Crimson), Trifolium pratense (cỏ ba lá tím), Trifolium\r\nrepens (cỏ ba lá trắng), Trifolium subterraneum, Viburnum opulus,\r\nVigna radiata (đậu xanh), Vigna unguiculata (đậu đũa), Coriandrum\r\nsativum (rau mùi), Cucumis sativus (dưa chuột), Cajanus cajan\r\n(đậu điều), Pisum sativum (đậu hà lan), Capsicum (ớt), Cyphomandra\r\nbetacea, Solanum melongena (cà tím), Vitis vinifera (nho) ....

A.4  Đặc điểm sinh học

AMV lan truyền qua vòi hút của Acyrthosiphon\r\npisum và Myzus persicae. Virus truyền bệnh qua rệp theo\r\nphương thức không bền vững. Virus qua đông trên cây họ đậu và lan truyền qua hạt\r\nvà củ khoai tây.

Các chủng hoặc biến thể của AMV đã được\r\nphân biệt bằng triệu chứng, ký chủ, hình thức tập hợp các hạt trong tế bào thuốc\r\nlá, thành phần hóa học của lớp vỏ protein, phấn hoa và hạt cây.

Phụ\r\nlục B

(Quy\r\nđịnh)

Dung dịch

B.1  Đệm cacbonate

Hoà tan các thành phần trên trong 1\r\n000 ml nước cất (4.5), chỉnh pH 9,6 bảo quản ở 4 °C

Phụ\r\nlục C

(Tham\r\nkhảo)

Mẫu phiếu kết quả giám định

PHIẾU KẾT QUẢ GIÁM ĐỊNH

1. Tên hàng hóa:

2. Nước xuất khẩu:

3. Xuất xứ:

4. Phương tiện vận chuyển:                         Khối\r\nlượng:

5. Địa điểm lấy mẫu:

6. Ngày lấy mẫu:

7. Người lấy mẫu:

8. Tình trạng mẫu:

9. Ký hiệu mẫu:

10. Số mẫu lưu:

11. Người giám định:

12. Phương pháp giám định: Theo TCVN\r\n12371-2-4:2020. Quy trình giám định vi khuẩn,virus, phytoplasma gây bệnh thực vật.\r\nPhần 2-4: Yêu cầu cụ thể đối với Alfalfa mosaic virus

13. Kết quả giám định:

Tên tiếng Việt: Bệnh virus khảm lá cỏ\r\nlinh lăng

Tên khoa học: Alfalfa mosaic virus

Tên khác:

Alfalfa mosaic alfamovirus

Alfalfa virus 1 and 2

Lucerne mosaic virus

Marmor medicaginis

Potato calico virus

Vị trí phân loại:

Bộ: Nidovirales

Họ: Bromoviridae

Thư\r\nmục tài liệu tham khảo

[1] Bradbury J. F (1986), Guide to\r\nPlant Pathogenic Bacteria, C.A.B International, United Kingdom.

[2] CABI (2017), Crop Protection\r\nCompedium.

[3] Commonwealth Mycologycal Institute\r\n(1983), Plant Pathologist’s Pocketbook.

[4] IPPC (2006), ISPM 27 Diagnostic\r\nprotocols for regulated pests.

[5] Viện Bảo vệ thực vật (1997),Tập\r\n1: Phương pháp điều tra cơ bản dịch hại nông nghiệp và thiên địch của chúng,\r\nPhương pháp nghiên cứu bảo vệ thực vật, NXB Nông nghiệp.