Tiêu chuẩn này qui định phương pháp xác định hàm lượng kháng sinh nhóm tetracyclin trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (sau đây gọi tắt là HPLC). Giới hạn phát hiện của phương pháp là 10 µg/kg.
Tiêu chuẩn này được xây dựng dựa theo phương pháp số 995.09 Chlortetracyclin, Oxytetracycline, and Tetracycline trong phần ăn được của động vật, quyển I, chương 23, trang 19 - 23 (23.1.17), phương pháp chuẩn của Hiệp hội các nhà hoá học phân tích (AOAC) ban hành năm 1997.
3.1 Kháng sinh nhóm tetracyclin bao gồm 3 kháng sinh chính sau: tetracyclin (gọi tắt là TC), oxytetracyclin (gọi tắt là OTC) và clortetracyclin (gọi tắt là CTC).
3.2 Các kháng sinh này trong mẫu thủy sản được chiết tách bằng dung dịch đệm (pH 4). Dịch chiết được làm sạch bằng phương pháp chiết pha rắn (SPE) trên cột tách chiết pha đảo Sep - Pak Cartrige C18. Hàm lượng TC, OTC, CTC có trong dịch chiết được xác định trên hệ thống HPLC với đầu dò UV tại bước sóng 350 nm theo phương pháp ngoại chuẩn.
4 Thiết bị, dụng cụ, hoá chất, dung dịch chuẩn và dung dịch thử
4.1 Thiết bị, dụng cụ
4.1.1 Hệ thống HPLC với đầu dò UV.
4.1.2 Cột sắc ký pha đảo gồm có:
a. Cột sắc ký pha đảo C8, kích thước cột L x ID : 250 x 4,6 mm, kích thước hạt 5 µm.
b. Cột sắc ký pha đảo C18, kích thước cột L x ID : 250 x 4,6 mm, kích thước hạt 5µm.
4.1.3 Máy nghiền đồng thể tốc độ 10 000 vòng/phút.
4.1.4 Cân phân tích có độ chính xác 0,0001 g.
4.1.5 Máy ly tâm tốc độ 5 000 vòng/phút (sử dụng ống ly tâm dung tích 50 ml).
4.1.6 pH kế
4.1.7 ống ly tâm thủy tinh dung tích 50 ml.
4.1.8 Bình định mức dung tích 10 ml, 100 ml và 1 000 ml.
4.1.9 Cột Sep-Pak C18, dung tích 10 ml.
4.1.10 Phễu Buch-ner đường kính 5,5 cm.
4.1.11 Pipet tự động điều chỉnh được từ 2 đến10 ml.
4.1.12 Bể siêu âm.
4.2 Hoá chất
4.2.1 Ðinatri photphat khan (Na2HPO4) tinh khiết, loại dùng cho phân tích.
4.2.2 Nước cất loại dùng cho HPLC.
4.2.3 Axit xitric ngậm 1 phân tử nước, tinh khiết, loại dùng cho phân tích.
4.2.4 Ethylenđinitrilotetraaxêtat đinatri (sau đây viết tắt là EDTA) ngậm 2 phân tử nước tinh khiết, loại dùng cho phân tích.
4.2.5 Axít oxalic ngậm 2 phân tử nước, tinh khiết, loại dùng cho phân tích.
4.2.6 Metanol loại dùng cho HPLC.
4.2.7 Axetonitril loại dùng cho HPLC.
4.3 Dung dịch chuẩn và dung dịch thử
4.3.1 Dung dịch đệm McIlvaine (pH 4,0 +/- 0,05) gồm:
a. Dung dịch A: hoà tan 28,4 g Na2HPO4 khan (4.2.1) bằng nước cất (4.2.2) trong bình định mức dung tích 1 000 ml (4.1.8). Ðịnh mức tới vạch.
b. Dung dịch B: hoà tan 21,0 g axít xitric (4.2.3) bằng nước cất (4.2.2) trong bình định mức (4.1.8). Ðịnh mức tới vạch.
