\r\n\r\n
TIÊU CHUẨN NGÀNH
\r\n\r\n
28TCN177:2002
\r\n\r\n
HÀM LƯỢNG\r\nTHUỐC KHÁNG SINH NHÓM TETRACYCLIN TRONG SẢN PHẨM THUỶ SẢN - PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG\r\nBẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
\r\n\r\n
Tetracyclines\r\ngroup in fishery products - Method for quantitative analysis by high\r\nperformance liquid chromatography
\r\n\r\n
1 Phạm vi áp dụng
\r\n\r\n
Tiêu chuẩn này qui định phương pháp\r\nxác định hàm lượng kháng sinh nhóm tetracyclin trong thủy sản và sản phẩm thủy\r\nsản bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (sau đây gọi tắt là HPLC). Giới hạn phát hiện\r\ncủa phương pháp là 10 µg/kg.
\r\n\r\n
2 Phương pháp tham chiếu
\r\n\r\n
Tiêu chuẩn này được xây dựng dựa\r\ntheo phương pháp số 995.09 Chlortetracyclin, Oxytetracycline, and Tetracycline\r\ntrong phần ăn được của động vật, quyển I, chương 23, trang 19 - 23 (23.1.17),\r\nphương pháp chuẩn của Hiệp hội các nhà hoá học phân tích (AOAC) ban hành năm\r\n1997.
\r\n\r\n
3 Nguyên tắc
\r\n\r\n
3.1 Kháng sinh nhóm tetracyclin bao\r\ngồm 3 kháng sinh chính sau: tetracyclin (gọi tắt là TC), oxytetracyclin (gọi tắt\r\nlà OTC) và clortetracyclin (gọi tắt là CTC).
\r\n\r\n
3.2 Các kháng sinh này trong mẫu thủy\r\nsản được chiết tách bằng dung dịch đệm (pH 4). Dịch chiết được làm sạch bằng\r\nphương pháp chiết pha rắn (SPE) trên cột tách chiết pha đảo Sep - Pak Cartrige\r\nC18. Hàm lượng TC, OTC, CTC có trong dịch chiết được xác định trên hệ thống\r\nHPLC với đầu dò UV tại bước sóng 350 nm theo phương pháp ngoại chuẩn.
\r\n\r\n
4 Thiết bị, dụng cụ, hoá chất, dung dịch chuẩn và dung dịch thử
\r\n\r\n
4.1 Thiết bị, dụng cụ
\r\n\r\n
4.1.1 Hệ thống HPLC với đầu dò UV.
\r\n\r\n
4.1.2 Cột sắc ký pha đảo gồm có:
\r\n\r\n
a. Cột sắc ký pha đảo C8, kích thước\r\ncột L x ID : 250 x 4,6 mm, kích thước hạt 5 µm.
\r\n\r\n
b. Cột sắc ký pha đảo C18, kích thước\r\ncột L x ID : 250 x 4,6 mm, kích thước hạt 5µm.
\r\n\r\n
4.1.3 Máy nghiền đồng thể tốc độ 10\r\n000 vòng/phút.
\r\n\r\n
4.1.4 Cân phân tích có độ chính xác\r\n0,0001 g.
\r\n\r\n
4.1.5 Máy ly tâm tốc độ 5 000\r\nvòng/phút (sử dụng ống ly tâm dung tích 50 ml).
\r\n\r\n
4.1.6 pH kế
\r\n\r\n
4.1.7 ống ly tâm thủy tinh dung tích\r\n50 ml.
\r\n\r\n
4.1.8 Bình định mức dung tích 10 ml,\r\n100 ml và 1 000 ml.
\r\n\r\n
4.1.9 Cột Sep-Pak C18, dung tích 10\r\nml.
\r\n\r\n
4.1.10 Phễu Buch-ner đường kính 5,5\r\ncm.
\r\n\r\n
4.1.11 Pipet tự động điều chỉnh được\r\ntừ 2 đến10 ml.
\r\n\r\n
4.1.12 Bể siêu âm.
\r\n\r\n
4.2 Hoá chất
\r\n\r\n
4.2.1 Ðinatri photphat khan\r\n(Na2HPO4) tinh khiết, loại dùng cho phân tích.
