TIÊU CHUẨN NGÀNH

28 TCN 180 : 2002

HÀM LƯỢNG THUỐC TRỪ SÂU GỐC CLO HỮU\r\nCƠ VÀ POLY CLORUA BIPHENYL TRONG THỦY SẢN VÀ SẢN PHẨM THỦY SẢN - PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH\r\nLƯỢNG BẰNG SẮC KÝ KHÍ

Organochlorine\r\npesticides and PCB-congeners in fish and fishery products - Method for\r\nquantitative analysis by Gas Chromatography

1 Phạm vi áp\r\ndụng

1.1 Tiêu chuẩn\r\nnày qui định phương pháp xác định hàm lượng các thuốc trừ sâu gốc Clo hữu cơ và\r\nPoly Clorua Biphenyl (sau đây gọi tắt là PCBs) trong thuỷ sản và sản phẩm thuỷ\r\nsản bằng hệ thống sắc ký khí (sau đây gọi tắt là GC).

1.2 Giới hạn\r\nphát hiện của phương pháp đối với: α-BHC là 1,0 µg/kg; β-BHC là 4,5 µg/kg;\r\nγ-BHC là 0,7 µg/kg; heptaclo là 1,0 µg/kg; alđrin là 1,5 µg/kg; đielđrin là 2,5\r\nµg/kg; enđrin là 5,0 µg/kg; DDT là 1,5 µg/kg và clođan là 1,0µg/kg.

2 Phương pháp\r\ntham chiếu

Tiêu chuẩn\r\nnày được xây dựng dựa theo phương pháp 'Rapid determination of chlorinated\r\npesticides, polychlorinated biphenyls', Mitt.Lebendsmittelunters. Hyg.\r\n65:131-150 (1974) và phương pháp số S9 nêu trong Sổ tay hướng dẫn phân tích dư\r\nlượng thuốc trừ sâu của Cộng hoà liên bang Ðức (năm 1987).

3 Nguyên tắc

3.1 Thuốc trừ\r\nsâu nhóm clo hữu cơ bao gồm các hợp chất chính hay đồng phân của chúng như sau:\r\nalđrin; α-clođan; γ-clođan; oxi-clođan; p,p' DDD; p,p' DDE; o,p' DDT; p,p' DDT;\r\nđielđrin; α-endosulfan; enđrin; heptaclo, heptaclo epoxit; hexaclobenzen (HCB);\r\nα-hexacloxyclohexan (α-HCH); β-hexacloroxyclohexan (β-HCH); δ-hexacloxyclohexan\r\n(δ-HCH); isođrin, trans-nonaclo; γ-hexachlorocyclohexan (γ-HCH).

3.2 Các hợp\r\nchất nhóm PCBs bao gồm: 4-PCB (CB3); 2,4,4'-PCB (CB28); 2,2',4,4'-PCB (CB47);\r\n2,2',5,5'-PCB (CB52); 2,2',5,6'-PCB (CB53); 2,2',4,5,5'-PCB (CB101);\r\n2,3,4,4',5'-PCB (CB114); 2,3',4,4',5'-PCB (CB118); 2,3,3',4,5'-PCB (CB122);\r\n2,2',3,3',4,4'-PCB (CB128); 2,2',3,4,4',5'-PCB (CB138); 2,3,3,4',5',6'-PCB\r\n(CB149); 2,2',4,4',5,5'-PCB (CB153); 2,2',4,4',6,6'-PCB (CB155);\r\n2,3,3',4,4',5'-PCB (CB156); 2,3,3',4,4',5'-PCB (CB157); 2,3',4,4',5'-PCB\r\n(CB167); 2,2',3,3',4,4',5'-PCB (CB170); 2,2',3,4,4',5,5'-PCB (CB180); 2,2',3,3',4,5,5',6-PCB\r\n(CB198).

3.3 Trong mẫu\r\nthủy sản các hợp chất trên được chiết tách ra bằng dung môi pentan. Dịch chiết\r\nđược làm sạch bằng phương pháp chiết pha rắn (SPE) trên florisil sau đó được\r\ntách làm 2 phân đoạn trên cột silicagel. Phân đoạn A chứa các PCB (trừ CB3),\r\nHCB, alđrin, isođrine, heptaclo và p,p' DDE. Phân đoạn B chứa CB3, p,p' DDE và\r\ncác thuốc trừ sâu gốc clo còn lại. Hàm lượng các thuốc trừ sâu gốc clo hữu cơ\r\nvà PCBs trong các phân đoạn chiết được xác định trên máy sắc ký khí với đầu dò\r\nbắt giữ điện tử (sau đây gọi tắt là ECD).