Cho từ từ 625 ml dung dịch A vào 1 000 ml dung dịch B. Chỉnh pH tới 4,0 (+/- 0,05) bằng cách cho từng giọt dung dịch HCl nồng độ 0,1M hoặc dung dịch NaOH nồng độ 0,1M (sử dụng pH kế để xác định pH).
Chú thích: Dung dịch bền trong vòng 1 tuần ở nhiệt độ trong phòng.
4.3.2 Dung dịch đệm McIlvaine - EDTA
Hoà tan 60,5 g EDTA (4.2.4) vào 1 625 ml dung dịch đệm McIlvaine (4.3.1).
Chú thích: Dung dịch bền trong vòng 1 tuần ở nhiệt độ trong phòng.
4.3.3 Dung dịch axit oxalic-metanol: hoà tan 1,26 g axít oxalic (4.2.5) bằng metanol (4.2.6) trong bình định mức 1 000 ml (4.1.8). Ðịnh mức tới vạch.
Chú thích: Dung dịch chiết không bền, chỉ pha trước khi sử dụng.
4.3.4 Pha động cho HPLC: hoà tan 1,26 g axít oxalíc (4.2.5) bằng nước cất (4.2.2) trong bình định mức 1 000 ml (4.1.8). Ðịnh mức tới vạch. Thêm vào dung dịch 500 ml axetonitril (4.2.7) và 166 ml metanol (4.2.6). Lọc và đuổi khí.
Chú thích: Dung dịch pha động không bền, chỉ pha trước khi sử dụng.
4.3.5 Dung dịch chuẩn gốc 1 000 µg/ml: cân 108 mg (+/- 0,1) mỗi loại kháng sinh chuẩn (TC, OTC và CTC) loại có giấy chứng nhận hàm lượng (lượng cân được điều chỉnh theo hàm lượng kháng sinh ghi trong giấy chứng nhận) vào 3 bình định mức dung tích 100 ml (4.1.8) riêng biệt. Hòa tan và định mức tới vạch 100 ml bằng metanol (4.2.6).
Chú thích: Bảo quản dung dịch tại nhiệt độ -20 0C. Dung dịch bền trong vòng 3 tháng.
4.3.6 Dung dịch chuẩn hỗn hợp 100 µg/ml: hút chính xác 10 ml các dung dịch chuẩn gốc (4.3.5) vào bình định mức 100 ml (4.1.8). Ðịnh mức tới vạch bằng metanol (4.2.6).
4.3.7 Dung dịch chuẩn hỗn hợp 25 µg/ml: hút chính xác 2,5 ml dung dịch chuẩn hỗn hợp 100 µg/ml (4.3.6) vào bình định mức 10 ml (4.1.8). Ðịnh mức tới vạch bằng metanol (4.2.6).
Chú thích: Bảo quản dung dịch trong tủ lạnh ở nhiệt độ từ 0 đến 5oC. Dung dịch bền trong vòng 1 tuần.
4.3.8 Dung dịch chuẩn hỗn hợp 0,05; 0,10; 0,25; 0,50 và 1,00 µg/ml: hút chính xác 20, 40, 100, 200, 400 µl dung dịch chuẩn hỗn hợp 25 µg/ml (4.3.7) vào các bình định mức 10 ml (4.1.8). Thêm 6 ml dung dịch axít oxalic-metanol (4.3.3) vào mỗi bình. Ðịnh mức tới vạch bằng nước cất (4.2.2).
Chú thích: Bảo quản dung dịch trong tủ lạnh ở nhiệt độ từ 0 đến 5oC. Dung dịch bền trong vòng 1 tuần.
5.1 Chuẩn bị mẫu thử
5.1.1 Cân 5,00 g (+/- 0,05) mẫu (m) đã được băm nhuyễn cho vào ống ly tâm thủy tinh (4.1.7) thứ 1. Thêm 20 ml dung dịch đệm McIlvaine - EDTA (4.3.2) vào ống rồi nghiền trong 30 giây bằng máy nghiền đồng thể (4.1.3). Sau đó, ly tâm ống bằng máy ly tâm (4.1.5) trong 10 phút ở tốc độ 3 000 vòng/phút.