\r\n\r\n
4.2.2 Nước cất loại dùng cho HPLC.
\r\n\r\n
4.2.3 Axit xitric ngậm 1 phân tử nước,\r\ntinh khiết, loại dùng cho phân tích.
\r\n\r\n
4.2.4 Ethylenđinitrilotetraaxêtat\r\nđinatri (sau đây viết tắt là EDTA) ngậm 2 phân tử nước tinh khiết, loại dùng\r\ncho phân tích.
\r\n\r\n
4.2.5 Axít oxalic ngậm 2 phân tử nước,\r\ntinh khiết, loại dùng cho phân tích.
\r\n\r\n
4.2.6 Metanol loại dùng cho HPLC.
\r\n\r\n
4.2.7 Axetonitril loại dùng cho\r\nHPLC.
\r\n\r\n
4.3 Dung dịch chuẩn và dung dịch thử
\r\n\r\n
4.3.1 Dung dịch đệm McIlvaine (pH\r\n4,0 +/- 0,05) gồm:
\r\n\r\n
a. Dung dịch A: hoà tan 28,4 g Na2HPO4\r\nkhan (4.2.1) bằng nước cất (4.2.2) trong bình định mức dung tích 1 000 ml\r\n(4.1.8). Ðịnh mức tới vạch.
\r\n\r\n
b. Dung dịch B: hoà tan 21,0 g axít\r\nxitric (4.2.3) bằng nước cất (4.2.2) trong bình định mức (4.1.8). Ðịnh mức tới\r\nvạch.
\r\n\r\n
Cho từ từ 625 ml dung dịch A vào 1\r\n000 ml dung dịch B. Chỉnh pH tới 4,0 (+/- 0,05) bằng cách cho từng giọt dung dịch\r\nHCl nồng độ 0,1M hoặc dung dịch NaOH nồng độ 0,1M (sử dụng pH kế để xác định\r\npH).
\r\n\r\n
Chú thích: Dung dịch bền trong vòng\r\n1 tuần ở nhiệt độ trong phòng.
\r\n\r\n
4.3.2 Dung dịch đệm McIlvaine - EDTA\r\n
\r\n\r\n
Hoà tan 60,5 g EDTA (4.2.4) vào 1\r\n625 ml dung dịch đệm McIlvaine (4.3.1).
\r\n\r\n
Chú thích: Dung dịch bền trong vòng\r\n1 tuần ở nhiệt độ trong phòng.
\r\n\r\n
4.3.3 Dung dịch axit oxalic-metanol:\r\nhoà tan 1,26 g axít oxalic (4.2.5) bằng metanol (4.2.6) trong bình định mức 1\r\n000 ml (4.1.8). Ðịnh mức tới vạch.
\r\n\r\n
Chú thích: Dung dịch chiết không bền,\r\nchỉ pha trước khi sử dụng.
\r\n\r\n
4.3.4 Pha động cho HPLC: hoà tan\r\n1,26 g axít oxalíc (4.2.5) bằng nước cất (4.2.2) trong bình định mức 1 000 ml\r\n(4.1.8). Ðịnh mức tới vạch. Thêm vào dung dịch 500 ml axetonitril (4.2.7) và\r\n166 ml metanol (4.2.6). Lọc và đuổi khí.
\r\n\r\n
Chú thích: Dung dịch pha động không\r\nbền, chỉ pha trước khi sử dụng.
\r\n\r\n
4.3.5 Dung dịch chuẩn gốc 1 000\r\nµg/ml: cân 108 mg (+/- 0,1) mỗi loại kháng sinh chuẩn (TC, OTC và CTC) loại có\r\ngiấy chứng nhận hàm lượng (lượng cân được điều chỉnh theo hàm lượng kháng sinh\r\nghi trong giấy chứng nhận) vào 3 bình định mức dung tích 100 ml (4.1.8) riêng\r\nbiệt. Hòa tan và định mức tới vạch 100 ml bằng metanol (4.2.6).
