TIÊU CHUẨN NGÀNH

28TCN178:2002

HÀM LƯỢNG\r\nAXIT OXOLINIC TRONG SẢN PHẨM THUỶ SẢN - PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG BẰNG SẮC KÝ LỎNG\r\nHIỆU NĂNG CAO

Oxolinic\r\nacid in fishery products - Method for quantitative analysis by High Performance\r\nLiquid Chromatography

1 Phạm vi áp\r\ndụng

Tiêu chuẩn này qui định phương pháp\r\nxác định hàm lượng axit oxolinic trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng sắc\r\nký lỏng hiệu năng cao (sau đây gọi tắt là HPLC). Giới hạn phát hiện của phương\r\npháp là 0,5 mg/kg.

2 Phương pháp\r\ntham chiếu

Tiêu chuẩn này được xây dựng dựa\r\ntheo phương pháp do Trung tâm Phát triển Thuỷ sản Ðông Nam á (SEAFDEC) biên soạn.

3 Nguyên tắc

Axit oxolinic - kháng sinh thuộc\r\nnhóm Quinolon - trong mẫu thủy sản được chiết tách bằng axetonitril. Dịch chiết\r\nđược làm sạch bằng phương pháp chiết lỏng-lỏng với n-hexan bão hoà axetonitril.\r\nHàm lượng axit oxolinic trong dịch chiết được xác định trên hệ thống HPLC với đầu\r\ndò huỳnh quang theo phương pháp ngoại chuẩn.

4 Thiết bị, dụng\r\ncụ, hóa chất, dung dịch chuẩn và dung dịch thử

4.1 Thiết bị, dụng cụ

4.1.1 Hệ thống HPLC với đầu dò huỳnh\r\nquang.

4.1.2 Cột sắc ký TSK - GEL ODS - 80\r\nTM, L x ID : 150 x 4,6mm, kích thước hạt 5µm.

4.1.3 Màng lọc mao quản kích thước\r\n0,4 µm.

4.1.4 Máy nghiền đồng thể tốc độ 10\r\n000 vòng/ phút.

4.1.5 Cân phân tích có độ chính xác\r\n0,0001g.

4.1.6 Máy ly tâm tốc độ 5 000\r\nvòng/phút.

4.1.7 Bể siêu âm.

4.1.8 Hệ thống cô quay chân không.

4.1.9 ống ly tâm thuỷ tinh, dung\r\ntích 150 ml, 15ml.

4.1.10 Bình chiết dung tích 125 ml.

4.1.11 Bình cầu thủy tinh dung tích\r\n100 ml.

4.1.12 Bình định mức dung tích 10 ml\r\nvà 100 ml.

4.2 Hóa chất

4.2.1 Nước cất loại dùng cho HPLC.

4.2.2 Axetonitril loại dùng cho\r\nHPLC.

4.2.3 Metanol loại dùng cho HPLC.

4.2.4 1 - propanol tinh khiết, loại\r\ndùng cho phân tích.

4.2.5 n - hexan tinh khiết, loại\r\ndùng cho phân tích.

4.2.6 Sulfat natri khan.

4.2.7 Clorua natri tinh khiết, loại\r\ndùng cho phân tích.

4.2.8. Axit xitric loại dùng cho\r\nHPLC.

4.2.9. Axit oxolinic loại dùng cho\r\nHPLC.

4.3 Dung dịch chuẩn và dung dịch thử

4.3.1 Axit xitric 0,1 M: hòa tan\r\n21,01 g axit xitric (4.2.8) trong 1 lít nước cất (4.2.1).

4.3.2 Dung môi pha động: pha động\r\ncho tiến trình chạy HPLC là hỗn hợp của axetonitril, metanol và dung dịch axit\r\nxitric 0,1 M theo tỉ lệ về thể tích là 2 : 2 : 3.

4.3.3 Dung dịch chuẩn gốc 100 µg/ml:\r\ncân chính xác 10,0 mg axit oxolinic trên cân phân tích (4.1.5), hòa tan và định\r\nmức tới 100 ml bằng hỗn hợp axetonitril và nước cất (4.2.1) theo tỉ lệ về thể\r\ntích là 1 :1.

