TIÊU CHUẨN NGÀNH

28TCN179:2002

 HÀM LƯỢNG AFLATOXIN - PHƯƠNG\r\nPHÁP ĐỊNH LƯỢNG BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Aflatoxin\r\nin fishery products - Method for quantitative analysis by High Performance\r\nLiquid Chromatography

1 Phạm vi áp\r\ndụng

Tiêu chuẩn này qui định phương pháp\r\nxác định hàm lượng độc tố aflatoxin (B1, B2, G1, G2) trong thủy sản và sản phẩm\r\nthủy sản bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (sau đây gọi tắt là HPLC). Giới hạn\r\nphát hiện của phương pháp là 1,5 µg/kg.

2 Phương pháp\r\ntham chiếu

Tiêu chuẩn này được xây dựng dựa\r\ntheo phương pháp chuẩn số 49.2.05 của Hiệp hội các nhà hoá học phân tích (AOAC)\r\ncông bố năm 1997.

3 Nguyên tắc

Aflatoxin có trong mẫu thủy sản bao\r\ngồm các nhóm B1, B2, G1 và G2 được chiết tách ra bằng clorofom. Dịch chiết đựơc\r\nlàm sạch bằng phương pháp chiết pha rắn (SPE) trên silicagel. Hàm lượng\r\naflatoxin có trong dịch chiết được xác định trên hệ thống HPLC với đầu dò huỳnh\r\nquang theo phương pháp ngoại chuẩn.

4 Thiết bị, dụng\r\ncụ, hóa chất, chất chuẩn và dung dịch thử

4.1 Thiết bị, dụng cụ

4.1.1 Hệ thống HPLC với đầu dò huỳnh\r\nquang.

4.1.2 Cột sắc ký pha đảo LC18 kích\r\nthước L x ID là 25 cm x 4,6 mm, đường kính hạt từ 5 đến 10 [NAD1] µm.

4.1.3 Màng lọc mao quản kích thước\r\n0,4 µm.

4.1.4 Máy nghiền đồng thể tốc độ 10\r\n000 vòng/ phút.

4.1.5 Cân phân tích có độ chính xác\r\n0,0001 g.

4.1.6 Máy ly tâm tốc độ 5 000\r\nvòng/phút.

4.1.7 Bể siêu âm.

4.1.8 Hệ thống cô quay chân không.

4.1.9 Cột thủy tinh có khóa teflon,\r\nkích thước L x ID là 500 x 20 mm và 500 x 8 mm.

4.1.10 ống ly tâm thủy tinh dung\r\ntích 250 ml.

4.1.11 Bình cầu thủy tinh dung tích\r\n100 ml và 250 ml.

4.1.12 Bình định mức dung tích 5 ml\r\nvà 10 ml.

4.2 Hóa chất

4.2.1 Nước cất loại dùng cho HPLC.

4.2.2 Metanol loại dùng cho HPLC.

4.2.3 Clorofom loại dùng cho HPLC.

4.2.4 Axetonitril loại dùng cho\r\nHPLC.

4.2.5 n-hexan tinh khiết loại dùng\r\ncho phân tích.

4.2.6 Ete etylic tinh khiết.

4.2.7 Sulfat natri khan.

4.2.8 Silicagel cỡ hạt từ 60 đến 200\r\nmesh.

4.2.9 Silicagel đã được hoạt hóa:\r\ncân 50,0 g silicagel tinh khiết (4.2.8) để vào tủ sấy trong 2 giờ ở nhiệt độ\r\n110oC. Sau đó để nguội về nhiệt độ của phòng trong bình hút ẩm và ngâm trong\r\nclorofom 15 phút trước khi nhồi cột.

4.3 Dung dịch chuẩn và dung dịch thử

4.3.1 Dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp gồm:\r\nB1 (nồng độ 100,0 µg/l), B2 (nồng độ 20,0 µg/l), G1 (nồng độ 100 µg/l) và G2 (nồng\r\nđộ 20 µg/l).

4.3.2 Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc hỗn\r\nhợp aflatoxin có nồng độ (như Ðiều 4.3.1) trong metanol từ các ống chuẩn. Tùy\r\ntheo nồng độ các aflatoxin có trong ống chuẩn, dùng bình định mức và lượng\r\nmetanol thích hợp.

4.3.3 Dung dịch chuẩn trung gian có\r\nnồng độ là B1 (10,0 µg/l), B2 (2,0 µg/l), G1 (10,0 µg/l) và G2 (2,0 µg/l): hút\r\nchính xác 1,0 ml dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp (4.3.1) vào bình định mức 10 ml\r\n(4.1.12) rồi định mức tới vạch bằng metanol (4.2.2).