\r\n\r\n
Chú thích: Bảo quản dung dịch\r\ntại nhiệt độ -20 0C. Dung dịch bền trong vòng 3 tháng.
\r\n\r\n
4.3.6 Dung dịch chuẩn hỗn hợp 100\r\nµg/ml: hút chính xác 10 ml các dung dịch chuẩn gốc (4.3.5) vào bình định mức\r\n100 ml (4.1.8). Ðịnh mức tới vạch bằng metanol (4.2.6).
\r\n\r\n
4.3.7 Dung dịch chuẩn hỗn hợp 25\r\nµg/ml: hút chính xác 2,5 ml dung dịch chuẩn hỗn hợp 100 µg/ml (4.3.6) vào bình\r\nđịnh mức 10 ml (4.1.8). Ðịnh mức tới vạch bằng metanol (4.2.6).
\r\n\r\n
Chú thích: Bảo quản dung dịch trong\r\ntủ lạnh ở nhiệt độ từ 0 đến 5oC. Dung dịch bền trong vòng 1 tuần.
\r\n\r\n
4.3.8 Dung dịch chuẩn hỗn hợp 0,05;\r\n0,10; 0,25; 0,50 và 1,00 µg/ml: hút chính xác 20, 40, 100, 200, 400 µl dung dịch\r\nchuẩn hỗn hợp 25 µg/ml (4.3.7) vào các bình định mức 10 ml (4.1.8). Thêm 6 ml\r\ndung dịch axít oxalic-metanol (4.3.3) vào mỗi bình. Ðịnh mức tới vạch bằng nước\r\ncất (4.2.2).
\r\n\r\n
Chú thích: Bảo quản dung dịch trong\r\ntủ lạnh ở nhiệt độ từ 0 đến 5oC. Dung dịch bền trong vòng 1 tuần.
\r\n\r\n
5 Phương pháp\r\ntiến hành
\r\n\r\n
5.1 Chuẩn bị mẫu thử
\r\n\r\n
5.1.1 Cân 5,00 g (+/- 0,05) mẫu (m)\r\nđã được băm nhuyễn cho vào ống ly tâm thủy tinh (4.1.7) thứ 1. Thêm 20 ml dung\r\ndịch đệm McIlvaine - EDTA (4.3.2) vào ống rồi nghiền trong 30 giây bằng máy\r\nnghiền đồng thể (4.1.3). Sau đó, ly tâm ống bằng máy ly tâm (4.1.5) trong 10\r\nphút ở tốc độ 3 000 vòng/phút.
\r\n\r\n
5.1.2 Gạn dịch trong của ống thứ 1\r\nvào ống ly tâm thủy tinh (4.1.7) thứ 2. Cho thêm 20 ml dung dịch đệm McIlvaine\r\n- EDTA vào ống ly tâm thuỷ tinh thứ 1. Trộn đều, ly tâm ống trong 10 phút ở tốc\r\nđộ 3 000 vòng/phút rồi lại gạn dịch trong vào ống ly tâm thủy tinh thứ 2.
\r\n\r\n
5.1.3 Cho thêm 10 ml dung dịch đệm\r\nMcIlvaine - EDTA vào ống ly tâm thuỷ tinh thứ 1. Trộn đều rồi ly tâm ống trong\r\n10 phút ở tốc độ 3 000 vòng/phút. Tiếp tục gạn dịch trong vào ống ly tâm thủy\r\ntinh thứ 2.
\r\n\r\n
5.1.4 Ly tâm ống thủy tinh thứ 2\r\ntrong 20 phút ở tốc độ 3 000 vòng/phút. Sau đó, lọc dịch trong qua giấy lọc\r\ntrên phễu Buch-ner. Rửa ống ly tâm 2 lần, mỗi lần rửa sử dụng 2 ml dung dịch đệm\r\nMcIlvaine - EDTA.
\r\n\r\n
5.2 Chuẩn bị mẫu trắng
\r\n\r\n
Mẫu trắng được\r\nđịnh nghĩa là mẫu thủy sản đã được xác định không có các kháng sinh thuộc nhóm\r\nTC. Tiến hành chuẩn bị mẫu trắng giống như chuẩn bị với mẫu thử theo qui định tại\r\nÐiều 5.1.