4 Thiết bị, dụng cụ, hoá chất, dung dịch chuẩn và dung dịch thử

4.1 Thiết bị\r\nvà dụng cụ

4.1.1 Cột sắc\r\nký thủy tinh (có van khoá), kích thước L x ID là 500 x 20 mm và 500 x 8mm.

4.1.2 Hệ thống\r\ncô quay chân không.

4.1.3 Hệ thống\r\nchiết mẫu soxhlet.

4.1.4 Máy\r\nnghiền đồng thể tốc độ 10 000 vòng/phút.

4.1.5 Máy lắc

4.1.6 Tủ sấy

4.1.7 Lò nung

4.1.8 Cân\r\nphân tích có độ chính xác 0,0001 g.

4.1.9 Cột mao\r\nquản (cho máy GC): loại SPBTM - SUPELCO, kích thước L x ID = 30 m x 0,32 mm hoặc\r\ntương đương.

4.1.10 Máy sắc\r\nký khí với đầu dò ECD.

4.1.11 Hệ ống\r\nsoxhlet: các ống soxhlet được làm sạch bằng cách chưng cất với pentan hay\r\ndiclormetan trên hệ thống soxhlet trong 4 giờ.

4.1.12 Cối sứ.

4.1.13 Bể siêu âm

4.1.14 Bình thuỷ tinh, bình tam giác dung tích 50 ml.

4.2 Hoá chất

4.2.1 Ete\r\nđietyl loại dùng cho HPLC.

4.2.2 Pentan\r\nloại dùng cho HPLC.

4.2.3 Sulfat\r\nnatri khan tinh khiết được làm sạch bằng điclometan trên hệ thống soxhlet, sau\r\nđó nung ở nhiệt độ 5000C trong 4 giờ và giữ trong chai thuỷ tinh.

4.2.4\r\nIsooctan loại dùng cho HPLC.

4.2.5 Khí\r\nmang: Heli (loại dùng cho GC).

4.2.6\r\nFlorisil cỡ hạt từ 60 đến100 mesh được làm sạch bằng hệ thống soxhlet và nung ở\r\nnhiệt độ 4500C trong 18 giờ, sau đó cho vào chai thuỷ tinh được phủ bằng giấy\r\nnhôm và được giữ ở nhiệt độ 1200C trong tủ sấy.

4.2.7\r\nFlorisil được hoạt hoá: lấy một lượng florisil (4.2.6) từ tủ sấy đổ trực tiếp\r\nqua phễu vào một bình đáy tròn (erlenmeye) có nút nhám. Thêm vào bình 3 % nước\r\ntheo tỷ lệ trọng lượng (w/w), sau đó lắc hỗn hợp khoảng 30 phút bằng máy lắc và\r\nđể yên khoảng 1 giờ trước khi sử dụng.

4.2.8 Bông\r\nthuỷ tinh được làm sạch bằng pentan hay điclometan trên hệ thống soxhlet và để\r\nkhô trên miếng giấy nhôm đặt trong tủ hút.

4.2.9 Cát sạch\r\nđược nung ở nhiệt độ 5000C trong 3 giờ, để cho nguội trên giấy nhôm sau đó giữ\r\ntrong chai có nắp vặn.

4.2.10\r\nSilicagel cỡ hạt từ 70 đến 140 mesh.

4.2.11\r\nSilicagel đã được hoạt hoá: lấy silicagel (4.2.10), rửa sạch bằng điclometan rồi\r\ncho vào trong chén sứ và để trong tủ sấy ở nhiệt độ 1200C trong vòng 12 giờ.\r\nSau đó, dùng giấy thiếc bọc kín mệng chén sứ và để lại vào tủ sấy ở nhiệt độ\r\n1200C trước khi sử dụng.