4.3.4 Dung dịch chuẩn: hút chính xác\r\nlần lượt 0,0 ml, 1,0 ml, 2,0 ml, 4,0 ml, 8,0 ml và 10,0 ml dung dịch chuẩn\r\ntrung gian (4.3.3) vào các bình định mức 10 ml (4.1.12) rồi định mức tới vạch bằng\r\nmetanol. Các dung dịch chuẩn thu được có nồng độ aflatoxin lần lượt như sau:

a. Chuẩn 1 : B1 (0,0 µg/l), B2 (0,0\r\nµg/l), G1 (0,0 µg/l), G2 (0,0 µg/l).

b. Chuẩn 2 : B1 (1,0 µg/l), B2 (0,2\r\nµg/l), G1 (1,0 µg/l), G2 (0,2 µg/l).

c. Chuẩn 3 : B1 (2,0 µg/l), B2 (0,4\r\nµg/l), G1 (2,0 µg/l), G2 (0,4 µg/l).

d. Chuẩn 4 : B1 (4,0 µg/l), B2 (0,8\r\nµg/l), G1 (4,0 µg/l), G2 (0,8 µg/l).

đ. Chuẩn 5 : B1 (8,0 µg/l), B2 (1,6\r\nµg/l), G1 (8,0 µg/l), G2 (1,6 µg/l).

e. Chuẩn 6 : B1 (10,0 µg/l), B2 (2,0\r\nµg/l), G1 (10,0 µg/l), G2 (2,0 µg/l).

4.3.5 Dung dịch pha động: pha hỗn hợp\r\ncác dung môi axetonitril, metanol và nước cất loại dùng cho HPLC theo tỉ lệ về\r\nthể tích là 2 : 2 : 6.

5 Phương pháp\r\ntiến hành

5.1 Chuẩn bị mẫu thử

5.1.1 Dùng cân phân tích (4.1.5) cân\r\nchính xác 50,0 g mẫu (m) đã được băm nhuyễn cho vào ống ly tâm thuỷ tinh dung\r\ntích 250 ml (4.1.10).

5.1.2 Thêm 100,0 ml clorofom (4.2.3)\r\nvào ống rồi trộn đều trong khoảng 2 phút bằng máy nghiền đồng thể (4.1.4). Sau\r\nđó, ly tâm ống bằng máy ly tâm (4.1.6) trong khoảng 5 phút ở tốc độ 5 000\r\nvòng/phút. Tiến hành lọc dịch chiết và rửa phần bã bằng clorofom rồi cho tất cả\r\ndịch thu được vào bình cầu thuỷ tinh dung tích 250 ml (4.1.11).

5.2 Chuẩn bị mẫu trắng

Mẫu trắng được định nghĩa là mẫu thủy\r\nsản đã được xác định không có aflatoxin. Tiến hành chuẩn bị mẫu trắng giống như\r\nchuẩn bị với mẫu thử theo qui định tại Ðiều 5.1.

5.3 Chuẩn bị mẫu để xác định độ thu\r\nhồi

Thêm 2,0 ml dung dịch chuẩn 3\r\n(4.3.4.c) vào 10,0 g mẫu trắng. Ðồng nhất mẫu bằng máy nghiền đồng thể (4.1.4).\r\nTiến hành chuẩn bị mẫu giống như chuẩn bị với mẫu thử theo qui định tại Ðiều\r\n5.1. Phải chuẩn bị mẫu xác định độ thu hồi đồng thời với chuẩn bị mẫu thử và mẫu\r\ntrắng.

5.4 Làm sạch dịch chiết

5.4.1 Chuẩn bị cột

Ðặt 1 lớp bông thủy tinh vào đáy cột\r\nthủy tinh có khóa teflon (4.1.9). Ðóng khóa và cho clorofom tới khoảng 2/3 cột\r\nrồi thêm lần lượt 5,0 g sulfat natri khan (4.2.7), 20,0g silicagel đã hoạt hóa\r\n(4.2.8), 15 g sulfat natri khan (4.2.7).

Chú thích: để tránh khô cột luôn giữ\r\nmực clorofom cao hơn lớp sulfat natri khan trên cùng khoảng 1,5 cm.

5.4.2 Làm sạch dịch chiết

5.4.2.1 Cô dịch chiết thu được\r\n(5.1.2) trên hệ thống cô quay chân không (4.1.8) còn khoảng 5,0 ml ở nhiệt độ\r\n40 oC. Dùng pipet chuyển dung dịch từ bình cầu (5.1.2) vào cột làm sạch đã chuẩn\r\nbị (5.4.1) và tráng rửa bình cầu bằng clorofom. Ðiều chỉnh khoá để tốc độ chảy\r\ncủa dung dịch ra khỏi cột khoảng từ 1,0 đến 1,5 ml/phút. Trong giai đoạn này,\r\naflatoxin sẽ hấp phụ lên các hạt silicagel.