\r\n\r\n
5.3 Chuẩn bị\r\nmẫu để xác định độ thu hồi
\r\n\r\n
Thêm 100 µl\r\ndung dịch chuẩn hỗn hợp 25 µg/ml (4.3.7) vào 5,00 g mẫu trắng. Ðồng nhất mẫu bằng\r\nmáy nghiền đồng thể (4.1.3). Tiến hành chuẩn bị mẫu giống như chuẩn bị với mẫu\r\nthử theo qui định tại Ðiều 5.1.
\r\n\r\n
5.4 Làm sạch\r\ndịch chiết
\r\n\r\n
5.4.1 Chuẩn bị\r\ncột
\r\n\r\n
Nối cột Sep -\r\nPak C18 vào đầu ra của một xi lanh thủy tinh dung tích 100 ml. Thêm lần lượt 20\r\nml metanol (4.2.6), 20 ml nước cất (4.2.2) vào xi lanh thủy tinh. Loại bỏ dung\r\ndịch chảy qua cột.
\r\n\r\n
5.4.2 Làm sạch\r\ndịch chiết
\r\n\r\n
5.4.2.1 Cho lần\r\nlượt các dịch chiết trong ống ly tâm thu được tại các Ðiều 5.1.4, 5.2 và 5.3\r\nvào các cột Sep - Pak đã được chuẩn bị ở Ðiều 5.4.1. Tráng rửa bình chứa bằng\r\n2,0 ml dung dịch đệm McIlvaine - EDTA (4.3.2). Trong giai đoạn này, các kháng\r\nsinh nhóm tetracyclin sẽ được hấp phụ lên bề mặt các hạt rắn chứa trong cột.
\r\n\r\n
Chú thích:\r\nKhông được để cho cột Sep - Pak khô ở giữa hai giai đoạn chuẩn bị cột và làm sạch\r\ndịch chiết. Ðiều chỉnh cho dịch chảy ra khỏi cột từng giọt.
\r\n\r\n
5.4.2.2 Cho\r\n20 ml nước cất (4.2.2) vào xi lanh thủy tinh và cho chảy qua cột. Loại bỏ dịch\r\nchảy ra khỏi cột. Làm khô cột bằng dòng không khí sạch trong 2 phút.
\r\n\r\n
5.4.2.3 Giải\r\nhấp các kháng sinh nhóm tetracyclin bằng cách cho 6,0 ml dung dịch axít\r\noxalic-metanol (4.3.3) chảy qua cột với tốc độ 1,5 ml/phút. Thu dịch ra khỏi cột\r\nvào bình định mức 10 ml. Ðịnh mức tới vạch (thể tích V) bằng nước cất (4.2.2).\r\nTiến hành phân tích dịch thu được trên HPLC theo qui định tại Ðiều 5.5.
\r\n\r\n
5.5 Tiến hành\r\nphân tích trên HPLC
\r\n\r\n
5.5.1 Ðiều kiện\r\nphân tích
\r\n\r\n
a. Cột sắc ký\r\n: Cột pha đảo C8, L x ID : 250 x 4,6 mm, kích thước hạt 5 µm.
\r\n\r\n
b. Nhiệt độ cột:\r\nNhiệt độ trong phòng.
\r\n\r\n
c. Pha động:\r\nHỗn hợp dung dịch axit oxalic-metanol-axetonitrile (4.3.4).
\r\n\r\n
d. Tốc độ\r\ndòng: 1,2 ml/phút.
\r\n\r\n
đ. Bước sóng\r\ncài đặt cho đầu dò UV là 350 nm.
\r\n\r\n
e. Thể tích\r\ntiêm: 60 µl.
\r\n\r\n
5.5.2 ổn định\r\ncột sắc ký trong 30 phút bằng pha động (4.3.4).