5.1.2 Gạn dịch trong của ống thứ 1 vào ống ly tâm thủy tinh (4.1.7) thứ 2. Cho thêm 20 ml dung dịch đệm McIlvaine - EDTA vào ống ly tâm thuỷ tinh thứ 1. Trộn đều, ly tâm ống trong 10 phút ở tốc độ 3 000 vòng/phút rồi lại gạn dịch trong vào ống ly tâm thủy tinh thứ 2.
5.1.3 Cho thêm 10 ml dung dịch đệm McIlvaine - EDTA vào ống ly tâm thuỷ tinh thứ 1. Trộn đều rồi ly tâm ống trong 10 phút ở tốc độ 3 000 vòng/phút. Tiếp tục gạn dịch trong vào ống ly tâm thủy tinh thứ 2.
5.1.4 Ly tâm ống thủy tinh thứ 2 trong 20 phút ở tốc độ 3 000 vòng/phút. Sau đó, lọc dịch trong qua giấy lọc trên phễu Buch-ner. Rửa ống ly tâm 2 lần, mỗi lần rửa sử dụng 2 ml dung dịch đệm McIlvaine - EDTA.
5.2 Chuẩn bị mẫu trắng
Mẫu trắng được định nghĩa là mẫu thủy sản đã được xác định không có các kháng sinh thuộc nhóm TC. Tiến hành chuẩn bị mẫu trắng giống như chuẩn bị với mẫu thử theo qui định tại Ðiều 5.1.
5.3 Chuẩn bị mẫu để xác định độ thu hồi
Thêm 100 µl dung dịch chuẩn hỗn hợp 25 µg/ml (4.3.7) vào 5,00 g mẫu trắng. Ðồng nhất mẫu bằng máy nghiền đồng thể (4.1.3). Tiến hành chuẩn bị mẫu giống như chuẩn bị với mẫu thử theo qui định tại Ðiều 5.1.
5.4 Làm sạch dịch chiết
5.4.1 Chuẩn bị cột
Nối cột Sep - Pak C18 vào đầu ra của một xi lanh thủy tinh dung tích 100 ml. Thêm lần lượt 20 ml metanol (4.2.6), 20 ml nước cất (4.2.2) vào xi lanh thủy tinh. Loại bỏ dung dịch chảy qua cột.
5.4.2 Làm sạch dịch chiết
5.4.2.1 Cho lần lượt các dịch chiết trong ống ly tâm thu được tại các Ðiều 5.1.4, 5.2 và 5.3 vào các cột Sep - Pak đã được chuẩn bị ở Ðiều 5.4.1. Tráng rửa bình chứa bằng 2,0 ml dung dịch đệm McIlvaine - EDTA (4.3.2). Trong giai đoạn này, các kháng sinh nhóm tetracyclin sẽ được hấp phụ lên bề mặt các hạt rắn chứa trong cột.
Chú thích: Không được để cho cột Sep - Pak khô ở giữa hai giai đoạn chuẩn bị cột và làm sạch dịch chiết. Ðiều chỉnh cho dịch chảy ra khỏi cột từng giọt.
5.4.2.2 Cho 20 ml nước cất (4.2.2) vào xi lanh thủy tinh và cho chảy qua cột. Loại bỏ dịch chảy ra khỏi cột. Làm khô cột bằng dòng không khí sạch trong 2 phút.
5.4.2.3 Giải hấp các kháng sinh nhóm tetracyclin bằng cách cho 6,0 ml dung dịch axít oxalic-metanol (4.3.3) chảy qua cột với tốc độ 1,5 ml/phút. Thu dịch ra khỏi cột vào bình định mức 10 ml. Ðịnh mức tới vạch (thể tích V) bằng nước cất (4.2.2). Tiến hành phân tích dịch thu được trên HPLC theo qui định tại Ðiều 5.5.