4.3 Dung dịch\r\nchuẩn và dung dịch thử

4.3.1 Dung dịch\r\nrửa giải: hỗn hợp dung dịch điclometan và pentan (4.2.2) theo tỷ lệ về thể tích\r\nlà 2 : 8, được pha trước khi sử dụng.

4.3.2 Chuẩn bị\r\ncác dung dịch chuẩn thuốc trừ sâu gốc clo và PCBs trong isooctan có nồng độ:\r\n0,0 µg/l, 2,5µg/l , 5µg/l, 10,0 µg/l, 20,0 µg/l từ các ống chuẩn. Tuỳ theo nồng\r\nđộ thuốc trừ sâu có trong ống chuẩn, dùng bình định mức và lượng isooctan thích\r\nhợp.

4.3.3 Dung dịch\r\nchuẩn thu hồi: pha -HCH trong dung môi isooctan để có hàm lượng là:các chuẩn của CB3, CB198 và  -HCH/g isooctan.2,0 µg CB3/g isooctan; 0,2µg CB198/g isooctan và 0,2 µg

4.3.4 Dung dịch\r\nchuẩn kiểm tra: pha chính xác hỗn hợp dung dịch chuẩn kiểm tra gồm p,p DDE và\r\nppDDT trong isooctan với hàm lượng của mỗi chất trong khoảng từ 5 đến 20 ng/ml\r\nisooctan.

5 Phương pháp tiến hành

5.1 Xác định\r\nhàm lượng chất béo trong mẫu thử

5.1.1 Nghiền\r\nđều 250,0 g mẫu thủy sản trên máy nghiền đồng thể (4.1.4). Dùng cân phân tích\r\n(4.1.8) cân chính xác 10,0 g mẫu (m) đã nghiền cho vào trong ống soxhlet sạch\r\n(4.1.11) được phủ bằng bông thuỷ tinh (4.2.8). Chiết mẫu với 150,0 ml pentan\r\ntrong 3 giờ trên hệ thống chiết mẫu soxhlet (4.1.3).

5.1.2 Cô đặc\r\ndịch chiết trên máy cô quay chân không (4.1.2) đến khoảng 20 ml. Sau đó, cô tiếp\r\nở chế độ chân không cho đến khi chỉ còn khoảng 1,0 ml.

5.1.3 Chuyển\r\ndịch đã cô vào một chén cân đã biết trước khối lượng, dùng giấy nhôm phủ lên\r\nchén cân rồi để qua đêm trong tủ hút. Sau đó, chén cân được làm khô đến khối lượng\r\nkhông đổi ở nhiệt độ 700C trong tủ sấy (sự thay đổi của chén cân không vượt quá\r\n0,0005 g) rồi để nguội tới nhiệt độ phòng trong bình hút ẩm. Phần thu được đem\r\ncân là lượng chất béo có trong mẫu.

5.2 Chuẩn bị\r\nmẫu thử

5.2.1 Cân\r\nchính xác 10,0 g mẫu (m) đã nghiền cho vào cối sứ (nếu lượng chất béo trong\r\n10,0 g mẫu lớn hơn 0,8 g thì giảm lượng mẫu để đảm bảo có tối đa 0,8 g chất béo\r\ntrong lượng mẫu đem thử nghiệm). Thêm 10,0 g cát sạch (4.2.9) và 4,0 g sunfat\r\nnatri khan (4.2.3) rồi nghiền đều bằng cối sứ (4.1.12). Hỗn hợp được đưa vào\r\ntrong ống soxhlet sạch (4.1.11), được phủ bằng bông thuỷ tinh (4.2.8). Sau đó,\r\nhỗn hợp được chiết với 150,0 ml pentan trong 3 giờ trên hệ thống chiết mẫu\r\nsoxhlet (4.1.3).

5.2.2 Nếu mẫu\r\nchứa nước, sản phẩm chiết phải được lọc qua sunfat natri khan rồi được rửa lại\r\nbằng 25,0 ml pentan. Sản phẩm chiết được cô đặc trên máy cô quay chân không\r\n(4.1.2) đến khoảng 20 ml. Sau đó, cô tiếp với chế độ chân không ở nhiệt độ 40oC\r\ncho đến khi chỉ còn khoảng 1,0 ml. Thêm vào dịch thu được 2,0 ml isooctane rồi\r\nlàm sạch dịch chiết theo qui định tại Ðiều 5.5.