\r\n\r\n
5.5.3 Tiêm\r\ncác dung dịch chuẩn (4.3.8) vào máy HPLC theo thứ tự nồng độ từ thấp đến cao. Mỗi\r\ndung dịch tiêm 2 lần, tính chiều cao pic trung bình. Dựng đường chuẩn biểu thị\r\nmối quan hệ giữa các chiều cao pic thu được và nồng độ (µg/ml) từng loại kháng\r\nsinh theo quan hệ tuyến tính bậc 1 (phương trình y = ax + b).
\r\n\r\n
5.5.4 Tiêm\r\ndung dịch mẫu thử, dung dịch mẫu trắng, dung dịch xác định độ thu hồi theo qui\r\nđịnh tại Ðiều 5.4.2.3 vào hệ thống HPLC. Mỗi dung dịch mẫu tiêm 2 lần. Tính giá\r\ntrị trung bình.
\r\n\r\n
Chú thích:\r\nSau khi phân tích xong, làm sạch hệ thống HPLC (bao gồm cả cột sắc ký) bằng hỗn\r\nhợp: nước cất (4.2.2) - metanol (4.2.6) - axetonitrile (4.2.7) theo tỷ lệ về thể\r\ntích là 7-1-2 trong 30 phút.
\r\n\r\n
5.6 Yêu cầu về\r\nđộ tin cậy của phép phân tích
\r\n\r\n
5.6.1 Ðộ lặp\r\nlại của 2 lần tiêm
\r\n\r\n
Ðộ lệch chuẩn\r\n(CVS) tính theo chiều cao pic sắc ký của 2 lần tiêm cùng một dung dịch chuẩn phải\r\nnhỏ hơn 0,5 %.
\r\n\r\n
5.6.2 Ðộ thu\r\nhồi (R)
\r\n\r\n
Ðộ thu hồi được\r\nxác định cho mỗi lần chạy mẫu phải lớn hơn 80 %.
\r\n\r\n
5.6.3 Ðường\r\nchuẩn đối với mỗi kháng sinh phải có độ tuyến tính tốt, hệ số tương quan quy hồi\r\ntuyến tính (R2) phải lớn hơn hoặc bằng 0,995.
\r\n\r\n
5.6.4 Ðối với\r\ncác mẫu chứa ít hơn 0,5 µg/g kháng sinh nhóm TC, phải kiểm tra xác nhận kết quả\r\nbằng cách tiêm lại dịch chiết mẫu và dung dịch chuẩn trên cột C18 (4.1.2.b) chạy\r\ncùng chế độ như cột C8 (4.1.2.a) và so sánh thời gian lưu của píc mẫu và píc\r\nchuẩn.
\r\n\r\n
6 Tính kết quả
\r\n\r\n
Hàm lượng các\r\nkháng sinh có trong mẫu được tính trên cơ sở đường chuẩn thu được (5.5.3). Với\r\nđường chuẩn ở dạng y = ax + b, hàm lượng các kháng sinh có trong mẫu được tính\r\ntheo công thức sau:
\r\n\r\n
\r\n \r\n | \r\n C (µg/kg) = \r\n | \r\n \r\n (Y - b) \r\n | \r\n \r\n x\r\n F x 1 000 \r\n | \r\n
\r\n \r\n | \r\n a \r\n | \r\n
\r\n
\r\n\r\n
Trong đó:
\r\n\r\n
- C là nồng độ các kháng sinh có\r\ntrong mẫu, tính theo µg/kg.
\r\n\r\n
- Y là hiệu số giữa chiều cao pic của\r\ndịch chiết và chiều cao pic có trong mẫu trắng tiêm vào HPLC, tính theo đơn vị\r\nđộ dài.
\r\n\r\n
- a, b là các thông số của đường chuẩn\r\ny = ax + b, được xác định theo Ðiều 5.5.3.
\r\n\r\n
- F là hệ số pha loãng mẫu và có giá\r\ntrị bằng tỉ số giữa thể tích dịch chiết thu được sau khi làm sạch V ( 5.4.2.3)\r\nvà khối lượng mẫu m ( 5.1.1) sử dụng.
\r\n\r\n
\r\n\r\n
\r\n\r\n