5.4.2.2 Thêm vào cột lần lượt 50,0\r\nml n-hexan (4.2.5), 50,0 ml ete etylic (4.2.6). Ðiều chỉnh tốc độ dung môi chảy\r\nqua cột ở 1,0 ml/phút. Sau đó loại bỏ dịch chảy ra khỏi cột.

5.4.2.3 Giải hấp các aflatoxin khỏi\r\ncột làm sạch bằng 50,0 ml hỗn hợp clorofom và metanol theo tỉ lệ về thể tích là\r\n97: 3 với tốc dộ 1,0 ml/phút. Hứng dung dịch chảy ra khỏi cột vào bình cầu dung\r\ntích 100 ml (4.1.11). Cô dịch thu được trên hệ thống cô quay chân không (4.1.8)\r\nở nhiệt độ 40^o C cho đến khô hoàn toàn. Hoà tan cặn bằng 5,0 ml (V)\r\ndung dịch pha động (4.3.5) trong bình định mức 5 ml (4.1.12). Tiến hành phân\r\ntích hàm lượng các aflatoxin trên HPLC theo qui định tại Ðiều 5.5.

5.4.2.4 Tiến hành làm sạch mẫu trắng\r\n(5.2) và mẫu để xác định độ thu hồi (5.3) giống như với mẫu thử (5.1) theo qui\r\nđịnh tại Ðiều 5.4.2.1, Ðiều 5.4.2.2 và Ðiều 5.4.2.3.

5.5 Tiến hành phân tích trên HPLC

5.5.1 Ðiều kiện phân tích

a. Cột sắc ký : RP-LC 18, kích thước\r\nL x ID là 25 cm x 4,6 mm, đường kính hạt 5 -10 [NAD2] µm.

b. Nhiệt độ cột : 35^oC.

c. Pha động : Hỗn hợp gồm:\r\naxetonitril, metanol và nước cất (4.3.5.

d. Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút.

đ. Bước sóng cài đặt cho đầu dò huỳnh\r\nquang là: (kích hoạt) E x 365 nm, (phát xạ) Em 455 nm.

e. Thể tích tiêm : 20 µl.

5.5.2 Tiêm các dung dịch chuẩn\r\n(4.3.4) vào máy HPLC theo thứ tự nồng độ từ thấp đến cao. Mỗi dung dịch tiêm 2\r\nlần, tính diện tích pic trung bình. Dựng đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa\r\ncác diện tích pic thu được và nồng độ từng loại aflatoxin theo quan hệ tuyến\r\ntính bậc 1 (phương trình y = ax + b).

5.5.3 Tiêm dung dịch mẫu thử, dung dịch\r\nmẫu trắng và dung dịch xác định độ thu hồi vào hệ thống HPLC. Mỗi dung dịch mẫu\r\ntiêm 2 lần. Tính giá trị trung bình.

5.6 Yêu cầu về độ tin cậy của phép\r\nphân tích

5.6.1 Ðộ lặp lại của 2 lần tiêm

Ðộ lệch chuẩn (CVs) tính theo diện\r\ntích pic sắc ký của 2 lần tiêm cùng một dung dịch chuẩn phải nhỏ hơn 0,5 %.

5.6.2 Ðộ thu hồi (R)

Ðộ thu hồi được xác định bằng cách sử\r\ndụng 10 mẫu trắng đã cho vào một lượng dung dịch aflatoxin chuẩn đã biết hàm lượng\r\nchính xác (5.3). Ðộ thu hồi tính được phải nằm trong khoảng từ 85 % đến 115 %,\r\nđộ thu hồi trung bình phải lớn hơn 90 %.

5.6.3 Ðường chuẩn phải có độ tuyến\r\ntính tốt, hệ số tương quan quy hồi tuyến tính (R2) phải lớn hơn hoặc bằng 0,99.

6 Tính kết quả

Hàm lượng các aflatoxin có trong mẫu\r\nđược tính trên cơ sở đường chuẩn thu được (5.5.2). Với đường chuẩn ở dạng y =\r\nax +b, hàm lượng các aflatoxin có trong mẫu được tính theo công thức sau:

Trong đó:

- C là nồng độ aflatoxin có trong mẫu,\r\ntính theo µg/kg

- Y là hiệu số giữa diện tích pic của\r\ndịch chiết và diện tích pic có trong mẫu trắng tiêm vào HPLC, tính theo đơn vị\r\ndiện tích

- a, b là các thông số của đường chuẩn\r\ny = ax + b, được xác định theo Ðiều 5.5.2.

- F là hệ số pha loãng mẫu và có giá\r\ntrị bằng tỉ số giữa thể tích dịch chiết thu được sau khi làm sạch V (5.4.2) và\r\nkhối lượng mẫu m (5.1.1) sử dụng.