5.3 Chuẩn bị\r\nmẫu trắng

Mẫu trắng được\r\nđịnh nghĩa là mẫu thủy sản đã được xác định không có thuốc trừ sâu gốc clo hữu\r\ncơ và PCBs. Tiến hành chuẩn bị mẫu trắng giống như chuẩn bị với mẫu thử theo\r\nqui định tại Ðiều 5.2.

5.4 Chuẩn bị\r\nmẫu để xác định độ thu hồi

Thêm 2,0 ml\r\ndung dịch chuẩn có hàm lượng 5,0 µg/l (4.3.2) vào 10,0 g mẫu trắng. Ðồng nhất mẫu\r\nbằng máy nghiền đồng thể (4.1.4). Tiến hành chuẩn bị mẫu giống như chuẩn bị với\r\nmẫu thử theo qui định tại Ðiều 5.2.

5.5 Làm sạch\r\ndịch chiết

5.5.1 Chuẩn bị\r\ncột

5.5.1.1 Cân\r\n25,0 g florisil đã hoạt hoá rồi cho vào cốc thuỷ tinh có mỏ chứa 50,0 ml dung\r\nmôi pentan (4.2.2). Sau đó rót từ từ dung dịch vào trong cột sắc ký thuỷ tinh\r\n(4.1.1) đã khoá van và nhồi một ít bông thuỷ tinh (4.2.8) dưới đáy cột.

5.5.1.2 Ðể\r\nyên cột cho lắng, sau đó tháo van để rút dung môi pentan ra khỏi cột cho đến\r\nkhi mức dung môi trong cột cao hơn mức florisil khoảng 1,0 cm. Thêm một ít bông\r\nthủy tinh lên phía trên lớp florisil để tránh xáo trộn tinh thể khi có dòng\r\ndung dịch đổ vào.

5.5.2 Làm sạch\r\ndịch chiết

5.5.2.1 Chuyển\r\ncác dung dịch thu được ở Ðiều 5.2.2, Ðiều 5.3 và Ðiều 5.4 vào các cột sắc ký đã\r\nchuẩn bị (5.5.1).

5.5.2.2 Cho\r\ntiếp 3 lần, mỗi lần 3,0 ml dung dịch rửa giải (4.3.1). Ðiều chỉnh khoá để tốc độ\r\nrửa giải đạt từ 4 đến 5 ml/phút.

Chú thích:\r\nkhông được để khô cột trong tất cả các bước của qui trình.

5.5.2.3 Thu\r\ntoàn bộ dịch chiết đi qua cột vào một bình thuỷ tinh đáy tròn của máy cô quay\r\nchân không (4.1.2). Tiến hành cô dung dịch thu được cho đến khi chỉ còn khoảng\r\n1,0 ml. Bổ sung thêm 1,0 ml isooctan vào trong bình rồi lắc đều để hoà tan hết\r\ncặn bám trên thành bình. Làm bay hơi từ từ bằng dòng khí nitơ cho tới khi dịch\r\nkhô hoàn toàn.

5.5.2.4 Thêm\r\nchính xác 2,0 ml isooctan rồi lắc đều để hoà tan cặn.

5.6 Phân tách\r\nthuốc trừ sâu gốc clo và PCBs

5.6.1 Chuẩn bị\r\ncột

5.6.1.1 Cân\r\nchính xác 7,0 g silicagel đã được hoạt hoá (4.2.11) vào trong bình định mức tam\r\ngiác dung tích 50 ml (4.1.14). Sau đó, cho thêm khoảng 25,0 ml pentan, lắc đều\r\nrồi để cho lắng. Ðổ hỗn hợp này vào trong cột sắc ký thuỷ tinh kích thước L x\r\nID là 500 x 8 mm (4.1.1) đã nhồi một ít bông thuỷ tinh (4.2.8) dưới đáy cột.

Chú\r\nthích: trong quá trình nhồi cột phải luôn giữ mức pentan trong cột cao hơn phần\r\nsilicagel trong cột.

5.6.1.2 Ðể\r\nyên cho silicagel lắng xuống rồi bổ sung một lượng tinh thể sulfat natri\r\n(4.2.3) vào trong cột với chiều cao khoảng 2 cm. Mở khoá để tháo bớt pentan\r\ntrong cột đến khi mức pentan ngang bằng với mặt trên của phần tinh thể sulfat\r\nnatri.