4.3.4 Dung dịch chuẩn trung gian 10\r\nµg/ml: hút chính xác 10,0 ml dung dịch chuẩn gốc 100 µg/ml (4.3.3) vào bình định\r\nmức 100 ml. Ðịnh mức tới vạch bằng hỗn hợp axetonitril và nước cất (4.2.1) theo\r\ntỉ lệ về thể tích là 1 :1.

4.3.5 Dung dịch chuẩn làm việc: hút\r\nchính xác lần lượt 0,2 ml, 0,5 ml, 1,0 ml, 2,0 ml, 5,0 ml và 10,0 ml dung dịch\r\nchuẩn trung gian (4.3.4) vào bình định mức 10 ml. Ðịnh mức tới vạch bằng hỗn hợp\r\naxetonitril và nước cất (4.2.1) theo tỉ lệ về thể tích là 1 :1 để được các chuẩn\r\ncó hàm lượng axit oxolinic lần lượt là: 0,2 µg/ml, 0,5 µg/ml, 1,0 µg/ml, 2,0\r\nµg/ml, 5,0 µg/ml và 10,0 µg/ml.

5 Phương pháp\r\ntiến hành

5.1 Chuẩn bị mẫu thử

5.1.1 Cân chính xác 5,0 g mẫu (m) đã\r\nđược băm nhuyễn cho vào ống ly tâm thủy tinh dung tích 150 ml (4.1.9). Thêm\r\n25,0 ml axetonitril (4.2.2) và 10,0 g sulfat natri khan (4.2.6) rồi nghiền\r\ntrong 30 giây bằng máy nghiền đồng thể (4.1.4). Ly tâm trong vòng 5 phút ở tốc\r\nđộ 2 500 vòng/phút.

5.1.2 Lọc lấy phần dịch cho vào bình\r\nchiết 125 ml (4.1.10) chứa sẵn 25,0 ml n-hexan bão hòa axetonitril.

5.1.3 Thêm 25,0 ml axetonitril vào\r\nphần bã trong ống ly tâm rồi nghiền trong 30 giây bằng máy nghiền đồng thể\r\n(4.1.4). Ly tâm trong vòng 5 phút ở tốc độ 2 500 vòng/phút và lọc lấy phần dịch\r\ncho vào bình chiết ở trên (5.1.2).

5.2 Chuẩn bị mẫu trắng

Mẫu trắng được định nghĩa là mẫu thủy\r\nsản đã được xác định không có axit oxolinic. Tiến hành chuẩn bị mẫu trắng giống\r\nnhư chuẩn bị với mẫu thử theo qui định tại Ðiều 5.1.

5.3 Chuẩn bị mẫu để xác định độ thu\r\nhồi

Thêm 2ml dung\r\ndịch chuẩn có hàm lượng 5 µg/ml vào 10,0 g mẫu trắng. Ðồng nhất mẫu bằng máy\r\nnghiền đồng thể (4.1.4). Tiến hành chuẩn bị mẫu giống như chuẩn bị với mẫu thử\r\ntheo qui định tại Ðiều 5.1.

5.4 Làm sạch dịch chiết

5.4.1 Lắc mạnh bình chiết thu được ở\r\ncác Ðiều 5.1, 5.2 và 5.3 trong vòng 10 phút rồi để yên cho tách lớp. Mở khoá để\r\nchuyển lớp axetonitril ở dưới vào bình cầu thủy tinh 100 ml (4.1.11). Thêm 5,0\r\nml 1-propanol (4.2.4) vào trong bình rồi cô cạn trên máy cô quay chân không\r\n(4.1.8) ở nhiệt độ 40oC.

5.4.2 Thêm 2,0 ml (V) hỗn hợp\r\naxetonitril và nước cất (4.2.1) theo tỷ lệ 3:7 về thể tích. Ðể bình vào trong bể\r\nđiều nhiệt của bể siêu âm (4.1.7) cho đến khi hoà tan cặn hoàn toàn.