5.5 Tiến hành phân tích trên HPLC
5.5.1 Ðiều kiện phân tích
a. Cột sắc ký : Cột pha đảo C8, L x ID : 250 x 4,6 mm, kích thước hạt 5 µm.
b. Nhiệt độ cột: Nhiệt độ trong phòng.
c. Pha động: Hỗn hợp dung dịch axit oxalic-metanol-axetonitrile (4.3.4).
d. Tốc độ dòng: 1,2 ml/phút.
đ. Bước sóng cài đặt cho đầu dò UV là 350 nm.
e. Thể tích tiêm: 60 µl.
5.5.2 ổn định cột sắc ký trong 30 phút bằng pha động (4.3.4).
5.5.3 Tiêm các dung dịch chuẩn (4.3.8) vào máy HPLC theo thứ tự nồng độ từ thấp đến cao. Mỗi dung dịch tiêm 2 lần, tính chiều cao pic trung bình. Dựng đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa các chiều cao pic thu được và nồng độ (µg/ml) từng loại kháng sinh theo quan hệ tuyến tính bậc 1 (phương trình y = ax + b).
5.5.4 Tiêm dung dịch mẫu thử, dung dịch mẫu trắng, dung dịch xác định độ thu hồi theo qui định tại Ðiều 5.4.2.3 vào hệ thống HPLC. Mỗi dung dịch mẫu tiêm 2 lần. Tính giá trị trung bình.
Chú thích: Sau khi phân tích xong, làm sạch hệ thống HPLC (bao gồm cả cột sắc ký) bằng hỗn hợp: nước cất (4.2.2) - metanol (4.2.6) - axetonitrile (4.2.7) theo tỷ lệ về thể tích là 7-1-2 trong 30 phút.
5.6 Yêu cầu về độ tin cậy của phép phân tích
5.6.1 Ðộ lặp lại của 2 lần tiêm
Ðộ lệch chuẩn (CVS) tính theo chiều cao pic sắc ký của 2 lần tiêm cùng một dung dịch chuẩn phải nhỏ hơn 0,5 %.
5.6.2 Ðộ thu hồi (R)
Ðộ thu hồi được xác định cho mỗi lần chạy mẫu phải lớn hơn 80 %.
5.6.3 Ðường chuẩn đối với mỗi kháng sinh phải có độ tuyến tính tốt, hệ số tương quan quy hồi tuyến tính (R2) phải lớn hơn hoặc bằng 0,995.
5.6.4 Ðối với các mẫu chứa ít hơn 0,5 µg/g kháng sinh nhóm TC, phải kiểm tra xác nhận kết quả bằng cách tiêm lại dịch chiết mẫu và dung dịch chuẩn trên cột C18 (4.1.2.b) chạy cùng chế độ như cột C8 (4.1.2.a) và so sánh thời gian lưu của píc mẫu và píc chuẩn.
Hàm lượng các kháng sinh có trong mẫu được tính trên cơ sở đường chuẩn thu được (5.5.3). Với đường chuẩn ở dạng y = ax + b, hàm lượng các kháng sinh có trong mẫu được tính theo công thức sau:
C (µg/kg) = | (Y - b) | x F x 1 000 |
a |
Trong đó:
- C là nồng độ các kháng sinh có trong mẫu, tính theo µg/kg.
- Y là hiệu số giữa chiều cao pic của dịch chiết và chiều cao pic có trong mẫu trắng tiêm vào HPLC, tính theo đơn vị độ dài.
- a, b là các thông số của đường chuẩn y = ax + b, được xác định theo Ðiều 5.5.3.
- F là hệ số pha loãng mẫu và có giá trị bằng tỉ số giữa thể tích dịch chiết thu được sau khi làm sạch V ( 5.4.2.3) và khối lượng mẫu m ( 5.1.1) sử dụng.