5.6.2 Kiểm\r\ntra cột tách chiết silicagel và dung môi pentan

5.6.2.1 Lấy\r\nchính xác 2,0 ml dung dịch chuẩn kiểm tra (4.3.4) cho qua cột silicagel đã chuẩn\r\nbị (5.6.1). Ðiều chỉnh khoá để tốc độ chảy khoảng 40 giọt/giây. Sau đó, cho từ\r\ntừ 100,0 ml pentan qua cột. Thu lần lượt các dung dịch chiết chảy qua cột vào\r\ntrong 9 bình thuỷ tinh (4.1.14). Bình thứ nhất (ký hiệu là E₁) thu\r\n60,0 ml đầu, các bình tiếp theo (ký hiệu từ E₂ đến E₉) mỗi\r\nbình thu lần lượt khoảng 5,0 ml dịch chiết.

5.6.2.2 Cô\r\nquay các dung dịch trong 9 bình nói trên bằng máy cô quay chân không (4.1.2)\r\ncho đến khi còn khoảng 1,0 ml. Tiến hành phân tích trên máy sắc ký khí (GC-ECD)\r\ntheo qui định tại Ðiều 5.6.3.2, Ðiều 5.6.3.3 và Ðiều 5.7. Tính hàm lượng của\r\np,p'-DDE và p,p'-DDT tương ứng của mỗi bình theo công thức nêu tại Ðiều 6.

5.6.2.3 Xác định thể tích pentan cần thiết để thu được dung\r\ndịch rửa giải A (ký hiệu là X), bằng công thức sau:

X (ml) = E₁ + E₂\r\n... + E_n-1

Trong đó:

- E là thể tích dung dịch rửa giải thu vào bình có số thứ tự\r\ntương ứng, tính bằng ml.

- n là số thứ tự của bình mà tại đó không còn phát hiện\r\np,p'-DDE

5.6.2.4 Giá\r\ntrị X chỉ đúng với cùng một lô silicagel và pentan. Thông thường giá trị X nằm\r\ntrong khoảng từ 60 đến 90 ml. Nếu hai hợp chất trong mẫu kiểm tra không thể\r\nphân tách được thì bổ sung thêm nước khoảng từ 1 đến 2 % về khối lượng vào\r\nsilicagel trong cột rồi tiến hành lặp lại các bước kiểm tra qui định tại Ðiều\r\n5.6.2.

5.6.3 Phân\r\ntách các dẫn xuất của PCB và thuốc trừ sâu gốc clo hữu cơ

5.6.3.1 Cho\r\ntoàn bộ dịch chiết đã làm sạch (5.5.2) qua cột silicagel đã chuẩn bị (5.6.1).\r\nÐiều chỉnh khoá để tốc độ chảy khoảng 40 giọt/giây. Cho từ từ X ml pentan (xác\r\nđịnh tại Ðiều 5.6.2) qua cột thu được dung dịch rửa giải A. Sau đó, cho tiếp\r\n100,0 ml hỗn hợp ete đietyl và pentan theo tỉ lệ về thể tích là 1 : 9 đi qua cột\r\nthu được dung dịch rửa giải B. Sử dụng 2 bình chứa khàc nhau để hứng riêng 2\r\ndung dịch A và B.

5.6.3.2 Thêm\r\n1,0 ml isooctan vào các dung dịch rửa giải A, B. Dung dịch thu được được cô\r\nquay bằng máy cô quay chân không (4.1.2) cho đến khi còn khoảng 25,0 ml. Sau đó\r\ntiếp tục được cô cho đến dung dịch khô hoàn toàn.

5.6.3.3 Thêm\r\nchính xác 2ml isooctan (v) và đem phân tích trên máy GC.

Chú thích: không được để khô cột trong tất cả các bước của\r\nqui trình.