5.4.3 Chuyển dung dịch vào ống ly\r\ntâm dung tích 15 ml (4.1.9). Thêm 100,0 mg clorua natri tinh khiết và 1,0 ml\r\ndung dịch n-hexan bão hòa axetonitril. Trộn đều trong bể siêu âm (4.1.7) và ly\r\ntâm trong vòng 5 phút ở tốc độ 2 500 vòng/phút.

5.4.4 Ðể yên cho tách lớp, sau đó\r\ndùng pipet cẩn thẩn hút lớp axetonitril ở dưới cho vào xilanh nhựa đã gắn sẵn\r\nmàng lọc mao quản (4.1.3). Tiến hành phân tích dịch lọc thu được trên HPLC theo\r\nqui định tại Ðiều 5.5.

5.5 Tiến hành phân tích trên HPLC

5.5.1 Ðiều kiện phân tích

a. Cột sắc ký : TSK - GEL ODS 80 TM,\r\nL x ID:150 x 4,6 mm, kích thước hạt 5 µm.

b. Nhiệt độ cột : 35oC.

c. Pha động : Hỗn hợp axetonitril,\r\nmetanol và axit xitric 0,1 M (4.3.2).

d. Tốc độ dòng : 0,5 ml/phút.

đ. Bước sóng cài đặt cho đầu dò huỳnh\r\nquang: (kích hoạt) E x 337nm, (phát xạ) Em 365nm.

e. Thể tích tiêm : 20 µl.

5.5.2 Tiêm\r\ncác dung dịch chuẩn (4.3.5) vào máy HPLC theo thứ tự nồng độ từ thấp đến cao. Mỗi\r\ndung dịch tiêm 2 lần, tính diện tích pic trung bình. Dựng đường chuẩn biểu thị\r\nmối quan hệ giữa các diện tích pic thu được và nồng độ axit oxolinic theo quan\r\nhệ tuyến tính bậc 1 (phương trình y = ax + b).

5.5.3 Tiêm\r\ndung dịch mẫu thử, dung dịch mẫu trắng, dung dịch xác định độ thu hồi theo qui\r\nđịnh tại Ðiều 5.4.4 vào hệ thống HPLC. Mỗi dung dịch mẫu tiêm 2 lần. Tính giá\r\ntrị trung bình.

5.6 Yêu cầu về\r\nđộ tin cậy của phép phân tích

5.6.1 Ðộ lặp\r\nlại của 2 lần tiêm

Ðộ lệch chuẩn\r\n(CVS) tính theo diện tích pic sắc ký của 2 lần tiêm cùng một dung dịch chuẩn phải\r\nnhỏ hơn 0,5 %.

5.6.2 Ðộ thu\r\nhồi (R)

Ðộ thu hồi được\r\nxác định bằng cách sử dụng 5 mẫu đã cho vào một lượng dung dịch axit oxolinic\r\nchuẩn đã biết hàm lượng chính xác. Ðộ thu hồi tính được phải trong khoảng từ 85\r\n% đến 115 %, độ thu hồi trung bình phải lớn hơn 90 %.

5.6.3 Ðường chuẩn phải có độ tuyến\r\ntính tốt, hệ số tương quan quy hồi tuyến tính (R²) phải lớn hơn hoặc\r\nbằng 0,99.

6 Tính kết quả

Hàm lượng axit oxolinic có trong mẫu\r\nđược tính trên cơ sở đường chuẩn thu được (5.5.2). Với đường chuẩn ở dạng y =\r\nax + b, hàm lượng axit oxolinic có trong mẫu được tính theo công thức sau:

Trong đó:

- C là nồng độ axit oxolinic có\r\ntrong mẫu, tính theo µgkg.

- Y là hiệu số giữa diện tích pic của\r\ndịch chiết và diện tích pic có trong mẫu trắng tiêm vào HPLC, tính theo đơn vị\r\ndiện tích

- a, b là các thông số của đường chuẩn\r\ny = ax + b, được xác định theo Ðiều 5.5.2.

- F là hệ số pha loãng mẫu và có giá\r\ntrị bằng tỉ số giữa thể tích dịch chiết thu được sau khi làm sạch V (5.4.2) và\r\nkhối lượng mẫu m (5.1.1) sử dụng.