5.7 Tiến hành\r\nphân tích trên GC

5.7.1 Ðiều kiện\r\nphân tích

a. Máy sắc ký\r\nkhí sử dụng đầu dò ECD, có khả năng chia dòng, có thể tuỳ chọn chế độ bơm tự động.

b. Chế độ nhiệt\r\ncủa hệ thống GC: Nhiệt độ của buồng tiêm là 250⁰C; nhiệt độ đầu dò\r\nlà 300⁰C. Chương trình nhiệt độ (mô tả chi tiết trong Biểu đồ 1) cụ\r\nthể là:

 - Duy\r\ntrì ở nhiệt độ 150⁰C trong 1 phút.

 - Tăng\r\nnhiệt độ 2⁰C/phút lên tới nhiệt độ 220⁰C.

 - Tăng\r\nnhiệt độ 20⁰C/phút lên tới nhiệt độ 240⁰C.

 - Duy\r\ntrì ở nhiệt độ 240⁰C trong 13phút.

 - Tổng\r\nthời gian là 51 phút.

c. Cột sắc ký

Cột mao quản\r\nkhông phân cực trung bình SPB -1^TM - SUPELCO (cột methylsilicon có\r\nkhả năng tách thuốc trừ sâu theo nhiệt độ sôi), nhiệt độ tối đa 360⁰C,\r\nchiều dài 30 m, bán kính trong 0,32 mm, bán kính ngoài 0,50 mm, chiều dài lớp\r\nphủ 0,25 µm.

d. Khí

- Khí mang:\r\nHeliáp suất khí 70kpa.

- Khí làm sạch:\r\nNitơ 99, 9999 %.

- Chế độ chia dòng: 1 :10.

5.7.2 Tiến\r\nhành phân tích

5.7.2.1 Tiêm\r\ncác dung dịch chuẩn (4.3.2) vào máy GC theo thứ tự từ nồng độ thấp đến cao. Mỗi\r\ndung dịch tiêm 2 lần, tính diện tích pic trung bình. Dựng đường chuẩn biểu thị\r\nmối quan hệ giữa các diện tích pic thu được và nồng độ từng loại thuốc trừ sâu\r\ntheo quan hệ tuyến tính bậc 1 (phương trình y = ax + b).

5.7.2.2 Tiêm\r\ndung dịch mẫu thử, dung dịch mẫu trắng, dung dịch mẫu để xác định độ thu vào hệ\r\nthống GC. Mỗi dung dịch mẫu tiêm 2 lần. Tính giá trị trung bình.

5.8 Yêu cầu về\r\nđộ tin cậy của phép phân tích

5.8.1 Ðộ lặp\r\nlại của 2 lần tiêm

Ðộ lệch chuẩn\r\n(CV_S) tính theo diện tích píc sắc ký của 2 lần tiêm cùng một dung dịch\r\nchuẩn phải nhỏ hơn 0,5 %.

5.8.2 Ðộ thu\r\nhồi (R)

Ðộ thu hồi được\r\nxác định bằng cách sử dụng 10 mẫu có cùng một lượng dung dịch chuẩn đã biết hàm\r\nlượng chính xác. Ðộ thu hồi tính được phải trong khoảng từ 85% đến 115 %, độ\r\nthu hồi trung bình phải lớn hơn 90 %.

5.8.3 Ðường\r\nchuẩn phải có độ tuyến tính tốt, hệ số tương quan quy hồi tuyến tính (R²)\r\nphải lớn hơn hoặc bằng 0,99.

6 Tính kết quả

Hàm lượng từng loại thuốc trừ sâu có\r\ntrong mẫu được tính trên cơ sở đường chuẩn thu được ở (5.7.2.1). Với đường chuẩn\r\nở dạng y = ax + b, hàm lượng từng loại thuốc trừ sâu có trong mẫu được tính\r\ntheo công thức sau:

Trong đó:

- C là nồng độ từng loại thuốc trừ\r\nsâu có trong mẫu, tính theo µg/kg.

- Y là hiệu số giữa diện tích pic của\r\ndịch chiết và diện tích pic có trong mẫu trắng tiêm vào GC, tính theo đơn vị diện\r\ntích.

- a, b là các thông số của đường chuẩn\r\ny = ax + b, được xác định theo Ðiều 5.7.2.1.

- F là hệ số pha loãng mẫu và có giá\r\ntrị bằng tỉ số giữa thể tích dịch chiết thu được sau khi làm sạch (5.6.3.3) và\r\nkhối lượng mẫu m (5.2.1) sử dụng.